含Endothelin-1的人類卵母細胞體外成熟培養液和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生殖醫學的生物醫學技術領域，涉及一種含有Endothelin-I(ET-I)的 人類卵母細胞體外成熟培養液，以及在進行人類未成熟卵母細胞體外成熟培養中的應用。
【背景技術】
[0002] 人卵母細胞體外成熟（in vitro maturation, IVM)是指通過體外培養，使卵泡內 的未成熟卵母細胞發育成為成熟的第二次減數分裂中期（Μ II )卵母細胞，受精分裂成胚胎 并移植獲得妊娠的技術。與常規的體外授精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer)相比，IVM可以降低大劑量促排卵藥物費用，節約就醫時間，更重要的是可以避免 藥物刺激卵巢帶來的副作用。而在生殖醫學的某些領域，IVM更是有不可替代的作用，如： 對有卵巢過度刺激綜合癥風險的病人進行IVM可最大程度避免卵巢過度刺激綜合癥的發 生；在更安全的條件下，實現腫瘤患者的生育能力保存；為卵子捐贈提供無需刺激的捐贈 途徑等。雖然IVM技術有著廣泛的應用前景，但由于體外成熟的卵母細胞進行體外受精后， 其受精，分裂和囊胚形成率均顯著低于IVF技術，所以IVM技術的成功率仍不能與常規IVF 技術相比。
[0003] 在人類卵母細胞體內成熟環境中，卵子處在完整的卵泡中，卵細胞和卵丘細胞、顆 粒細胞、卵泡膜細胞等形成了一個復雜精細的微環境調節系統，使細胞質和細胞核高度同 步化發育。只有模仿卵泡的微環境才能提高體外成熟卵細胞的成熟率、受精率和發育潛能。 目前IVM技術雖然已經有很大提高，但因對卵母細胞發育成熟機制及所需環境條件認識有 限，IVM仍有許多問題亟待解決。
[0004] 在目前已經推廣應用人類的ART技術中，IVM成功率最不穩定。其中突出的問題 是細胞核與細胞質成熟的不同步。IVM將未成熟的卵母細胞從中等大小的卵泡中分離出來， 致使卵母細胞成熟環境受到影響和干擾。體外培養雖可以獲得一定比例的自發細胞核成 熟，但是細胞質成熟常不能同步完成，致使卵母細胞缺乏某些支持胚胎發育的關鍵細胞質 成分，出現部分生長因子的表達和印記改變，發生染色體和紡錘體結構異常，進而導致IVM 卵母細胞受精和胚胎發育能力下降。
[0005] ET-I是內皮素（endothelin，ET)家族的一個重要成員，具有重要的生理功能。 ET-I以及EDNRA基因敲除小鼠在出生后不久死去。ET-I在呼吸、心血管、泌尿各系統起調 節作用并能影響腫瘤的發生、發展、轉移。此外，ET-I在生殖激素調節、妊娠、分娩等生殖過 程中也起著重要作用。我們前期研究發現hCG可以刺激卵巢的顆粒細胞和卵丘細胞產生 ET-1，并與卵丘細胞上的ET-I A受體（endothelin receptor type A, EDNRA)結合，從而 突破次黃嘌呤維持的減數分裂阻滯，使減數分裂重啟，促進卵母細胞的成熟。
[0006] 到目前為止，尚未見有關ET-I應用于人類卵母細胞體外成熟技術領域的報道。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供一種含有ET-I的人類卵母細胞體外成熟培養液，所述人卵 母細胞體外成熟培養液組成如下：A液：ET-I 100ng/ml，0. 075IU/ml r-FSH，體積分數10% 人血清替代物（Serum Substitute Supplement, SSS)，溶劑為常規基礎培養液；B液：ET-I 100ng/ml，0. 075IU/ml r-FSH，0. 5IU/ml hCG，體積分數10%SSS，溶劑為常規基礎培養液。基 礎培養液是指G-IVF。
[0008] 為實現上述目的，本發明將卵母細胞-卵丘復合體（Oocyte cumulus complexes, 0CC)置于含有ET-I的體外成熟培養液A液中進行培養，含有ET-I和r-FSH且不含hCG的 A液有助于維持卵丘細胞持續供給卵母細胞cAMP，保持減數分裂阻滯，有助于細胞漿的發 育成熟。在培養一段時間后將OCC轉入體外成熟培養液B液中進行培養，含有ET-I，r-FSH 和hCG的B液有助于卵母細胞核漿同步發育，促進卵母細胞成熟。
[0009] ET-I購自英國TOCRIS公司，r-FSH (果那芬）購自瑞士 Serono公司，HCG (艾澤） 購自瑞士 Serono公司。SSS購自美國Irvine公司。G-IVF購自瑞典vitrolife公司。
[0010] 本發明所述血清替代物不僅僅指SSS，還包括其他可以用于人類輔助生殖領域的 血清替代物。
[0011] 本發明的另一個目的是提供所述的含有ET-I的人類卵母細胞體外成熟培養液在 體外進行人卵母細胞培養中的應用，通過以下步驟實現： 1、配制人類卵母細胞體外成熟培養液，組成如下：A液：ET-I 100ng/ml，0.075IU/ ml r-FSH，體積分數10%SSS，溶劑為常規基礎培養液；B液：ET-I 100ng/ml，0. 075IU/ml r-FSH，0. 5IU/ml hCG，體積分數10%SSS，溶劑為常規基礎培養液。基礎培養液是指G-IVF。
[0012] 2、在四孔培養皿中加入含有ET-I的人類卵母細胞體外成熟培養液(A液與B液） 各兩孔，每孔750 μ 1，并放置于含6%C02, 37°C，飽和濕度的恒溫培養箱中平衡6小時以上。
[0013] 3、使用雙腔取卵針以較低的負壓(約90mmHg)在B超引導下吸取卵泡中的0CC，將 已經吸取在試管中的未成熟OCC在體式顯微鏡下仔細找出，并使用斜面轉動法初步鑒定卵 母細胞是否成熟，一切操作都需要在37°c的熱臺上完成。
[0014] 所述斜面轉動法是指在體式顯微鏡下，將培養皿傾斜約10-15 °，并將OCC沿培養 皿外緣小心轉動，由于外緣在轉動的過程中液體量減少，可以使OCC充分展開，進而較容易 鑒別含有生殖泡（GV)的未成熟卵母細胞。
[0015] 4、將卵泡穿刺取卵術中取出的未成熟OCC在卵母細胞體外成熟培養液A液中漂洗 兩遍，隨后將OCC轉移入新的卵母細胞體外成熟培養液A液中培養10小時。
[0016] 10小時后，將未成熟OCC轉移入卵母細胞體外成熟培養液B液中漂洗兩遍，隨后將 OCC轉移入新的卵母細胞體外成熟培養液B液中培養14小時。
[0017] 5、體外培養24小時后，將未成熟OCC轉移至透明質酸酶溶液中使用滅菌巴氏吸管 吹打數次，使卵丘細胞疏松易剝離，再用140 μm 口徑剝卵針將卵母細胞周圍的卵丘細胞小 心剝除。
[0018] 所用的透明質酸酶（HYASE-10X)購自瑞典vitrolife公司，使用前稀釋10倍。
[0019] 6、在倒置顯微鏡下確認明顯排出極體的Mil (Meiosis II)卵母細胞為成熟的卵 母細胞，將成熟的卵母細胞使用玻璃吸管小心轉移至G-I培養液中，并置于含6%C02, 37°C， 飽和濕度的恒溫培養箱中，即完成細胞培養。擇時以ICSI方式進行體外授精。
[0020] 本發明通過研究證明該培養液和培養方法具有促進人卵母細胞體外成熟，尤其是 胞質成熟的能力，并可提高卵母細胞體外受精后的胚胎發育潛能。本發明所涉及的人未成 熟卵母細胞體外成熟培養液和培養方法是根據人未成熟卵母細胞體外培養（IVM)時胞質與 細胞核發育不平衡影響胚胎體外發育潛能的現狀，結合ET-I在卵丘細胞中的生物學功能 和作用研制而成。含有ET-I成分的培養液通過序貫加入性激素（r-FSH/hCG)進行培養可 以使卵母細胞核漿發育趨于同步，提高胚胎的受精率和發育潛能，有助于優化IVM過程，值 得推廣應用。
【具體實施方式】
[0021] 本發明結合具體實施例做進一步說明，本發明的保護范圍并不僅限于此。
[0022] 實施例一:配制含有ET-I的人類卵母細胞體外成熟培養液 A 液：稱取 ET-I 10yg，7.5IUr