一種應用于腫瘤基因的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種應用于腫瘤基因的檢測方法，包括以下步驟：1）、選定腫瘤基因檢測片段；2）、將步驟1）選定的腫瘤相關基因片段固定在載體上；3）、由樣品中提取總RNA完成標記和逆轉錄；4）、將步驟3）標記的樣品片段與步驟2）的固定在載體上的基因片段雜交；5）、獲得步驟4）雜交結果。采用本發明所述基因檢測方法能夠實現腫瘤疾病的早期診斷，反應結果可用肉眼判斷，可極大地降低分析診斷的成本。
【專利說明】
一種應用于腫瘤基因的檢測方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種基因檢測方法，具體涉及一種應用于腫瘤基因的檢測方法。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤一癌癥是一種常見且嚴重威脅人類生命的疾病。國內外近年的統計資料顯示，腫瘤發病率仍有逐年增加的趨勢。據國家衛生部門統計，九十年代我國腫瘤發病率已上升為0.127%。雖然近年來世界各國在腫瘤疾病研究方面已取得較大的進展，但總體上對腫瘤細胞的病變和轉移以及藥物對腫瘤細胞的作用機理等還不十分清楚，所以到目前為止仍以預防和早期診斷、早期治療為主。因此，本領域迫切需要一種對腫瘤疾病進行早期診斷和研究的方法和工具。
[0003]生物芯片技術是20世紀90年代發展起來的一項高新技術，其高通量、快速、高效地分析生物信息的能力使其在揭示腫瘤發生、發展的規律，在腫瘤早期診斷、個體化治療及預后判定等方面具有其他方法不可比擬的優勢，因而也被視為人類攻克癌癥等惡性疾病的新希望。同時可望使惡性腫瘤的早期診斷、藥物篩選、基因突變確認，以及及時、快速、準確地預測腫瘤的轉移復發等醫學研究領域發生革命性進步，從根本上提高腫瘤診斷和治療水平。
[0004]目前利用生物芯片檢測腫瘤相關基因一般包括以下步驟:
芯片構建-樣品制備-信號檢測和分析。
[0005]目前，利用生物芯片檢測腫瘤相關基因的方法存在以下缺點。
[0006]用于探針標記的放射性物質或熒光物質對人體和環境均具有一定的危害性。標記的模板RNA為mRNA，mRNA的分離純化過程較煩瑣，且mRNA本身在此過程中易被降解。
[0007]探針與芯片的雜交結果需要用昂貴的激光共聚焦掃描儀進行判讀，較高的成本影響了芯片的實際應用。
[0008]基于此，實驗室研發人員研究開發了一種應用于腫瘤基因的檢測方法。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是提供一種應用于腫瘤基因的檢測方法，具有高通量、準確定量、靈活性強、成本低的等特點。
[0010]—種應用于腫瘤基因的檢測方法，包括以下步驟:
1)、選定腫瘤基因檢測片段；
2)、將步驟I)選定的腫瘤相關基因片段固定在載體上；
3)、由樣品中提取總RNA完成標記和逆轉錄；
4)、將步驟3)標記的樣品片段與步驟2)的固定在載體上的基因片段雜交；
5)、獲得步驟4)雜交結果。
[0011]進一步地，為了更好的實現本發明，所述腫瘤相關基因片段是SD01-93。
[0012]進一步地，為了更好的實現本發明，所述逆轉錄時使用的引物是針對腫瘤相關基因特異性片段的寡核苷酸反向引物。
[0013]進一步地，為了更好的實現本發明，所述標記時使用的引物是12-18nt的寡聚胸腺嘧啶引物。
[0014]進一步地，為了更好的實現本發明，所述所使用的引物是PN01-82。
[0015]進一步地，為了更好的實現本發明，所述步驟5)完成雜交后還進行顯色反應。
[0016]本發明與現有技術相比，具有如下的優點和有益效果:
(I)本發明所采用的方法中用一次逆轉錄反應標記多個腫瘤基因探針，并以樣品總RNA作為檢測樣本，可快速檢測樣品中是否有腫瘤基因。
[0017](2)本發明所采用的檢測方法應用到腫瘤基因檢測中可方便有效地檢測樣品中是否存在腫瘤相關基因，實現對腫瘤疾病的早期診斷。
[0018](3)本發明所采用針對腫瘤基因的檢測方法，可通過顯色反應反映出來，且反應結果可用肉眼判斷，極大確認樣品中是否有腫瘤基因的成本。
【具體實施方式】
[0019]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，下面結合實施例，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發明，并不作為對本發明的限定。
[0020]實施本發明檢測方法時首先要制備檢測用芯片。本發明的檢測用芯片可以使用本領域技術人員熟知的常規載體制備，例如玻璃片、尼龍膜、硅片等均可用作本發明檢測用芯片的載體。
[0021]載體上固定的腫瘤相關基因可以是已知的任何腫瘤相關基因，這些腫瘤相關基因可以從諸如Genebank等公共數據庫中獲得。
[0022]在本發明的一個實施方案中，從Genebank等人類基因組公用數據庫中篩選出一系列腫瘤相關基因，以其特異的編碼序列(CDS)為對象，通過計算機輔助搜索，以編碼序列中最后的100個堿基的5’端起，向3’端方向人工合成一段SOnt的堿基序列，用作腫瘤基因檢測芯片的cDNA探針，連同看家基因一起固定在固相載體上，制備成腫瘤基因芯片。選擇最后的100個堿基主要考慮到逆轉錄反應的起始效應，逆轉錄反應的5 ’端向3 ’端延伸時，先合成的cDNA片段即是與固定在膜上的SOnt的堿基序列互補的一段，因此，這樣的選擇有利于后面的雜交步驟。
[0023]在本發明的優選實施方案中，本發明的檢測用芯片上固定有80個腫瘤相關基因和2個看家基因，這些基因及其5 ’端向3 ’端的80個核苷酸序列為現有序列。
將這些cDNA片段固定在固相載體上的方法可以采用本領域技術人員熟知的常規方法。
[0024]在本發明的優選實施方案中，腫瘤基因檢測芯片為多斑點的膜芯片。腫瘤基因點樣為80個，以平行重復點樣，對照基因點樣為2個看家基因。共計167個點。
[0025]實施本發明的檢測方法中的第三個步驟是提取樣品總RNA，逆轉錄并同時進行地高辛或其他等效樣品標記。這里所述的樣品可以是任何生物樣品，包括血液、組織等。由樣品中提取總RNA可以使用本領域技術人員熟知的任何方法。
[0026]在本發明的檢測方法中，對樣品總RNA進行逆轉錄過程中同時完成標記。本發明中可以使用無污染、對人體無害的任何標記方法。在本發明的優選實施方案中使用的是地高辛標記。
[0027]逆轉錄過程中所用的逆轉錄引物為針對上述腫瘤相關基因特異性片段的寡核苷酸反向引物以及12_18nt的寡聚胸腺嘧啶(oligo dT)引物，其中12_18nt的寡核苷酸引物與20nt的反向引物聯合應用。20nt的引物可結合于腫瘤相關基因特異性片段上，從而引發DNA合成反應。12-18nt的寡核苷酸引物-oligo dT可結合于腫瘤相關基因mRNA的polyA+區域，從而引發DNA合成反應。其聯合應用可提高逆轉錄反應的效率。20nt反向引物為編碼序列最后100個堿基的3 ’端起向5 ’端方向的20個堿基的互補序列。
[0028]在本發明的優選實施方案中，使用的針對上述腫瘤相關基因特異性片段的寡核苷酸反向引物為現有序列。
[0029]本發明的檢測方法中的第三個步驟是使標記的樣品總RNA與步驟2)中制備的檢測芯片在適宜條件下雜交并讀出雜交結果。核酸雜交是本領域技術人員熟知的過程，可以使用任何合適的雜交方式。合適的核酸雜交條件取決于芯片所使用的載體和固定的核苷酸片段以及使用的探針。
[0030]雜交完成后通過顯色反應顯示雜交結果。腫瘤基因顯色為不同濃度的斑點，對照基因點亦出現雜交斑點。雜交結果代表腫瘤基因在人體內的復制表達水平，能進行腫瘤發生、發展的診斷和預后。
[0031]雜交結果可以通過用肉眼觀察判斷，或者通過掃描儀檢測并定量。可以通過用肉眼觀察芯片上顯色斑點顏色來判斷腫瘤芯片中基因表達差異。半定量檢測是用掃描儀獲得數字圖像，軟件分析雜交條帶或斑點的相對光密度值。也可通過計算機檢測靶基因和內參照基因光密度比值，通過比值計算可得出腫瘤基因的表達差異。
實施例
[0032]1、腫瘤相關基因檢測芯片的制備 I〕人工合成SD1-93的核苷酸序列；
2)點膜:
將人工合成的探針進行稀釋，調整濃度為0.5微克/微升，用微量移液器轉移到384孔微孔板中，用 VP384.5a 點膜儀(V&P Scientifics Corp.)點膜。
[0033]3〕固定:
將點膜后的濾膜在80度真空環境下，烘烤30分鐘，然后在紫外交聯儀內65毫焦/cm2進行交聯固定，制備成腫瘤基因芯片。
[0034]2、樣品總RNA提取、逆轉錄和標記
I〕常規方法從樣品中提取總RNA ( Chomczynski，P.and Sacchi , N.( 1987)Anal.B1chem.162:156)
2〕逆轉錄和標記
取兩只無菌的200 IPCR管，分別制備溶液A和B。
[0035]A)樣品總 RNA(0.25g/l)41 Oligo dT、基因特異性引物(每種引物2pmol)混合物 31 ddH20(RNase&DNase-free) 31 加熱到72C溫浴2分鐘，然后降溫到42C。
[0036]B)5X First Strand Buffer61 0.lmol/L DTT 31 dNTP混合物 31 Dig-dUTP(lnmol/l) 31 逆轉錄酶Superscript II(200U/1) 11 ddH20(RNase&DNase-free) 41 42C溫浴2分鐘，然后同溶液A混合。
[0037]42C反應2小時。
[0038]3、雜交和顯色雜交:
A)預雜交:
I)將膜芯片裝入雜交袋中，加入1ml雜交液。盡可能將袋內空氣擠壓出來，加熱封口，將其浸入42 °C的水浴中溫育2小時。
[0039 ] 2) 100 °C加熱1分鐘使探針變性，迅速在冰水浴中驟冷。
[0040]3)將雜交袋剪開一角，換1ml預熱的新鮮雜交液，加入探針，盡可能將袋內所有空氣擠壓出去，加熱封口。
[0041 ] 4)將雜交袋浸入42 0C的水浴，雜交過夜。
[0042]5)取出膜芯片并將其置入一個盛有2XSSC和0.1%SDS的托盤內，于室溫洗滌4次，每次5分鐘。
[0043]6)將膜芯片轉移至一個盛有0.2XSSC，0.1 % SDS的平底塑料盒中，洗滌2次，每次30分。
[0044]7)將膜芯片置于一疊紙巾上，以除去大部分液體。
[0045]2、顯色:
1)將膜芯片置入封閉液中封閉30分鐘
2)加入2毫升抗地高辛抗體稀釋液(稀釋度為1:3000)
3)用10毫升的洗滌液洗滌3次，每次15分鐘
4)加入2毫升的檢測緩沖液10分鐘
5)加入I毫升NBT/BCIP底物溶液，平鋪于膜上用塑料紙蓋好，避光，反應時間至陽性參照有清晰的斑點出現為止。
[0046]6)用水沖洗終止反應。
[0047]雜交結果用肉眼檢測或掃描儀檢測及定量。
[0048]顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其他不同形式的變化和變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發明的技術方案所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之列。
【主權項】
1.一種應用于腫瘤基因的檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)、選定腫瘤基因檢測片段； 2)、將步驟I)選定的腫瘤相關基因片段固定在載體上； 3)、由樣品中提取總RNA完成標記和逆轉錄； 4)、將步驟3)標記的樣品片段與步驟2)的固定在載體上的基因片段雜交； 5)、獲得步驟4)雜交結果。2.根據權利要求1的一種應用于腫瘤基因的檢測方法，其特征在于:所述腫瘤相關基因片段是SD01-93。3.根據權利要求2的一種應用于腫瘤基因的檢測方法，其特征在于:所述逆轉錄時使用的引物是針對腫瘤相關基因特異性片段的寡核苷酸反向引物。4.根據權利要求2的一種應用于腫瘤基因的檢測方法，其特征在于:所述標記時使用的引物是12-18nt的寡聚胸腺嘧啶引物。5.根據權利要求3或4的一種應用于腫瘤基因的檢測方法，其特征在于:所述所使用的引物是PNO1-82。6.根據權利要求1的一種應用于腫瘤基因的檢測方法，其特征在于:所述步驟5)完成雜交后還進行顯色反應。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838816SQ201610376189
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月31日
【發明人】黃平, 歐陽小峰, 毛家麗, 涂大連
【申請人】四川金域醫學檢驗中心有限公司