本(ben)(ben)發明(ming)屬(shu)于動物繁(fan)殖技(ji)術(shu)領域，涉及一種(zhong)(zhong)用(yong)(yong)于農(nong)業-畜(chu)牧獸醫(yi)繁(fan)殖的(de)技(ji)術(shu)，具(ju)體(ti)(ti)(ti)涉及一種(zhong)(zhong)提高牛體(ti)(ti)(ti)外受(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)胎(tai)培養(yang)(yang)(yang)效(xiao)率的(de)方法(fa)，更具(ju)體(ti)(ti)(ti)的(de)說(shuo)，本(ben)(ben)發明(ming)涉及牛體(ti)(ti)(ti)外受(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)胎(tai)培養(yang)(yang)(yang)液在(zai)牛體(ti)(ti)(ti)外受(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)胎(tai)培養(yang)(yang)(yang)中的(de)應(ying)用(yong)(yong)。進一步(bu)的(de)，本(ben)(ben)發明(ming)還涉及使用(yong)(yong)該牛體(ti)(ti)(ti)外受(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)胎(tai)培養(yang)(yang)(yang)液進行牛體(ti)(ti)(ti)外受(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)胎(tai)培養(yang)(yang)(yang)的(de)方法(fa)。特別是，本(ben)(ben)發明(ming)牛體(ti)(ti)(ti)外受(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)胎(tai)培養(yang)(yang)(yang)的(de)方法(fa)具(ju)有(you)優異的(de)成本(ben)(ben)優勢。
背景技術：
體外受精(invitrofertilization)或(externalfertilization)是(shi)指哺乳動(dong)物(wu)的精子和(he)卵子在(zai)體外人工(gong)控制的環境(jing)中完成(cheng)受精過程的技(ji)術，英文簡稱為(wei)ivf。由于(yu)它與胚胎移植(zhi)(zhi)技(ji)術(et)密不可分(fen)，又簡稱為(wei)ivf-et。在(zai)生物(wu)學中，把體外受精胚胎移植(zhi)(zhi)到母體后獲得的動(dong)物(wu)稱試管(guan)動(dong)物(wu)(test-tubeanimal)。這項(xiang)技(ji)術成(cheng)功于(yu)20世(shi)紀50年代(dai)，在(zai)最近20年發(fa)展迅速，現已日(ri)趨成(cheng)熟(shu)而(er)成(cheng)為(wei)一項(xiang)重要而(er)常(chang)規的動(dong)物(wu)繁殖(zhi)生物(wu)技(ji)術。
體外受(shou)精(jing)技(ji)(ji)術對動物(wu)生(sheng)(sheng)殖機理研究(jiu)、畜牧(mu)生(sheng)(sheng)產、醫學和(he)瀕危動物(wu)保護等(deng)具有重要(yao)(yao)意(yi)義(yi)。如(ru)用小(xiao)鼠、大鼠或家兔等(deng)作實驗材(cai)料，體外受(shou)精(jing)技(ji)(ji)術可(ke)用于研究(jiu)哺(bu)乳動物(wu)配子發生(sheng)(sheng)、受(shou)精(jing)和(he)胚胎早(zao)期發育機理。在家畜品(pin)種改良(liang)中，體外受(shou)精(jing)技(ji)(ji)術為胚胎生(sheng)(sheng)產提供了廉價而高效的(de)(de)手段(duan)，對充分(fen)(fen)利用優良(liang)品(pin)種資源，縮(suo)短家畜繁殖周期，加快品(pin)種改良(liang)速(su)度等(deng)有重要(yao)(yao)價值。在人(ren)類，ivf-et技(ji)(ji)術是(shi)(shi)治療某些不孕癥(zheng)和(he)克服性(xing)連鎖(suo)病(bing)的(de)(de)重要(yao)(yao)措施(shi)之(zhi)一。體外受(shou)精(jing)技(ji)(ji)術還是(shi)(shi)哺(bu)乳動物(wu)胚胎移植、克隆、轉(zhuan)基因和(he)性(xing)別控制等(deng)現代(dai)生(sheng)(sheng)物(wu)技(ji)(ji)術不可(ke)缺少的(de)(de)組(zu)成部(bu)分(fen)(fen)。
隨著現代(dai)農(nong)業(ye)科技的(de)(de)(de)發(fa)展，為(wei)了更(geng)充分利用(yong)良種母(mu)牛(niu)的(de)(de)(de)繁(fan)殖(zhi)潛力(li)，加速遺傳育種進程，在生產實(shi)踐中應用(yong)高效的(de)(de)(de)繁(fan)殖(zhi)新技術成(cheng)為(wei)必然(ran)。活體采卵(ovumpickup，opu)和體外受精(jing)技術(invitrofertilization，ivf)是(shi)二(er)十(shi)世紀八(ba)十(shi)年代(dai)快(kuai)速發(fa)展起來的(de)(de)(de)胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)工程新技術，二(er)者(zhe)相結(jie)合可獲(huo)得大(da)量(liang)遺傳系譜明確的(de)(de)(de)胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)，從(cong)而(er)縮短世代(dai)間隔。目前，這兩種技術已經成(cheng)為(wei)歐美和大(da)洋(yang)洲等畜牧業(ye)發(fa)達國家的(de)(de)(de)農(nong)場主(zhu)為(wei)擴大(da)良種母(mu)牛(niu)群而(er)采用(yong)的(de)(de)(de)重(zhong)要繁(fan)殖(zhi)技術。然(ran)而(er)，采用(yong)常規的(de)(de)(de)牛(niu)胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培養體系(cr1aa和sof液)，牛(niu)體外受精(jing)的(de)(de)(de)囊胚(pei)(pei)發(fa)育率(lv)較低，而(er)且胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)質量(liang)也遠(yuan)不及體內胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)，導(dao)致(zhi)胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)移植受體后(hou)的(de)(de)(de)妊(ren)娠率(lv)低，因(yin)此如何提(ti)高囊胚(pei)(pei)發(fa)育率(lv)及胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)質量(liang)成(cheng)為(wei)體外受精(jing)胚(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)生產的(de)(de)(de)重(zhong)點(dian)和研(yan)究的(de)(de)(de)焦點(dian)。
早(zao)在1878年，德國(guo)人scnenk就以家兔和(he)豚鼠為材(cai)料(liao)，開始探索哺乳動(dong)物的(de)體(ti)(ti)外(wai)受精(jing)(jing)技(ji)術。但直到1951年，美(mei)籍華人張民(min)覺和(he)austin分別發現精(jing)(jing)子(zi)體(ti)(ti)外(wai)獲能(neng)現象后，體(ti)(ti)外(wai)受精(jing)(jing)技(ji)術才(cai)獲得了突破(po)性進(jin)展。牛體(ti)(ti)外(wai)受精(jing)(jing)技(ji)術受到卵母細胞(bao)的(de)體(ti)(ti)外(wai)成熟(shu)、精(jing)(jing)子(zi)的(de)體(ti)(ti)外(wai)獲能(neng)、受精(jing)(jing)卵的(de)體(ti)(ti)外(wai)培(pei)養環(huan)境等多個方面的(de)影響(xiang)。
胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)是(shi)(shi)ivf技術(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)個(ge)關鍵環節，亦是(shi)(shi)卵(luan)母細(xi)胞體(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)成(cheng)熟(shu)和(he)(he)體(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)受(shou)精(jing)技術(shu)最終效果(guo)(guo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)(ti)現和(he)(he)檢驗。在(zai)體(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)受(shou)精(jing)后(hou)，受(shou)精(jing)卵(luan)在(zai)向囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)發(fa)(fa)(fa)(fa)育(yu)過(guo)程(cheng)(cheng)中將需經歷一(yi)(yi)系列重(zhong)要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)變化(hua)，包(bao)括(kuo)合子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形成(cheng)、第一(yi)(yi)次卵(luan)裂、胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)基因組的(de)(de)(de)(de)(de)(de)激活、致密化(hua)以及(ji)形成(cheng)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)。這一(yi)(yi)過(guo)程(cheng)(cheng)中，外(wai)(wai)(wai)界環境(jing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)變化(hua)會導致基因表達發(fa)(fa)(fa)(fa)生(sheng)改(gai)變，從而影響胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)正常發(fa)(fa)(fa)(fa)育(yu)及(ji)質(zhi)量。目前，哺(bu)(bu)乳(ru)(ru)動(dong)物早期胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)研究(jiu)(jiu)主要集中在(zai)改(gai)善培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)成(cheng)分以滿足不(bu)同發(fa)(fa)(fa)(fa)育(yu)階(jie)段的(de)(de)(de)(de)(de)(de)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)營(ying)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)需求。基于(yu)rosenkrans等(deng)(rosenkrans，c.f.，jr.andn.l.first，effectoffreeaminoacidsandvitaminsoncleavageanddevelopmentalrateofbovinezygotesinvitro.janimsci，1994.72(2):p.434-7)開(kai)發(fa)(fa)(fa)(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)charlesrosenkrans1(cr1)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)和(he)(he)tervit等(deng)(tervit，h.r.，d.g.whittingham，andl.e.rowson,successfulcultureinvitroofsheepandcattleova.jreprodfertil,1972.30(3):p.493-7)開(kai)發(fa)(fa)(fa)(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)合成(cheng)輸卵(luan)管液(ye)(ye)(ye)(syntheticoviductalfluid，sof)，經多年不(bu)斷(duan)改(gai)進(jin)逐步(bu)形成(cheng)了(le)兩種培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)體(ti)(ti)(ti)系。據hakansagirkaya等(deng)(sagirkaya,h.,etal.,developmentalpotentialofbovineoocytesculturedindifferentmaturationandcultureconditions.animreprodsci,2007.101(3-4):p.225-40)和(he)(he)somfai等(deng)(somfai,t.,etal.,developmentofbovineembryosculturedincr1aaandivd101mediausingdifferentoxygentensionsandculturesystems.actavethung,2010.58(4):p.465-74)研究(jiu)(jiu)成(cheng)果(guo)(guo)表明，cr1aa培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)用(yong)于(yu)牛(niu)(niu)(niu)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)有較好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)效果(guo)(guo)，可以廣泛應用(yong)于(yu)牛(niu)(niu)(niu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)；thompson,j.g.等(deng)(thompson,j.g.,etal.,effectofinhibitorsanduncouplersofoxidativephosphorylationduringcompactionandblastulationofbovineembryosculturedinvitro.jreprodfertil,2000.118(1):p.47-55)和(he)(he)jeanm.feugang等(deng)(feugang,j.m.,o.camargo-rodriguez,ande.memili,culturesystemsforbovineembryos.livestockscience,2009.121(2-3):p.141-149)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究(jiu)(jiu)結果(guo)(guo)顯(xian)示，sof培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)也是(shi)(shi)一(yi)(yi)種適(shi)合于(yu)牛(niu)(niu)(niu)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)體(ti)(ti)(ti)系。張(zhang)志平等(deng)(張(zhang)志平,安志興,張(zhang)銹,張(zhang)涌,牛(niu)(niu)(niu)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)體(ti)(ti)(ti)系的(de)(de)(de)(de)(de)(de)優化(hua).西北(bei)農林科(ke)技大學學報,2006.34)和(he)(he)桑國(guo)俊等(deng)(桑國(guo)俊,牛(niu)(niu)(niu)卵(luan)母細(xi)胞及(ji)體(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)胚(pei)(pei)(pei)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)技術(shu)研究(jiu)(jiu).2008)研究(jiu)(jiu)結果(guo)(guo)也顯(xian)示，經過(guo)優化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)cr1aa和(he)(he)sof培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)均(jun)適(shi)合于(yu)牛(niu)(niu)(niu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)，均(jun)取得良好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)(yang)效果(guo)(guo)。哺(bu)(bu)乳(ru)(ru)動(dong)物早期胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)發(fa)(fa)(fa)(fa)育(yu)是(shi)(shi)一(yi)(yi)個(ge)高(gao)度協調(diao)且(qie)精(jing)確調(diao)節的(de)(de)(de)(de)(de)(de)過(guo)程(cheng)(cheng)。在(zai)進(jin)化(hua)過(guo)程(cheng)(cheng)中，配子細(xi)胞逐步(bu)形成(cheng)了(le)一(yi)(yi)系列的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分子級(ji)聯網絡，以保證胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)發(fa)(fa)(fa)(fa)育(yu)周期系統地進(jin)行。在(zai)發(fa)(fa)(fa)(fa)育(yu)過(guo)程(cheng)(cheng)中，胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)內外(wai)(wai)(wai)活性(xing)氧自由(you)基(reactiveoxygenspecies，ros)與(yu)抗氧化(hua)劑(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)平衡對早期胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)發(fa)(fa)(fa)(fa)育(yu)起著決定(ding)性(xing)作用(yong)。
大多(duo)生化反應均產生ros，其(qi)(qi)在細胞內、外均有著重要(yao)的作(zuo)用，一部分ros起著信號分子的作(zuo)用，但是(shi)大多(duo)數ros對機體是(shi)有害的。brooker,r.j.等(deng)(brooker,r.j.,genetics:analysisandprinciples(4thed.).mcgraw-hillscience,2011)報道，ros可以引起細胞dna損傷(shang)、不飽和脂肪(fang)酸(suan)的氧化、蛋白質中(zhong)氨基酸(suan)的氧化甚至可以導致(zhi)某(mou)些(xie)酶的失活。一般來說，ros以四種形(xing)式存在，其(qi)(qi)中(zhong)h2o2氧化作(zuo)用較強(qiang)，是(shi)引起氧化傷(shang)害的最(zui)主要(yao)因素(su)。
大量研究表(biao)明，谷胱甘肽(gsh)是以非蛋白質(zhi)形式(shi)存在的(de)一種抗氧化劑，能(neng)夠清(qing)除多種自(zi)由(you)(you)基(ji)(ji)：超(chao)氧陰離子自(zi)由(you)(you)基(ji)(ji)、羥基(ji)(ji)自(zi)由(you)(you)基(ji)(ji)、過(guo)氧化氫、次氯酸和(he)脂氧自(zi)由(you)(you)基(ji)(ji)，并且(qie)能(neng)夠維(wei)持細胞(bao)內外(wai)氧化還原平(ping)衡。細胞(bao)內外(wai)環境gsh和(he)ros水平(ping)是影響(xiang)受精卵(luan)發育過(guo)程(cheng)中(zhong)的(de)兩個(ge)重要(yao)因(yin)素。早在2000年，dematos等(deng)(dematos,d.g.andc.c.furnus,theimportanceofhavinghighglutathione(gsh)levelafterbovineinvitromaturationonembryodevelopmenteffectofbeta-mercaptoethanol,cysteineandcystine.theriogenology,2000.53(3):p.761-71)曾(ceng)通過(guo)在體外(wai)胚(pei)胎培養(yang)過(guo)程(cheng)中(zhong)添加β-巰基(ji)(ji)乙醇、半胱氨酸和(he)胱氨酸來(lai)提高囊胚(pei)率。
盡管體(ti)外(wai)受精(jing)技術(shu)能成功應(ying)用于(yu)許多(duo)哺乳動物，但由于(yu)體(ti)外(wai)受精(jing)的(de)囊胚率低而(er)導致體(ti)外(wai)受精(jing)胚胎(tai)的(de)生(sheng)產(chan)成本(ben)高、效率低，限制(zhi)了(le)該技術(shu)在(zai)牛(niu)快速(su)擴繁實踐中(zhong)的(de)廣泛應(ying)用。因此(ci)，如何能夠降(jiang)低成本(ben)并提(ti)高牛(niu)ivf胚胎(tai)生(sheng)產(chan)效率和胚胎(tai)質量成為亟待解決的(de)問題。
目前，牛(niu)體(ti)外受(shou)精的(de)(de)技術體(ti)系(xi)中主(zhu)要以(yi)cr1aa和sof液為(wei)胚胎體(ti)外培養液，并在此(ci)基礎上進行改進，囊(nang)(nang)胚發(fa)育率均(jun)(jun)有(you)不同程(cheng)度的(de)(de)提(ti)高，囊(nang)(nang)胚發(fa)育率平均(jun)(jun)為(wei)30％-40％。對(dui)于(yu)囊(nang)(nang)胚質(zhi)量，可以(yi)通過(guo)囊(nang)(nang)胚細(xi)胞(bao)(bao)總(zong)數、icm細(xi)胞(bao)(bao)數/總(zong)細(xi)胞(bao)(bao)數比例(li)、細(xi)胞(bao)(bao)凋亡率來評估。囊(nang)(nang)胚細(xi)胞(bao)(bao)總(zong)數根(gen)據囊(nang)(nang)胚所處階段的(de)(de)不同而不同，s.iwasaki等(iwasaki,s.andt.nakahara,cellnumberandincidenceofchromosomalanomaliesinbovineblastocystsfertilizedinvitrofollowedbycultureinvitroorinvivoinrabbitoviducts.theriogenology,1990.33(3):p.669-75)獲(huo)得的(de)(de)牛(niu)早期囊(nang)(nang)胚總(zong)細(xi)胞(bao)(bao)數平均(jun)(jun)為(wei)44，icm細(xi)胞(bao)(bao)數/囊(nang)(nang)胚總(zong)細(xi)胞(bao)(bao)數比例(li)為(wei)15.8％左右；andrewj.watson等(watson,a.j.,etal.,impactofbovineoocytematurationmediaonoocytetranscriptlevels,blastocystdevelopment,cellnumber,andapoptosis.biolreprod,2000.62(2):p.355-64)統計牛(niu)囊(nang)(nang)胚細(xi)胞(bao)(bao)凋亡率約(yue)為(wei)7.7％-13％。
cn103898046b(中國專利申請號201410073635.4)公開了(le)一種(zhong)專用(yong)于(yu)牛(niu)(niu)體外受(shou)(shou)精(jing)胚(pei)(pei)胎的(de)培(pei)養(yang)(yang)液(ye)，所(suo)述培(pei)養(yang)(yang)液(ye)配(pei)方為：nacl109.5mm、kcl3.1mm、nahco326.2mm、mgcl2·6h2o0.8mm、kh2po31.19mm、丙(bing)(bing)酮酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鈉(na)0.4mm、葡(pu)萄糖1.5mm、半(ban)乳糖酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鈣5mm、10v/v％胎牛(niu)(niu)血清、l-谷(gu)氨(an)(an)(an)(an)酰(xian)胺1mm、2v/v％必(bi)(bi)需氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)、1v/v％非必(bi)(bi)須(xu)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)谷(gu)胱(guang)(guang)甘肽3mm，以水(shui)(shui)配(pei)制；所(suo)述必(bi)(bi)需氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)為以下氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)按(an)比例混合后(hou)配(pei)制的(de)水(shui)(shui)溶液(ye)，其中，各(ge)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)含量(liang)為：l-鹽(yan)(yan)(yan)(yan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)精(jing)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)6.32g/l、l-胱(guang)(guang)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)二鹽(yan)(yan)(yan)(yan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)1.564g/l、l-鹽(yan)(yan)(yan)(yan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)組(zu)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)一水(shui)(shui)物2.1g/l、l-異(yi)亮氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)2.625g/l、l-亮氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)2.62g/l、l-賴氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)(yan)(yan)3.625g/l、l-蛋氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)0.755g/l、l-苯(ben)丙(bing)(bing)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)1.65g/l、l-蘇氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)2.38g/l、l-色氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)0.51g/l、l-酪氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)1.8g/l和(he)l-纈氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)2.34g/l；所(suo)述非必(bi)(bi)須(xu)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)為以下氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)按(an)比例混合后(hou)配(pei)制的(de)水(shui)(shui)溶液(ye)，其中，各(ge)氨(an)(an)(an)(an)基(ji)(ji)(ji)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)含量(liang)為：l-丙(bing)(bing)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)0.89g/l、l-天門冬(dong)酰(xian)胺一水(shui)(shui)物1.5g/l、l-天冬(dong)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)1.33g/l、l-谷(gu)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)1.47g/l、甘氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)0.75g/l、l-脯氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)1.15g/l和(he)l-絲氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)(suan)1.05g/l。將牛(niu)(niu)體外受(shou)(shou)精(jing)胚(pei)(pei)胎置于(yu)上述培(pei)養(yang)(yang)液(ye)中進(jin)行體外培(pei)養(yang)(yang)，據信結果顯示明顯優于(yu)未(wei)添加gsh的(de)對照組(zu)，提高了(le)囊胚(pei)(pei)發育(yu)率及胚(pei)(pei)胎質量(liang)，降低體外生產胚(pei)(pei)胎的(de)成本，為牛(niu)(niu)ivf技(ji)術應(ying)用(yong)于(yu)實踐(jian)提供實驗基(ji)(ji)(ji)礎，可大大加速遺傳(chuan)育(yu)種(zhong)進(jin)程。
其他參考文獻：
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然(ran)而，本(ben)領域仍(reng)然(ran)期(qi)待有性能改(gai)進的牛(niu)(niu)體(ti)外受精胚(pei)胎的培(pei)養(yang)(yang)的方法，例(li)如(ru)仍(reng)然(ran)期(qi)待有提高牛(niu)(niu)體(ti)外受精胚(pei)胎培(pei)養(yang)(yang)效(xiao)率的方法，例(li)如(ru)有具有優(you)異的成本(ben)優(you)勢的牛(niu)(niu)體(ti)外受精胚(pei)胎培(pei)養(yang)(yang)的方法。
技術實現要素：
本(ben)發(fa)(fa)明(ming)的(de)(de)目的(de)(de)在于(yu)提供一(yi)種性能改進的(de)(de)牛(niu)體外(wai)受(shou)精胚(pei)胎(tai)(tai)的(de)(de)培(pei)養(yang)的(de)(de)方法，特別(bie)是期待(dai)提高牛(niu)ivf胚(pei)胎(tai)(tai)生產效率和(he)胚(pei)胎(tai)(tai)質量。更具體的(de)(de)，本(ben)發(fa)(fa)明(ming)為達成上(shang)述目的(de)(de)而(er)需要提供一(yi)種專用(yong)于(yu)牛(niu)體外(wai)受(shou)精胚(pei)胎(tai)(tai)的(de)(de)培(pei)養(yang)液和(he)以(yi)及使用(yong)該培(pei)養(yang)進行牛(niu)體外(wai)受(shou)精胚(pei)胎(tai)(tai)培(pei)養(yang)的(de)(de)方法。本(ben)發(fa)(fa)明(ming)人已經出人意料(liao)的(de)(de)發(fa)(fa)現，使用(yong)本(ben)發(fa)(fa)明(ming)方法呈現優異的(de)(de)技術效果，本(ben)發(fa)(fa)明(ming)因此發(fa)(fa)現而(er)得以(yi)完成。
為(wei)此，本發明(ming)第一方(fang)面提(ti)供了一種牛體外受精胚胎培養(yang)液(ye)，該培養(yang)液(ye)包含：
109-110mm的(de)nacl、
2.9-3.1mm的kcl、
26.0-26.5mm的nahco3、
0.5-1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0-1.3mm的(de)kh2po3、
0.4mm的丙酮(tong)酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
2-3v/v％的胎(tai)牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需(xu)氨(an)基酸、
1v/v％的非必須氨基酸(suan)、
1-10mm的谷胱(guang)甘肽(tai)、和(he)
作為配液溶劑的水。
根據本發明第一(yi)方(fang)面任一(yi)實施(shi)方(fang)案的(de)牛(niu)體外受精(jing)胚(pei)胎培養(yang)(yang)液，該培養(yang)(yang)液包含：
109mm的(de)nacl、
3.1mm的kcl、
26.2mm的nahco3、
0.8mm的mgcl2·6h2o、
1.19mm的kh2po3、
0.4mm的(de)丙酮(tong)酸(suan)鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳糖酸鈣、
2.5v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨(an)酰胺(an)、
2v/v％的必需(xu)氨(an)基酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
根(gen)據本(ben)發明(ming)第一方面任一實施方案的牛(niu)體外受精胚胎培養(yang)液，其(qi)中所述(shu)必需氨基酸是由以下氨基酸按比(bi)例和濃度配制所得的水(shui)溶液：
l-鹽酸(suan)精氨酸(suan)6.32g/l、
l-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/l、
l-鹽酸組氨(an)酸一水物2.1g/l、
l-異亮氨(an)酸2.625g/l、
l-亮氨酸2.62g/l、
l-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/l、
l-蛋氨(an)酸0.755g/l、
l-苯丙氨酸(suan)1.65g/l、
l-蘇(su)氨酸2.38g/l、
l-色氨酸(suan)0.51g/l、
l-酪氨(an)酸1.8g/l、和
l-纈氨酸2.34g/l。
根據本發明(ming)第一方面任一實施方案的(de)牛體外(wai)受(shou)精胚胎培養液(ye)(ye)，其中所述(shu)非必需氨基酸是(shi)由以下氨基酸按(an)比例和濃度配制(zhi)所得的(de)水溶液(ye)(ye)：
l-丙氨酸0.89g/l、
l-天門(men)冬酰胺一水(shui)物1.5g/l、
l-天冬氨酸(suan)1.33g/l、
l-谷氨酸1.47g/l、
甘氨酸0.75g/l、
l-脯(fu)氨(an)酸1.15g/l、和
l-絲氨酸1.05g/l。
根據本發明第一方面(mian)任一實施方案的(de)牛體外(wai)受精(jing)胚(pei)胎培養液(ye)，其(qi)中(zhong)(zhong)所述(shu)培養液(ye)中(zhong)(zhong)谷胱甘肽的(de)濃度為(wei)1～7mm。
根據本發明第一方面任一實(shi)施方案的(de)牛體外(wai)受精胚(pei)胎培養(yang)液，其(qi)中所(suo)述培養(yang)液中谷胱甘肽的(de)濃度(du)為3～5mm。
根(gen)據本發(fa)明第一方面任一實施方案的牛體外受精胚胎(tai)培養(yang)液，其中所述培養(yang)液中谷胱甘肽的濃度(du)為1mm、3mm、5mm或7mm。
根據本發明第(di)一方(fang)面任一實施方(fang)案的牛體外受精胚(pei)胎培養液，其中所述(shu)培養液中谷胱(guang)甘(gan)肽(tai)的濃度為3mm或(huo)5mm。
根據(ju)本發明第一(yi)方面任一(yi)實(shi)施方案的牛體外受(shou)精胚胎(tai)培(pei)養(yang)液，其中所述(shu)培(pei)養(yang)液中谷胱甘肽的濃度(du)為(wei)3mm。
根據本(ben)(ben)(ben)發明第(di)一方(fang)面任一實(shi)施(shi)方(fang)案的(de)(de)牛(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)外(wai)(wai)(wai)受(shou)(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)，其(qi)中還包(bao)含枸櫞(yuan)酸(suan)(suan)鈉(na)和(he)麥(mai)芽糖。在(zai)(zai)一個(ge)實(shi)施(shi)方(fang)案中，所述牛(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)外(wai)(wai)(wai)受(shou)(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)中枸櫞(yuan)酸(suan)(suan)鈉(na)和(he)麥(mai)芽糖的(de)(de)濃(nong)度(du)分別為(wei)0.03～0.05w/v％和(he)0.01～0.03w/v％。在(zai)(zai)一個(ge)實(shi)施(shi)方(fang)案中，所述牛(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)外(wai)(wai)(wai)受(shou)(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)中枸櫞(yuan)酸(suan)(suan)鈉(na)和(he)麥(mai)芽糖的(de)(de)濃(nong)度(du)分別為(wei)0.04w/v％和(he)0.02w/v％。已(yi)經出人(ren)意料的(de)(de)發現，在(zai)(zai)牛(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)外(wai)(wai)(wai)受(shou)(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)中同(tong)時添加(jia)微(wei)量的(de)(de)枸櫞(yuan)酸(suan)(suan)鈉(na)和(he)麥(mai)芽糖時，有(you)助于(yu)(yu)(yu)(yu)提(ti)(ti)高(gao)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)化(hua)率，并且(qie)其(qi)它(ta)(ta)指(zhi)標(biao)不受(shou)(shou)(shou)(shou)影響。囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)化(hua)率是囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)質量的(de)(de)重要評價指(zhi)標(biao)，在(zai)(zai)其(qi)它(ta)(ta)指(zhi)標(biao)不受(shou)(shou)(shou)(shou)影響的(de)(de)前提(ti)(ti)下提(ti)(ti)高(gao)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)化(hua)率，對于(yu)(yu)(yu)(yu)牛(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)外(wai)(wai)(wai)受(shou)(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)工(gong)作(zuo)具有(you)重要意義。另外(wai)(wai)(wai)，還發現，在(zai)(zai)添加(jia)此枸櫞(yuan)酸(suan)(suan)鈉(na)和(he)麥(mai)芽糖的(de)(de)情況下，可以大大減(jian)小(xiao)牛(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)外(wai)(wai)(wai)受(shou)(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)中胎(tai)(tai)(tai)牛(niu)(niu)(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)的(de)(de)濃(nong)度(du)，并且(qie)獲(huo)得(de)基本(ben)(ben)(ben)相同(tong)的(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)效果；由于(yu)(yu)(yu)(yu)牛(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)外(wai)(wai)(wai)受(shou)(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)中胎(tai)(tai)(tai)牛(niu)(niu)(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)相對于(yu)(yu)(yu)(yu)其(qi)中的(de)(de)其(qi)它(ta)(ta)組分(包(bao)括(kuo)枸櫞(yuan)酸(suan)(suan)鈉(na)和(he)麥(mai)芽糖)是極為(wei)昂貴的(de)(de)，牛(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)外(wai)(wai)(wai)受(shou)(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)(ye)的(de)(de)主要成本(ben)(ben)(ben)在(zai)(zai)于(yu)(yu)(yu)(yu)胎(tai)(tai)(tai)牛(niu)(niu)(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)，胎(tai)(tai)(tai)牛(niu)(niu)(niu)(niu)血(xue)(xue)清(qing)的(de)(de)用量減(jian)小(xiao)對于(yu)(yu)(yu)(yu)提(ti)(ti)高(gao)牛(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)外(wai)(wai)(wai)受(shou)(shou)(shou)(shou)精(jing)(jing)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)(tai)(tai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)效率、降低(di)生產成本(ben)(ben)(ben)是極為(wei)有(you)利的(de)(de)。
進(jin)一步的(de)，本發明(ming)第(di)二(er)方面提供了一種以提高(gao)的(de)效率(lv)培養牛體外受精胚胎的(de)方法(fa)，該方法(fa)包括如(ru)下步驟：
將(jiang)牛體外受精胚(pei)胎(tai)置于牛體外受精胚(pei)胎(tai)培養(yang)液中，在38.5℃、0.5％co2、100％濕度條(tiao)件下進行胚(pei)胎(tai)體外培養(yang)。
根(gen)據本發明第(di)二方面任一實施方案(an)的方法，其中胚胎(tai)體(ti)外培養包(bao)括如下步驟：
(1)精卵(luan)(luan)共孵育8h后，取出(chu)卵(luan)(luan)母細胞，使用(yong)1mg/ml的透明質酸酶消化處理3min，然后使用(yong)移液槍反復吹打，直(zhi)至卵(luan)(luan)丘細胞基本脫落(luo)；
(2)使用含10％fbs的tcm199終(zhong)止透明質酸酶(mei)的消化(hua)，用口吸管將疑似受精卵在(zai)添(tian)加有牛(niu)血(xue)清(qing)白蛋白(通常亦縮寫為bsa)的胚胎(tai)前期培養液中洗(xi)3次(ci)后，放入胚胎(tai)前期培養液滴(di)中進行培養，培養條(tiao)件為38.5℃、0.5％co2、100％濕(shi)度(du)；
(3)48h后(hou)，將卵裂至4-8細胞的胚(pei)胎移(yi)至胚(pei)胎后(hou)期培(pei)(pei)養(yang)液(其即為本發明的牛體外受精胚(pei)胎培(pei)(pei)養(yang)液)滴中進行培(pei)(pei)養(yang)(培(pei)(pei)養(yang)條(tiao)件(jian)為38.5℃、0.5％co2、100％濕度(du)(du))，48h后(hou)半(ban)量更換(huan)胚(pei)胎后(hou)期培(pei)(pei)養(yang)液并(bing)繼續(xu)培(pei)(pei)養(yang)(38.5℃，5％co2氣體，95％濕度(du)(du))；
(4)以受精(jing)當天(tian)為0天(tian)開始計時(shi)，至第7天(tian)時(shi)統(tong)計囊胚(pei)率，至第9天(tian)時(shi)統(tong)計囊胚(pei)孵(fu)化率(其為孵(fu)化囊胚(pei)數(shu)除(chu)以囊胚(pei)數(shu)所得百分數(shu))。
根據(ju)本發明第二(er)方(fang)面任一(yi)實(shi)施方(fang)案的方(fang)法(fa)，所述牛體外受精胚胎培(pei)養液中包(bao)含：
109-110mm的nacl、
2.9-3.1mm的kcl、
26.0-26.5mm的(de)nahco3、
0.5-1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0-1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡(pu)萄糖、
5mm的半乳糖(tang)酸鈣、
2-3v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷(gu)氨酰(xian)胺、
2v/v％的必(bi)需氨(an)基(ji)酸、
1v/v％的非必須氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
根據本(ben)發明第二方(fang)(fang)面任一(yi)實施方(fang)(fang)案的方(fang)(fang)法，所述(shu)牛(niu)體(ti)外受精胚胎培養液中包含：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.2mm的nahco3、
0.8mm的mgcl2·6h2o、
1.19mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉(na)、
1.5mm的葡(pu)萄糖、
5mm的(de)半(ban)乳糖酸鈣、
2.5v/v％的胎牛血(xue)清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的(de)必需氨(an)基酸、
1v/v％的(de)非必須氨基酸、
1-10mm的谷胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
根據本發明第二方(fang)(fang)面(mian)任一實施方(fang)(fang)案(an)的(de)(de)方(fang)(fang)法，所(suo)述(shu)牛體外受精胚胎培養液中(zhong)的(de)(de)所(suo)述(shu)必需氨(an)基(ji)(ji)酸是(shi)由(you)以下氨(an)基(ji)(ji)酸按比例和濃度配制(zhi)所(suo)得(de)的(de)(de)水溶液：
l-鹽酸精氨酸6.32g/l、
l-胱(guang)氨(an)酸(suan)二鹽酸(suan)鹽1.564g/l、
l-鹽酸組氨酸一水物(wu)2.1g/l、
l-異亮氨酸2.625g/l、
l-亮氨(an)酸2.62g/l、
l-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/l、
l-蛋氨酸0.755g/l、
l-苯丙氨酸1.65g/l、
l-蘇氨(an)酸2.38g/l、
l-色氨酸0.51g/l、
l-酪氨酸1.8g/l、和
l-纈氨酸2.34g/l。
根據本發明(ming)第二方(fang)面任一實(shi)施方(fang)案的方(fang)法，所(suo)述(shu)(shu)牛體(ti)外受精胚胎培養液中的所(suo)述(shu)(shu)非必需(xu)氨基(ji)(ji)酸是由以下(xia)氨基(ji)(ji)酸按比(bi)例和濃度配(pei)制所(suo)得的水(shui)溶液：
l-丙(bing)氨酸0.89g/l、
l-天(tian)門冬(dong)酰胺一水(shui)物(wu)1.5g/l、
l-天冬氨酸1.33g/l、
l-谷氨酸1.47g/l、
甘(gan)氨酸0.75g/l、
l-脯氨酸(suan)1.15g/l、和
l-絲氨(an)酸1.05g/l。
根據本發明第二方面任一實施方案的方法，其中(zhong)所述培(pei)養液(ye)中(zhong)谷胱(guang)甘肽的濃度為1～7mm。
根據本發明第二方(fang)(fang)面任一實施方(fang)(fang)案的(de)方(fang)(fang)法(fa)，其中(zhong)所述(shu)培養液中(zhong)谷胱(guang)甘肽的(de)濃度(du)為(wei)3～5mm。
根據本發明第二(er)方(fang)(fang)面任一(yi)實施方(fang)(fang)案的方(fang)(fang)法，其中(zhong)(zhong)所述(shu)培(pei)養液中(zhong)(zhong)谷胱甘肽(tai)的濃(nong)度為1mm、3mm、5mm或7mm。
根據本發明第二方(fang)面(mian)任一實(shi)施方(fang)案(an)的方(fang)法，其(qi)中所述培養(yang)液中谷胱甘肽(tai)的濃度為3mm或5mm。
根據本發明第二方面任一實施方案的(de)方法，其中所述(shu)培(pei)養液中谷(gu)胱(guang)甘(gan)肽的(de)濃度為(wei)3mm。
根(gen)據本(ben)發(fa)明第二方(fang)面任一(yi)實(shi)(shi)施方(fang)案的方(fang)法，所(suo)述(shu)牛體外(wai)受精(jing)胚胎(tai)(tai)(tai)培養液中(zhong)還包含枸櫞(yuan)酸鈉(na)和麥(mai)芽(ya)(ya)糖。在(zai)一(yi)個實(shi)(shi)施方(fang)案中(zhong)，所(suo)述(shu)牛體外(wai)受精(jing)胚胎(tai)(tai)(tai)培養液中(zhong)枸櫞(yuan)酸鈉(na)和麥(mai)芽(ya)(ya)糖的濃度(du)分別(bie)為0.03～0.05w/v％和0.01～0.03w/v％。在(zai)一(yi)個實(shi)(shi)施方(fang)案中(zhong)，所(suo)述(shu)牛體外(wai)受精(jing)胚胎(tai)(tai)(tai)培養液中(zhong)枸櫞(yuan)酸鈉(na)和麥(mai)芽(ya)(ya)糖的濃度(du)分別(bie)為0.04w/v％和0.02w/v％。
本(ben)發明(ming)任(ren)一(yi)(yi)(yi)(yi)方(fang)面(mian)或(huo)該任(ren)一(yi)(yi)(yi)(yi)方(fang)面(mian)的(de)任(ren)一(yi)(yi)(yi)(yi)實(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)所具(ju)有的(de)任(ren)一(yi)(yi)(yi)(yi)技術特(te)征同樣(yang)適用其它任(ren)一(yi)(yi)(yi)(yi)實(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)或(huo)其它任(ren)一(yi)(yi)(yi)(yi)方(fang)面(mian)的(de)任(ren)一(yi)(yi)(yi)(yi)實(shi)施(shi)方(fang)案(an)(an)，只(zhi)要它們(men)不(bu)會相互(hu)矛盾(dun)，當然在相互(hu)之間(jian)適用時(shi)，必要的(de)話(hua)可對相應特(te)征作(zuo)適當修(xiu)飾(shi)。下面(mian)對本(ben)發明(ming)的(de)各個方(fang)面(mian)和(he)特(te)點作(zuo)進一(yi)(yi)(yi)(yi)步的(de)描述。
本(ben)(ben)發(fa)明所引述(shu)(shu)(shu)的(de)(de)所有文獻(xian)，它們的(de)(de)全部內容通過引用(yong)并入本(ben)(ben)文，并且如(ru)果這些文獻(xian)所表達的(de)(de)含義(yi)與(yu)(yu)本(ben)(ben)發(fa)明不(bu)(bu)一(yi)致(zhi)(zhi)時，以(yi)本(ben)(ben)發(fa)明的(de)(de)表述(shu)(shu)(shu)為準(zhun)。此(ci)外，本(ben)(ben)發(fa)明使用(yong)的(de)(de)各種術(shu)語(yu)(yu)和短語(yu)(yu)具有本(ben)(ben)領域技術(shu)人員公(gong)(gong)知的(de)(de)一(yi)般(ban)含義(yi)，即(ji)便如(ru)此(ci)，本(ben)(ben)發(fa)明仍(reng)然希望(wang)在此(ci)對這些術(shu)語(yu)(yu)和短語(yu)(yu)作更詳盡的(de)(de)說(shuo)明和解釋，提及的(de)(de)術(shu)語(yu)(yu)和短語(yu)(yu)如(ru)有與(yu)(yu)公(gong)(gong)知含義(yi)不(bu)(bu)一(yi)致(zhi)(zhi)的(de)(de)，以(yi)本(ben)(ben)發(fa)明所表述(shu)(shu)(shu)的(de)(de)含義(yi)為準(zhun)。
本發(fa)(fa)明使(shi)用的(de)(de)胎(tai)牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)可以容易的(de)(de)從市場購得其標(biao)準化商(shang)品(pin)形(xing)式，例如可以從各種代理商(shang)處購得gibco公(gong)司的(de)(de)澳(ao)洲胎(tai)牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(貨(huo)號(hao)：10099141)、新(xin)西蘭胎(tai)牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(貨(huo)號(hao)：10091148)、北美胎(tai)牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(貨(huo)號(hao)：16000044)、墨西哥胎(tai)牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(貨(huo)號(hao)：10437028)等，這些商(shang)品(pin)化胎(tai)牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)的(de)(de)價格500ml大多在8000元以上(shang)，用于本發(fa)(fa)明牛體外受(shou)精胚胎(tai)培養液中(zhong)時胎(tai)牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)是成本主要(yao)貢(gong)獻者。在本發(fa)(fa)明上(shang)下文(wen)的(de)(de)試驗中(zhong)，如未特別說明，所用的(de)(de)胎(tai)牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)是gibco公(gong)司的(de)(de)澳(ao)洲胎(tai)牛血(xue)(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)(qing)(貨(huo)號(hao)：10099141)。
本(ben)發(fa)(fa)明(ming)具有(you)(you)以(yi)下(xia)優(you)點：本(ben)發(fa)(fa)明(ming)通(tong)過在(zai)(zai)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)添加(jia)一定濃(nong)(nong)度(du)的(de)(de)(de)谷胱甘肽(glutathione，gsh)，能顯著提(ti)高體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)(wai)(wai)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)的(de)(de)(de)發(fa)(fa)育能力。同(tong)時對(dui)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)進(jin)行差異染色，區(qu)分(fen)內細(xi)胞(bao)團(innercellmass，icm)、滋養(yang)(yang)(yang)層細(xi)胞(bao)和(he)凋(diao)亡(wang)(wang)細(xi)胞(bao)，比(bi)較總(zong)細(xi)胞(bao)數(shu)(shu)(shu)，并(bing)計算icm細(xi)胞(bao)數(shu)(shu)(shu)/總(zong)細(xi)胞(bao)數(shu)(shu)(shu)比(bi)例(li)和(he)凋(diao)亡(wang)(wang)率，結果(guo)顯示添加(jia)gsh的(de)(de)(de)試(shi)驗組優(you)于對(dui)照組，提(ti)高了囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)發(fa)(fa)育率及(ji)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)質量(liang)，降(jiang)低體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)(wai)(wai)生產(chan)(chan)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)的(de)(de)(de)成(cheng)(cheng)本(ben)，為牛(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)ivf技(ji)術應用于實(shi)踐(jian)提(ti)供實(shi)驗基礎，可大大加(jia)速遺(yi)傳育種進(jin)程。另(ling)外(wai)(wai)(wai)(wai)(wai)，已(yi)經出人意料的(de)(de)(de)發(fa)(fa)現，使用具有(you)(you)本(ben)發(fa)(fa)明(ming)配方的(de)(de)(de)牛(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)(wai)(wai)受(shou)精胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)能夠顯著提(ti)高提(ti)高囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)化(hua)率，并(bing)且(qie)其(qi)它(ta)指(zhi)標不(bu)受(shou)影響，囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)化(hua)率是囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)質量(liang)的(de)(de)(de)重要評(ping)價指(zhi)標，在(zai)(zai)其(qi)它(ta)指(zhi)標不(bu)受(shou)影響的(de)(de)(de)前(qian)提(ti)下(xia)提(ti)高囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)化(hua)率，對(dui)于牛(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)(wai)(wai)受(shou)精胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)工作(zuo)具有(you)(you)重要意義。另(ling)外(wai)(wai)(wai)(wai)(wai)，本(ben)發(fa)(fa)明(ming)還發(fa)(fa)現，在(zai)(zai)添加(jia)此枸櫞(yuan)酸鈉和(he)麥芽糖的(de)(de)(de)情況下(xia)，可以(yi)大大減小牛(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)(wai)(wai)受(shou)精胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)胎(tai)牛(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)血清的(de)(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)，并(bing)且(qie)獲得(de)基本(ben)相(xiang)同(tong)的(de)(de)(de)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)效果(guo)；由于牛(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)(wai)(wai)受(shou)精胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)胎(tai)牛(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)血清相(xiang)對(dui)于其(qi)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)其(qi)它(ta)組分(fen)(包括枸櫞(yuan)酸鈉和(he)麥芽糖)是極為昂貴的(de)(de)(de)，牛(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)(wai)(wai)受(shou)精胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)(ye)的(de)(de)(de)主要成(cheng)(cheng)本(ben)在(zai)(zai)于胎(tai)牛(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)血清，胎(tai)牛(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)血清的(de)(de)(de)用量(liang)減小對(dui)于提(ti)高牛(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)(niu)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)外(wai)(wai)(wai)(wai)(wai)受(shou)精胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)效率、降(jiang)低生產(chan)(chan)成(cheng)(cheng)本(ben)是極為有(you)(you)利的(de)(de)(de)。
具體實施方式
通過下面的(de)(de)實施例可以(yi)對本(ben)(ben)(ben)發(fa)明(ming)進(jin)行(xing)進(jin)一步的(de)(de)描(miao)(miao)述(shu)，然(ran)而(er)，本(ben)(ben)(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)范圍并不(bu)限于下述(shu)實施例。本(ben)(ben)(ben)領域(yu)的(de)(de)專業(ye)人(ren)員能夠理解，在(zai)不(bu)背離本(ben)(ben)(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)精神和范圍的(de)(de)前提下，可以(yi)對本(ben)(ben)(ben)發(fa)明(ming)進(jin)行(xing)各種變化和修飾(shi)。本(ben)(ben)(ben)發(fa)明(ming)對試(shi)驗中所(suo)(suo)使用(yong)(yong)到(dao)的(de)(de)材料(liao)以(yi)及試(shi)驗方(fang)法進(jin)行(xing)一般性和/或具體的(de)(de)描(miao)(miao)述(shu)。雖然(ran)為(wei)實現(xian)本(ben)(ben)(ben)發(fa)明(ming)目的(de)(de)所(suo)(suo)使用(yong)(yong)的(de)(de)許多材料(liao)和操作(zuo)(zuo)方(fang)法是本(ben)(ben)(ben)領域(yu)公知的(de)(de)，但是本(ben)(ben)(ben)發(fa)明(ming)仍(reng)然(ran)在(zai)此(ci)作(zuo)(zuo)盡可能詳細描(miao)(miao)述(shu)。若(ruo)未(wei)特別指明(ming)，實施例中所(suo)(suo)用(yong)(yong)的(de)(de)技(ji)術手(shou)段為(wei)本(ben)(ben)(ben)領域(yu)技(ji)術人(ren)員所(suo)(suo)熟知的(de)(de)常規(gui)手(shou)段，所(suo)(suo)用(yong)(yong)原料(liao)均為(wei)市售商品。
實施例1：牛體外受精胚胎的培養方法
一、試劑
成熟培養液：含0.01iu/ml的fsh、10iu/ml的lh、1μg/ml雌二醇、100ng/ml的(de)igf、50ng/ml的(de)egf、100u/ml青霉素(su)、100μg/ml鏈霉素(su)、10％胎牛血清的(de)tcm-199培養液(ye)。
洗精液：含112.0mm的nacl、4.02mm的kcl、2.25mm的cacl2·2h2o、0.52mm的mgcl2·6h2o、0.83mm的kh2po3、37.0mm的nahco3、1.25mm的丙酮酸(suan)鈉(na)、10μg/ml的肝(gan)素、4mg/ml的牛血清白(bai)蛋(dan)白(bai)(bovineserumalbumin，bsa)、10mm的咖啡因、100u/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素的水溶液。
受精液：含(han)112.0mm的(de)(de)(de)nacl、4.02mm的(de)(de)(de)kcl、2.25mm的(de)(de)(de)cacl2·2h2o、0.52mm的(de)(de)(de)mgcl2·6h2o、0.83mm的(de)(de)(de)kh2po3、37.0mm的(de)(de)(de)nahco3、1.25mm的(de)(de)(de)丙酮酸鈉、10μg/ml的(de)(de)(de)肝素(su)、4mg/ml的(de)(de)(de)bsa、100u/ml的(de)(de)(de)青(qing)霉素(su)、100μg/ml的(de)(de)(de)鏈霉素(su)的(de)(de)(de)水(shui)溶液。
胚胎前期培養液：含109.5mm的(de)(de)nacl、3.1mm的(de)(de)kcl、26.2mm的(de)(de)nahco3、0.8mm的(de)(de)mgcl2·6h2o、1.19mm的(de)(de)kh2po3、0.4mm的(de)(de)丙酮酸鈉(na)、1.5mm的(de)(de)葡萄糖(tang)、5mm的(de)(de)半(ban)乳糖(tang)酸鈣、6mg/ml的(de)(de)bsa、1mm的(de)(de)l-谷氨酰(xian)胺(an)、2v/v％必(bi)需氨基酸、1v/v％非必(bi)須氨基酸的(de)(de)水溶液。
胚胎后期培養液：含109.5mm的(de)nacl、3.1mm的(de)kcl、26.2mm的(de)nahco3、0.8mm的(de)mgcl2·6h2o、1.19mm的(de)kh2po3、0.4mm的(de)丙(bing)酮酸鈉、1.5mm的(de)葡萄糖、5mm的(de)半乳糖酸鈣(gai)、10v/v％胎牛(niu)血(xue)清(fetalbovineserum，fbs)、1mm的(de)l-谷氨酰胺、2v/v％必需(xu)氨基(ji)酸、1v/v％非必須氨基(ji)酸的(de)水溶液。
所(suo)述必需氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)為(wei)(wei)以下氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)按比例/濃度配制(zhi)的水(shui)溶液，其中，各氨(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)含(han)量為(wei)(wei)：l-鹽(yan)酸(suan)(suan)(suan)精氨(an)酸(suan)(suan)(suan)6.32g/l、l-胱氨(an)酸(suan)(suan)(suan)二鹽(yan)酸(suan)(suan)(suan)鹽(yan)1.564g/l、l-鹽(yan)酸(suan)(suan)(suan)組氨(an)酸(suan)(suan)(suan)一水(shui)物(wu)2.1g/l、l-異亮氨(an)酸(suan)(suan)(suan)2.625g/l、l-亮氨(an)酸(suan)(suan)(suan)2.62g/l、l-賴氨(an)酸(suan)(suan)(suan)鹽(yan)酸(suan)(suan)(suan)鹽(yan)3.625g/l、l-蛋氨(an)酸(suan)(suan)(suan)0.755g/l、l-苯丙氨(an)酸(suan)(suan)(suan)1.65g/l、l-蘇氨(an)酸(suan)(suan)(suan)2.38g/l、l-色氨(an)酸(suan)(suan)(suan)0.51g/l、l-酪氨(an)酸(suan)(suan)(suan)1.8g/l和l-纈氨(an)酸(suan)(suan)(suan)2.34g/l。
所(suo)述非必(bi)須氨(an)(an)(an)基酸(suan)(suan)為以下(xia)氨(an)(an)(an)基酸(suan)(suan)按比例/濃度配制的水溶(rong)液，其(qi)中(zhong)，各氨(an)(an)(an)基酸(suan)(suan)含量為：l-丙氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)0.89g/l、l-天門冬酰胺一水物1.5g/l、l-天冬氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)1.33g/l、l-谷(gu)氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)1.47g/l、甘氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)0.75g/l、l-脯氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)1.15g/l和(he)l-絲氨(an)(an)(an)酸(suan)(suan)1.05g/l。
二、卵母細胞的采集和體外成熟
1.從屠宰場(chang)采集牛卵巢，置(zhi)于37℃生理鹽水(shui)中，3h內送至實驗(yan)室。
2.使用含有青霉素和鏈霉素的溫熱的生理鹽水(shui)將卵(luan)巢清洗3-5次。
3.使用真空蠕動(dong)泵，用18號針頭抽取5-8毫米(mi)卵泡中(zhong)的卵泡液。
4.體(ti)視顯微鏡下挑選卵(luan)(luan)母(mu)細胞-卵(luan)(luan)丘細胞復合(he)體(ti)(cocs)，在洗卵(luan)(luan)液(ye)中將cocs洗滌兩次，在成(cheng)熟培養(yang)液(ye)中洗滌一次。
5.將(jiang)洗(xi)干凈的cocs放入含有成熟培養液并覆蓋(gai)礦(kuang)物油的四孔(kong)板(ban)中，每孔(kong)培養50枚cocs，培養22-24h。
三、體外受精
1.將cocs從(cong)成熟培(pei)養(yang)液中移(yi)入50μl受精滴中，每滴放(fang)15枚(mei)cocs。
2.38℃水浴解凍精液，使用5ml洗精液在500g條件下離心5min；棄上清，再加入5ml洗精液離心5min，棄上清，使用洗精液調整精子濃度，使精子濃度約為2×107個/ml。
3.取50μl精(jing)液，與含(han)有(you)cocs的(de)受精(jing)滴(di)混合成(cheng)為(wei)100μl的(de)液滴(di)。
4.38.5℃，5％co2氣體，95％濕度條(tiao)件下精卵共孵育8h。
四、胚胎體外培養
1.精卵(luan)(luan)共(gong)孵育8h后，取出卵(luan)(luan)母細胞(bao)(bao)，使用1mg/ml的透明質酸(suan)酶消化處理(li)3min，然后使用移液槍(qiang)反復(fu)吹打(da)，直至卵(luan)(luan)丘細胞(bao)(bao)基本脫落(luo)。
2.使用含10％fbs的tcm199終止透(tou)明質酸酶的消化(hua)，用口(kou)吸管將疑似受精卵在添加(jia)有牛血(xue)清白蛋白的胚(pei)胎前(qian)期(qi)培養液中洗(xi)3次后，放入(ru)胚(pei)胎前(qian)期(qi)培養液滴中進(jin)行培養(38.5℃，5％co2氣體，95％濕度)。
3.48h后，將卵裂至4-8細胞(bao)的胚(pei)胎(tai)移(yi)至胚(pei)胎(tai)后期(qi)(qi)培(pei)養(yang)(yang)液滴中進(jin)行培(pei)養(yang)(yang)(38.5℃，5％co2氣(qi)體，95％濕度)，48h后半(ban)量更換胚(pei)胎(tai)后期(qi)(qi)培(pei)養(yang)(yang)液并繼(ji)續培(pei)養(yang)(yang)(38.5℃，5％co2氣(qi)體，95％濕度)。
4.以(yi)受精當天為(wei)0天開始(shi)計(ji)時(shi)，至(zhi)第7天時(shi)統(tong)計(ji)囊胚率，至(zhi)第9天時(shi)統(tong)計(ji)囊胚孵化率(其為(wei)孵化囊胚數(shu)(shu)除(chu)以(yi)囊胚數(shu)(shu)所(suo)得(de)百分數(shu)(shu))。
五、胚胎后期培養液中gsh(谷胱甘肽)最適添加濃度篩選
1.配制(zhi)0.5m的gsh作(zuo)為儲液(ye)。
2.使(shi)用gsh儲液(ye)(ye)，按(an)照終(zhong)濃度為1mm、3mm、5mm、7mm梯度向胚胎后期培養液(ye)(ye)中添加(jia)配制(zhi)為胚胎后期培養液(ye)(ye)的試驗組，以非(fei)添加(jia)組為對照。
3.分(fen)別(bie)于培養的第(di)(di)48h、第(di)(di)5天、第(di)(di)7天，統(tong)計各(ge)個組的卵(luan)裂卵(luan)與8細胞率、桑椹(shen)胚率和囊胚率。
六、胚胎差異染色
1.選取體外(wai)培(pei)養第7天的(de)囊(nang)胚，使用(yong)2％多聚甲醛固定20min。
2.使用含0.5％bsa的磷酸鹽緩沖液(ye)(ye)(pbs-bsa)洗兩次(ci)，放入透化液(ye)(ye)(50μltriton、5μl吐溫80和9.945mlpbs)中，室溫放置30min。
3.使用(yong)2m鹽酸(suan)室(shi)溫(wen)處理(li)20min，然后使用(yong)100mm的tris-hcl室(shi)溫(wen)處理(li)10min，使cdx2蛋白能夠與一抗(kang)結合。
4.使用pbs-bsa清洗三次，將囊(nang)胚放入封閉(bi)液(1ml山(shan)羊血(xue)清、5μl吐溫80和(he)8.995mlpbs)中，室(shi)溫封閉(bi)1h，然后(hou)轉入4℃冰箱封閉(bi)過(guo)夜(ye)。
5.棄去(qu)(qu)封(feng)閉液(ye)，cdx2一抗(kang)用封(feng)閉液(ye)按1:200稀釋，室溫(wen)孵育2h，棄去(qu)(qu)一抗(kang)稀釋液(ye)，用pbs-bsa清(qing)洗3次，每次5min。
6.caspase-3一抗(購自cellsignalingtechnology公司)用(yong)封閉液(ye)按(an)1:200稀釋，室溫孵育2h，棄去一抗稀釋液(ye)，用(yong)pbs-bsa清洗3次(ci)(ci)，每次(ci)(ci)5min。
7.在避光(guang)條件下用封(feng)閉(bi)液(ye)按(an)1:200稀釋cdx2特異性二(er)抗(kang)(購自(zi)sigma公司)，室溫(wen)下避光(guang)放置1h。避光(guang)條件下棄去二(er)抗(kang)稀釋液(ye)，用pbs清洗3次(ci)，每(mei)次(ci)5min。
8.在(zai)避(bi)光(guang)條(tiao)件(jian)下用封(feng)閉(bi)液按1:200稀(xi)釋caspase-3特異性二(er)抗(購自lifetechnologies公司)，室溫下避(bi)光(guang)放置1h。避(bi)光(guang)條(tiao)件(jian)下棄去二(er)抗稀(xi)釋液，用pbs清洗3次，每(mei)次5min。
9.加入10μg/ml的hochest33342染液染細胞核，室溫作用5min，在熒(ying)光顯(xian)微鏡下觀察并拍照。
10.實(shi)驗重復三次，每次隨機選取(qu)10個囊胚，計算凋亡率、icm細胞(bao)數/總細胞(bao)數來(lai)評估囊胚質量。
七、數據統計
實驗數據采(cai)用統計軟件sasv8中的anova程序(xu)進行分析，duncan’smultiple-range檢驗方(fang)法(fa)判定處(chu)理間的差異(yi)顯著(zhu)性，當p<0.05時認(ren)為差異(yi)顯著(zhu)。
八、胚胎后期培養液中添加gsh可顯著提高牛體外受精囊胚的發育率
選擇gsh添加(jia)濃(nong)度為0、1、3、5、7mm進行篩(shai)選，通過統計卵(luan)裂(lie)率(即，卵(luan)裂(lie)率＝受精卵(luan)裂(lie)數(shu)/受精卵(luan)數(shu))、4-8細(xi)胞率、桑椹(shen)胚(pei)率、囊胚(pei)率(即，囊胚(pei)率＝囊胚(pei)數(shu)/卵(luan)裂(lie)胚(pei)胎(tai)數(shu))。
結果：
胚胎后期培養液(ye)中gsh添(tian)加(jia)濃度(du)為0、1、3、5、7mm的(de)五(wu)組(zu)間的(de)卵裂率(lv)和4-8細(xi)胞率(lv)均(jun)差異不顯(xian)著(p>0.05)，例如五(wu)組(zu)卵裂率(lv)均(jun)在(zai)0.80～0.88范圍(wei)內(nei)，五(wu)組(zu)4-8細(xi)胞率(lv)均(jun)在(zai)0.67～0.79范圍(wei)內(nei)；
對桑葚胚(pei)發育率(lv)(即桑椹胚(pei)率(lv)，桑葚胚(pei)率(lv)＝桑葚胚(pei)胎數/卵裂(lie)胚(pei)胎數)，3mm和5mm的gsh添加(jia)組(zu)均顯著高(gao)于對照組(zu)和5mm、7mm實驗組(zu)(p<0.05)，但(dan)3mm和5mm這(zhe)兩組(zu)間差(cha)異不顯著(p>0.05)，例如對照組(zu)和5mm、7mm這(zhe)三組(zu)的桑椹胚(pei)率(lv)在0.46～0.49范(fan)圍內，而3mm和5mm這(zhe)兩組(zu)的桑椹胚(pei)率(lv)在0.61～0.63范(fan)圍內；
對(dui)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)率(lv)而言，1mm、3mm和5mm的(de)(de)gsh添(tian)加(jia)(jia)組(zu)(zu)均(jun)顯(xian)著高于對(dui)照(zhao)組(zu)(zu)(p<0.05)，而7mm的(de)(de)gsh添(tian)加(jia)(jia)組(zu)(zu)與(yu)對(dui)照(zhao)組(zu)(zu)間差(cha)異不(bu)顯(xian)著(p>0.05)，例如對(dui)照(zhao)組(zu)(zu)和7mm組(zu)(zu)的(de)(de)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)率(lv)分別(bie)為0.32和0.36，1mm組(zu)(zu)的(de)(de)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)率(lv)為0.42，3mm和5mm組(zu)(zu)的(de)(de)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)率(lv)在(zai)0.46～0.51范圍內；這些結(jie)果(guo)(guo)與(yu)cn103898046a表1結(jie)果(guo)(guo)基本一致(zhi)。可見(jian)在(zai)胚(pei)(pei)(pei)胎后期培養(yang)液中(zhong)添(tian)加(jia)(jia)gsh均(jun)可提高牛(niu)ivf胚(pei)(pei)(pei)胎的(de)(de)體外發(fa)育率(lv)。
九、胚胎后期培養液中添加gsh可提高牛體外受精胚胎的質量
通過統計總細(xi)胞(bao)數(shu)、icm細(xi)胞(bao)數(shu)/總細(xi)胞(bao)數(shu)、凋亡率(即(ji)，凋亡率＝凋亡細(xi)胞(bao)數(shu)/總細(xi)胞(bao)數(shu))，比較(jiao)分析了gsh不同(tong)添加濃度組獲得的囊胚質量。結果如下：
對(dui)于(yu)總(zong)細胞數(shu)，1mm、3mm、5mm、7mm四個gsh濃(nong)度添加組(zu)(zu)(zu)均(jun)(jun)顯(xian)著高于(yu)對(dui)照組(zu)(zu)(zu)(p<0.05)，且3mm、5mm和7mm組(zu)(zu)(zu)均(jun)(jun)顯(xian)著高于(yu)1mm組(zu)(zu)(zu)(p<0.05)，例如0mm組(zu)(zu)(zu)總(zong)細胞數(shu)為(wei)42.4，1mm組(zu)(zu)(zu)總(zong)細胞數(shu)為(wei)63.6，3mm、5mm和7mm組(zu)(zu)(zu)總(zong)細胞數(shu)均(jun)(jun)在82～89范圍內；
對于icm細(xi)(xi)胞數(shu)(shu)/總(zong)細(xi)(xi)胞數(shu)(shu)的(de)比(bi)率，1mm添(tian)加組(zu)(zu)與(yu)(yu)對照組(zu)(zu)差異(yi)不顯著(p>0.05)，3mm、5mm和7mm組(zu)(zu)均顯著低于對照組(zu)(zu)(p<0.05)，但這三組(zu)(zu)之間差異(yi)不顯著(p>0.05)，例如1mm添(tian)加組(zu)(zu)與(yu)(yu)對照組(zu)(zu)的(de)icm細(xi)(xi)胞數(shu)(shu)/總(zong)細(xi)(xi)胞數(shu)(shu)比(bi)均在0.41～0.48范圍(wei)內，3mm、5mm和7mm組(zu)(zu)的(de)icm細(xi)(xi)胞數(shu)(shu)/總(zong)細(xi)(xi)胞數(shu)(shu)比(bi)均在0.41～0.48范圍(wei)內0.27～0.34范圍(wei)內；
對于(yu)(yu)凋亡(wang)率，四個添(tian)(tian)(tian)加組(zu)與對照組(zu)之(zhi)間(jian)差異不顯著(zhu)(p>0.05)，1mm、3mm、7mm的gsh添(tian)(tian)(tian)加組(zu)和(he)對照組(zu)的凋亡(wang)率均顯著(zhu)低于(yu)(yu)5mm添(tian)(tian)(tian)加組(zu)(p<0.05)；這些(xie)結(jie)果與cn103898046a表2結(jie)果基(ji)本一致。可(ke)見(jian)gsh的添(tian)(tian)(tian)加有助于(yu)(yu)提高牛體外受精(jing)胚胎(tai)的質量。
十、胚胎后期培養液中添加gsh的最適添加濃度為3mm
在四(si)個實驗組(zu)中，3mm和(he)5mm的(de)gsh添(tian)(tian)加(jia)組(zu)獲得(de)的(de)桑(sang)葚(shen)胚率和(he)囊(nang)(nang)胚率均顯(xian)著高于對照(zhao)組(zu)和(he)其它實驗組(zu)(p<0.05)；但(dan)3mm的(de)gsh添(tian)(tian)加(jia)組(zu)的(de)桑(sang)葚(shen)胚率與(yu)5mm的(de)gsh添(tian)(tian)加(jia)組(zu)間差異(yi)不(bu)顯(xian)著(p>0.05)，但(dan)囊(nang)(nang)胚率卻顯(xian)著高于5mm添(tian)(tian)加(jia)組(zu)(p<0.05)，可見(jian)3mm的(de)gsh添(tian)(tian)加(jia)組(zu)中的(de)牛ivf胚胎的(de)發育率是(shi)最(zui)高的(de)，因此(ci)gsh的(de)最(zui)適濃(nong)度為3mm的(de)gsh添(tian)(tian)加(jia)組(zu)。
本(ben)實施例篩選出了(le)最適(shi)添加濃度，極大地提高(gao)了(le)囊(nang)胚(pei)(pei)生產效率，囊(nang)胚(pei)(pei)率由30％提高(gao)至50％；對(dui)胚(pei)(pei)胎(tai)質量進行評估也顯示，添加本(ben)產品后囊(nang)胚(pei)(pei)質量也優于對(dui)照(zhao)組。
實施例2：牛體外受精胚胎的培養方法
參照實施例1，不同的僅是其中的胚胎后期培養液(ye)組(zu)成改為：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.0mm的nahco3、
0.5mm的mgcl2·6h2o、
1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸(suan)鈉、
1.5mm的葡萄(tao)糖(tang)、
5mm的半乳(ru)糖酸鈣(gai)、
10v/v％的(de)胎牛血清、
1mm的(de)l-谷氨酰胺、
2v/v％的(de)必需氨基酸(suan)、
1v/v％的非必須氨基酸、
3mm的谷(gu)胱甘肽、和
作為配液溶劑的水。
照實(shi)施例1進行試驗(yan)，結果各項指標(biao)均與實(shi)施例1中使用(yong)3mm的谷胱甘肽(tai)組基本(ben)(ben)相同(tong)，例如(ru)本(ben)(ben)實(shi)施例中桑(sang)葚(shen)胚率為0.633、囊胚率為0.508、凋亡率0.050。
實施例3：牛體外受精胚胎的培養方法
參照實施例(li)1，不同的僅是其中的胚胎后(hou)期培養液組成改為：
110mm的nacl、
2.9mm的kcl、
26.5mm的nahco3、
1.0mm的mgcl2·6h2o、
1.0mm的kh2po3、
0.4mm的(de)丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖、
5mm的半乳(ru)糖酸(suan)鈣、
10v/v％的胎牛血清(qing)、
1mm的(de)l-谷氨(an)酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的(de)非必須氨(an)基酸、
3mm的(de)谷(gu)胱(guang)甘肽、和(he)
作為配液溶劑的水。
照實(shi)施(shi)例1進(jin)行(xing)試驗，結果各項指標均與實(shi)施(shi)例1中使用3mm的谷胱甘肽組基本相(xiang)同，例如本實(shi)施(shi)例中桑葚胚(pei)率(lv)為0.636、囊(nang)胚(pei)率(lv)為0.521、凋(diao)亡率(lv)0.050。
實施例4：牛體外受精胚胎的培養方法
參照(zhao)實(shi)施例(li)1，不同(tong)的僅是其中的胚胎后期培養(yang)液組(zu)成(cheng)改(gai)為(wei)：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.0mm的nahco3、
0.5mm的mgcl2·6h2o、
1.3mm的(de)kh2po3、
0.4mm的(de)丙酮酸鈉、
1.5mm的葡(pu)萄糖、
5mm的(de)半(ban)乳糖酸鈣、
10v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨酰胺、
2v/v％的必需氨基酸、
1v/v％的非必(bi)須氨基(ji)酸、
3mm的谷胱甘肽、
枸櫞酸鈉0.04w/v％、
麥芽(ya)糖(tang)0.02w/v％、和
作為配液溶劑的水。
結(jie)果顯(xian)(xian)示，在(zai)實(shi)施(shi)(shi)例(li)1考(kao)察的(de)各(ge)項指標(biao)方面，本(ben)(ben)實(shi)施(shi)(shi)例(li)4均與(yu)實(shi)施(shi)(shi)例(li)1中(zhong)使(shi)用3mm的(de)谷胱甘肽組基本(ben)(ben)相同，例(li)如本(ben)(ben)實(shi)施(shi)(shi)例(li)4中(zhong)桑葚(shen)胚率(lv)(lv)為0.634、囊(nang)(nang)(nang)(nang)胚率(lv)(lv)為0.518、凋(diao)亡率(lv)(lv)0.049；另外，在(zai)第9天時統(tong)計囊(nang)(nang)(nang)(nang)胚孵化(hua)率(lv)(lv)，結(jie)果顯(xian)(xian)示本(ben)(ben)實(shi)施(shi)(shi)例(li)囊(nang)(nang)(nang)(nang)胚孵化(hua)率(lv)(lv)達71.6％；另外的(de)統(tong)計發現，實(shi)施(shi)(shi)例(li)1～3全部使(shi)用3mm谷胱甘肽的(de)試驗中(zhong)囊(nang)(nang)(nang)(nang)胚孵化(hua)率(lv)(lv)均在(zai)36～39％范圍內。
在(zai)一個(ge)(ge)補充(chong)的(de)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)中(zhong)，參照上述(shu)實(shi)施(shi)(shi)例4，不(bu)(bu)同的(de)僅(jin)(jin)是枸(gou)(gou)櫞(yuan)(yuan)酸(suan)鈉(na)(na)濃(nong)度(du)改為0.03w/v％或0.05w/v％(但麥芽(ya)糖仍(reng)為0.02w/v％)，兩(liang)個(ge)(ge)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)中(zhong)各(ge)項(xiang)指(zhi)(zhi)標(biao)均(jun)(jun)與上述(shu)實(shi)施(shi)(shi)例4基(ji)本(ben)(ben)相同，例如囊(nang)胚孵(fu)(fu)(fu)化(hua)率(lv)達(da)70.2～71.4％范(fan)圍。在(zai)一個(ge)(ge)補充(chong)的(de)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)中(zhong)，參照上述(shu)實(shi)施(shi)(shi)例4，不(bu)(bu)同的(de)僅(jin)(jin)是麥芽(ya)糖濃(nong)度(du)改為0.01w/v％或0.03w/v％(但枸(gou)(gou)櫞(yuan)(yuan)酸(suan)鈉(na)(na)仍(reng)為0.04w/v％)，兩(liang)個(ge)(ge)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)中(zhong)各(ge)項(xiang)指(zhi)(zhi)標(biao)均(jun)(jun)與上述(shu)實(shi)施(shi)(shi)例4基(ji)本(ben)(ben)相同，例如囊(nang)胚孵(fu)(fu)(fu)化(hua)率(lv)達(da)71.6～72.6％范(fan)圍內(nei)；這(zhe)一結(jie)果表(biao)明(ming)，在(zai)胚胎后期培養液(ye)中(zhong)補充(chong)添(tian)加適量枸(gou)(gou)櫞(yuan)(yuan)酸(suan)鈉(na)(na)和(he)麥芽(ya)糖后能(neng)夠有(you)效地提(ti)高囊(nang)胚孵(fu)(fu)(fu)化(hua)率(lv)。在(zai)一個(ge)(ge)補充(chong)的(de)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)中(zhong)，參照上述(shu)實(shi)施(shi)(shi)例4，不(bu)(bu)同的(de)僅(jin)(jin)是不(bu)(bu)添(tian)加枸(gou)(gou)櫞(yuan)(yuan)酸(suan)鈉(na)(na)(但麥芽(ya)糖仍(reng)為0.02w/v％)，或者不(bu)(bu)同的(de)僅(jin)(jin)是不(bu)(bu)添(tian)加麥芽(ya)糖(但枸(gou)(gou)櫞(yuan)(yuan)酸(suan)鈉(na)(na)仍(reng)為0.04w/v％)，兩(liang)個(ge)(ge)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)中(zhong)除了囊(nang)胚孵(fu)(fu)(fu)化(hua)率(lv)以(yi)外的(de)各(ge)項(xiang)指(zhi)(zhi)標(biao)均(jun)(jun)與上述(shu)實(shi)施(shi)(shi)例4基(ji)本(ben)(ben)相同，但是囊(nang)胚孵(fu)(fu)(fu)化(hua)率(lv)顯(xian)著的(de)小(xiao)，均(jun)(jun)在(zai)38～40％范(fan)圍內(nei)(p<0.05，具有(you)顯(xian)著性差異)；這(zhe)一結(jie)果表(biao)明(ming)，僅(jin)(jin)添(tian)加枸(gou)(gou)櫞(yuan)(yuan)酸(suan)鈉(na)(na)和(he)麥芽(ya)糖二(er)者之一時不(bu)(bu)能(neng)有(you)效提(ti)高囊(nang)胚孵(fu)(fu)(fu)化(hua)率(lv)。
實施例5：牛體外受精胚胎的培養方法
參照實施例1，不同(tong)的(de)僅是其中的(de)胚胎后期(qi)培(pei)養液組成改(gai)為：
109mm的nacl、
3.1mm的kcl、
26.0mm的nahco3、
0.5mm的(de)mgcl2·6h2o、
1.3mm的kh2po3、
0.4mm的丙酮酸鈉、
1.5mm的葡萄糖(tang)、
5mm的半乳糖酸鈣、
2.5v/v％的胎牛血清、
1mm的l-谷氨(an)酰(xian)胺、
2v/v％的(de)必(bi)需(xu)氨基酸、
1v/v％的(de)非(fei)必須氨(an)基酸、
3mm的谷胱甘肽、
枸櫞酸鈉0.04w/v％、
麥芽糖0.02w/v％、和
作為配液溶劑的水。
結果顯示(shi)，在實(shi)(shi)施(shi)例(li)1考察的(de)各項指標方(fang)面，本(ben)實(shi)(shi)施(shi)例(li)5均(jun)與實(shi)(shi)施(shi)例(li)1中使用3mm的(de)谷(gu)胱(guang)甘(gan)肽組(zu)基本(ben)相同，例(li)如本(ben)實(shi)(shi)施(shi)例(li)5中桑葚胚(pei)率(lv)(lv)為0.628、囊(nang)(nang)胚(pei)率(lv)(lv)為0.522、凋亡率(lv)(lv)0.048；另外，在第9天時統計囊(nang)(nang)胚(pei)孵化率(lv)(lv)，結果顯示(shi)本(ben)實(shi)(shi)施(shi)例(li)囊(nang)(nang)胚(pei)孵化率(lv)(lv)達70.2％；另外的(de)統計發現，實(shi)(shi)施(shi)例(li)1～3全(quan)部(bu)使用3mm谷(gu)胱(guang)甘(gan)肽的(de)試驗中囊(nang)(nang)胚(pei)孵化率(lv)(lv)均(jun)在36～39％范圍(wei)內。
在(zai)(zai)一(yi)(yi)個(ge)(ge)補充的(de)(de)(de)(de)(de)(de)試(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)，參(can)(can)照(zhao)(zhao)(zhao)上(shang)述(shu)(shu)(shu)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)5，不(bu)(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)僅(jin)是(shi)(shi)(shi)枸(gou)櫞(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)酸鈉(na)(na)(na)濃度(du)(du)改(gai)為(wei)0.03w/v％或(huo)0.05w/v％(但(dan)麥(mai)(mai)(mai)芽(ya)(ya)糖(tang)(tang)(tang)(tang)仍(reng)為(wei)0.02w/v％)，兩個(ge)(ge)試(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)項(xiang)指標(biao)(biao)均與(yu)(yu)(yu)上(shang)述(shu)(shu)(shu)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)5基本相同(tong)(tong)(tong)，例(li)(li)(li)如囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)(fu)化(hua)率(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)達(da)69.7～71.8％范(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)。在(zai)(zai)一(yi)(yi)個(ge)(ge)補充的(de)(de)(de)(de)(de)(de)試(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)，參(can)(can)照(zhao)(zhao)(zhao)上(shang)述(shu)(shu)(shu)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)5，不(bu)(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)僅(jin)是(shi)(shi)(shi)麥(mai)(mai)(mai)芽(ya)(ya)糖(tang)(tang)(tang)(tang)濃度(du)(du)改(gai)為(wei)0.01w/v％或(huo)0.03w/v％(但(dan)枸(gou)櫞(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)酸鈉(na)(na)(na)仍(reng)為(wei)0.04w/v％)，兩個(ge)(ge)試(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)項(xiang)指標(biao)(biao)均與(yu)(yu)(yu)上(shang)述(shu)(shu)(shu)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)5基本相同(tong)(tong)(tong)，例(li)(li)(li)如囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)(fu)化(hua)率(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)達(da)71.8～72.4％范(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)內；這一(yi)(yi)結(jie)果表(biao)(biao)明(ming)，在(zai)(zai)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)后(hou)期培養液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)補充添(tian)(tian)(tian)加(jia)適量(liang)枸(gou)櫞(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)酸鈉(na)(na)(na)和麥(mai)(mai)(mai)芽(ya)(ya)糖(tang)(tang)(tang)(tang)后(hou)能夠有效(xiao)地提高(gao)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)(fu)化(hua)率(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)。在(zai)(zai)一(yi)(yi)個(ge)(ge)補充的(de)(de)(de)(de)(de)(de)試(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)，參(can)(can)照(zhao)(zhao)(zhao)上(shang)述(shu)(shu)(shu)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)5，不(bu)(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)僅(jin)是(shi)(shi)(shi)不(bu)(bu)(bu)添(tian)(tian)(tian)加(jia)枸(gou)櫞(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)酸鈉(na)(na)(na)(但(dan)麥(mai)(mai)(mai)芽(ya)(ya)糖(tang)(tang)(tang)(tang)仍(reng)為(wei)0.02w/v％)，或(huo)者(zhe)不(bu)(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)僅(jin)是(shi)(shi)(shi)不(bu)(bu)(bu)添(tian)(tian)(tian)加(jia)麥(mai)(mai)(mai)芽(ya)(ya)糖(tang)(tang)(tang)(tang)(但(dan)枸(gou)櫞(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)酸鈉(na)(na)(na)仍(reng)為(wei)0.04w/v％)，兩個(ge)(ge)試(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)除了囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)(fu)化(hua)率(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)以(yi)外(wai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)各(ge)(ge)項(xiang)指標(biao)(biao)均與(yu)(yu)(yu)上(shang)述(shu)(shu)(shu)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)5基本相同(tong)(tong)(tong)，但(dan)是(shi)(shi)(shi)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)(fu)化(hua)率(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)顯(xian)著(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)，均在(zai)(zai)36～39％范(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)內(p<0.05，具有顯(xian)著(zhu)(zhu)性(xing)差異)；這一(yi)(yi)結(jie)果表(biao)(biao)明(ming)，僅(jin)添(tian)(tian)(tian)加(jia)枸(gou)櫞(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)酸鈉(na)(na)(na)和麥(mai)(mai)(mai)芽(ya)(ya)糖(tang)(tang)(tang)(tang)二者(zhe)之一(yi)(yi)時不(bu)(bu)(bu)能有效(xiao)提高(gao)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)(fu)化(hua)率(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)。在(zai)(zai)一(yi)(yi)個(ge)(ge)補充的(de)(de)(de)(de)(de)(de)試(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)，參(can)(can)照(zhao)(zhao)(zhao)上(shang)述(shu)(shu)(shu)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)5，不(bu)(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)僅(jin)是(shi)(shi)(shi)不(bu)(bu)(bu)添(tian)(tian)(tian)加(jia)枸(gou)櫞(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)酸鈉(na)(na)(na)和麥(mai)(mai)(mai)芽(ya)(ya)糖(tang)(tang)(tang)(tang)，試(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)除了囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)(fu)化(hua)率(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)以(yi)外(wai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)各(ge)(ge)項(xiang)指標(biao)(biao)均與(yu)(yu)(yu)上(shang)述(shu)(shu)(shu)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)5基本相同(tong)(tong)(tong)，但(dan)是(shi)(shi)(shi)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)(fu)化(hua)率(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)顯(xian)著(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)，為(wei)31.3％(p<0.05，具有顯(xian)著(zhu)(zhu)性(xing)差異)；這一(yi)(yi)結(jie)果表(biao)(biao)明(ming)，在(zai)(zai)將(jiang)胎(tai)牛血(xue)(xue)清(qing)濃度(du)(du)降(jiang)至2.5v/v％的(de)(de)(de)(de)(de)(de)情(qing)況(kuang)下如果不(bu)(bu)(bu)添(tian)(tian)(tian)加(jia)枸(gou)櫞(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)酸鈉(na)(na)(na)和麥(mai)(mai)(mai)芽(ya)(ya)糖(tang)(tang)(tang)(tang)二者(zhe)時不(bu)(bu)(bu)能有效(xiao)提高(gao)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)(fu)化(hua)率(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)。在(zai)(zai)一(yi)(yi)個(ge)(ge)補充的(de)(de)(de)(de)(de)(de)試(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)，參(can)(can)照(zhao)(zhao)(zhao)上(shang)述(shu)(shu)(shu)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)5，不(bu)(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)僅(jin)是(shi)(shi)(shi)胎(tai)牛血(xue)(xue)清(qing)濃度(du)(du)改(gai)為(wei)2v/v％或(huo)3v/v％，兩個(ge)(ge)試(shi)(shi)(shi)驗(yan)(yan)(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)各(ge)(ge)項(xiang)指標(biao)(biao)均與(yu)(yu)(yu)上(shang)述(shu)(shu)(shu)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)5基本相同(tong)(tong)(tong)，例(li)(li)(li)如囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)(fu)化(hua)率(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)達(da)70.3～71.7％范(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)內；這一(yi)(yi)結(jie)果表(biao)(biao)明(ming)，在(zai)(zai)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)后(hou)期培養液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)補充添(tian)(tian)(tian)加(jia)適量(liang)枸(gou)櫞(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)酸鈉(na)(na)(na)和麥(mai)(mai)(mai)芽(ya)(ya)糖(tang)(tang)(tang)(tang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)情(qing)況(kuang)下，即使將(jiang)胎(tai)牛血(xue)(xue)清(qing)濃度(du)(du)降(jiang)至2～3v/v％的(de)(de)(de)(de)(de)(de)范(fan)(fan)(fan)(fan)圍(wei)時仍(reng)然能夠有效(xiao)地提高(gao)囊(nang)胚(pei)(pei)(pei)孵(fu)(fu)化(hua)率(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)(lv)，此時胎(tai)牛血(xue)(xue)清(qing)這種昂(ang)貴的(de)(de)(de)(de)(de)(de)試(shi)(shi)(shi)劑的(de)(de)(de)(de)(de)(de)用量(liang)是(shi)(shi)(shi)實(shi)(shi)施(shi)(shi)例(li)(li)(li)1用量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)20～30％，而增(zeng)加(jia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)枸(gou)櫞(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)酸鈉(na)(na)(na)和麥(mai)(mai)(mai)芽(ya)(ya)糖(tang)(tang)(tang)(tang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)成本是(shi)(shi)(shi)非常(chang)低(di)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。
雖然(ran)，上(shang)文中已經用一般(ban)性(xing)說明(ming)及(ji)具體實施(shi)方案對本(ben)(ben)發明(ming)作了詳盡的描述，但在本(ben)(ben)發明(ming)基礎(chu)上(shang)，可以(yi)對之作一些修改或(huo)(huo)改進，這對本(ben)(ben)領域技術人(ren)員而言是顯而易(yi)見的。因此，在不偏離本(ben)(ben)發明(ming)精神(shen)的基礎(chu)上(shang)所做(zuo)的這些修改或(huo)(huo)改進，均(jun)屬于(yu)本(ben)(ben)發明(ming)要求保護的范圍。