簡便、高效、低耗的豬卵母細胞體外成熟克隆培育方法
【專利說明】
[0001]
技術領域： 本發明涉及一種簡便、高效、低耗的豬卵母細胞體外成熟克隆培育方法，屬于細胞生物 學技術領域。
[0002]
【背景技術】： 傳統的動物卵母細胞體外成熟體系依賴于C02培養箱和細胞培養皿、培養板、石蠟油 等耗材，基本上都依賴進口，價格昂貴，實驗結果的穩定嚴重依賴經過嚴格訓練有素的技術 人員。進行胚胎工程技術的大規模工程化生產，要求必須建立操作簡便、便宜、可操作性較 強的技術體系。通過本發明研宄，成功建立了卵母細胞3-D搖床成熟體系，很好的解決了服 務于胚胎工廠化生產的卵母細胞體外成熟的問題，必將對相關胚胎工程技術的應用產生巨 大的推動和促進作用。
[0003]

【發明內容】
： 本發明所要解決的技術問題是：提供一種簡便、高效、低耗的豬卵母細胞體外成熟克隆 培育方法，經3-D搖床成熟的卵母細胞獲得的豬孤雌激活胚胎的囊胚發育率超過70%。
[0004] 本發明為解決就技術問題所采取的技術方案是： 一種簡便、高效、低耗的豬卵母細胞體外成熟克隆培育方法，其具體操作步驟如下： ① 收集豬卵巢：從屠宰場收集普通商品豬卵巢，置于30~37 °C的0.9%生理鹽水中， 5 h內運回實驗室，并用生理鹽水沖洗3~5次； ② 挑選卵母細胞：用帶12號針頭的10 ml注射器抽取卵巢表面上直徑為2~6 ml 卵泡的卵母細胞，然后在實體顯微鏡下用胚胎移液器吸取帶有2層卵丘細胞以上、胞質均 勻的卵母細胞，在洗卵液中洗3次，再在成熟液中洗2次； ③ 卵母細胞成熟：將挑選好的卵母細胞放入含有卵母細胞成熟液的離心管中，用3-D 搖床成熟45 h，培養條件為39 °C; ④ 供體細胞分離培養：無菌獲取成年豬耳部組織樣本，并于低溫條件下及時運送到實 驗室；將其剪碎離心洗滌后，加入適量供體細胞培養液，并將組織碎塊接種到培養瓶中；待 供體細胞爬出并長到70~80%匯合度時，進行傳代培養或冷凍保存； ⑤ 挑選成熟卵母細胞：將成熟42~46 h的豬卵母細胞在0.1~0.3 %的透明質酸酶中 渦旋震蕩，去除卵丘細胞，挑選排出第一極體的成熟卵母細胞，通過盲吸去核法進行去核； ⑥ 克隆胚胎構建：吸取中等大小、圓形、細胞膜折光度較好的供體細胞注射到透明帶下 方，并輕點透明帶使供體細胞與去核的卵母細胞細胞膜良好接觸，形成重構卵； ⑦ 克隆胚胎培養：將重構卵在洗滌液中洗滌3遍后，分批移到融合槽的融合液中進行 融合；將融合過的重構胚，分批移入激活液中激活3h，然后再移入胚胎培養液中，在39°C的 培養箱中培養直至移植； ⑧ 克隆胚胎移植：選用自然發情或誘導發情的母豬作為受體母豬，發情當天至第2天 手術進行克隆胚胎移植，手術前停喂飼料12h;將培養好的克隆胚胎置入37°C的便攜式培 養箱中帶入豬場手術室； ⑨ 克隆胚胎移植后28~30天通過B超檢查受體母豬懷孕情況。
[0005] 在步驟③中，所述的卵母細胞成熟液為10%的卵泡液+lPg/ml的促卵泡素FSH +lMg/ml的促黃體素LH+5. 9g/L的輕乙基哌嘆乙硫磺酸Hepes+5_15mM的NaHC03+ 10~20ng/ml的表皮細胞生長因子EGF+0? 57mM的半胱氨酸L-Cysteine+75yg/ml 的青霉素+50yg/ml的鏈霉素+2~8mM的維他命BT+20剛的維他命E。
[0006] 在步驟④中，所述的供體細胞培養液為66mg/L的青霉素+100mg/L的硫酸鏈 霉素+ 10~15%的胎牛血清FBS。
[0007] 在步驟⑤中，所述盲吸去核法如下：用固定針固定卵母細胞，用外徑為18~2〇Mm 的去核針吸取第一極體及其周圍的少量細胞質，然后用去核針輕壓透明帶切口再擠出些許 胞質；或用5~10Pg/ml的Hoechest 33342 (-種活細胞染料，其與細胞DNA可逆性結合， 在紫外光照射下，可以發出熒光)染色15~20min后，在紫外光下直接對卵母細胞進行去核 處理。
[0008] 在步驟⑦中，所述融合液為0.25 M的甘露醇+ 0.05 mmol/L的CaCl2 + 0.1 mm〇l/L的MgS04 + 0. 01%聚乙烯醇；所述激活液為0. 25 M的甘露醇+ 0. 1 mmol/L的 CaCl2+ 0.1 mmol/L的MgS04 + 0.01%的聚乙烯醇；所述激活液為改良豬合子培養液 mPZM+0. 4%牛血清白蛋白BSA + 7. 5呢/ml的細胞松弛素CB ;所述胚胎培養液為豬合子培 養液mPZM + 0. 4%牛血清白蛋白BSA。
[0009] 在步驟⑧中，所述受體母豬在手術前要由獸醫對其健康狀況進行檢查，然后用無 菌生理鹽水配制0. 025 g/ml的戊巴比妥鈉，按豬體重20~25 mg/kg的用量進行麻醉后綁 定；再分別用1%的高錳酸鉀溶液、3%的碘酊和75%的酒精消毒需要手術部位；手術時，在 側腹部表皮做5~7cm左右的切口，然后依次鈍性分離肌肉、脂肪、腹膜，快速、輕柔地取出 輸卵管和卵巢，并觀察卵巢上排卵情況，準備移植；整個過程中要不斷用保溫生理鹽水沖洗 保留組織，保持其濕度；將胚胎移植管從輸卵管傘部插入5~10cm，然后將克隆胚胎緩緩注 入、撤出、快速縫合創口，并作好創面保護；手術后連續兩天注射青霉素或鏈霉素消炎防止 感染，單獨隔離受體母豬。
[0010] 經3-D搖床成熟的卵母細胞獲得的豬孤雌激活胚胎的囊胚發育率超過70%。
[0011] 本發明將市售的適宜大小的3-D搖床放置于恒溫箱中，裝有卵母細胞的離心管放 于搖床之上，構成卵母細胞的3-D搖床成熟培養體系，可以替代昂貴的C0 2培養箱成熟，經 3-D搖床成熟的卵母細胞獲得的豬孤雌激活胚胎的囊胚發育率超過70%，達到國內領先水 平。
[0012] 本發明建立了操作簡便、便宜、可操作性較強的卵母細胞3-D搖床成熟技術體系， 可以完全替代傳統的卵母細胞體外成熟方法。該體系對于哺乳動物卵母細胞體外成熟和胚 胎培養的優化等提供了具體策略和方法，對于整個哺乳動物的胚胎工程產業化和相關發育 生物學研宄具有很大的應用價值和借鑒意義。
[0013] 本發明的試驗數據如下： 一、實驗材料與方法： 1.1豬卵母細胞的收集和體外成熟 從屠宰場收集普通商品豬卵巢，置于30~37 °C的0.9%生理鹽水中5 h內運回實驗 室，并用生理鹽水沖洗3~5次。用帶12號針頭的10 ml注射器抽取卵巢表面上直徑 2~6 ml卵泡的卵母細胞，在實體顯微鏡下用胚胎移液器吸取帶有2層卵丘細胞以上、 胞質均勻的卵母細胞（COCs)，在洗卵液中洗3次，再在成熟液中洗2次后成熟。
[0014] 成熟方法一：將卵母細胞移入在培養箱平衡至少4 h的成熟液滴mTCM199成熟 液（10%的卵泡液、0. 57 mM的半胱氨酸、10-20ng/ml的表皮生長因子EGF、75 μg/ml青 霉素、50 μg/ml的鏈霉素，1吒/ml的促卵泡素FSH、1吒/ml的促黃體素LH)中，用 胚胎級礦物油覆蓋，成熟45 h，培養箱條件為：5 % C02的空氣、最大相對飽和濕度、39 °C。
[0015] 成熟方法二：挑選好的卵母細胞放入含有成熟液mTCM199 (10%的卵泡液+ 1呢/ ml的促卵泡素FSH + lMg/ml的促黃體素LH + 5. 9g/L的輕乙基哌嘆乙硫磺酸Hepes + 5-15mM的NaHC03+10~20 ng/ml的表皮細胞生長因子EGF+ 0. 57mM的半胱氨酸 L-Cysteine + 75 μg/ml的青霉素+ 50 μg/ml的鏈霉素+ 2~8 mM的維他命BT + 20剛的維他命E)的離心管中，用3-D搖床成熟45 h，培養條件為39 °C。
[0016] 該實驗將市售的適宜大小的3-D搖床放置于恒溫箱中，裝有卵母細胞的離心管則 放于搖床之上，構成卵母細胞的3-D搖床成熟培養體系。
[0017] 1.2供體細胞分離培養： 無菌獲取成年豬耳部組織樣本，并于低溫條件下及時運送到實驗室。分別采用手術刀 和用眼科剪將其剪碎，并離心洗滌；加入供體細胞DMEM培養液（66 mg/L的青霉素和100 mg/L的硫酸鏈霉素和10~15%的胎牛血清FBS)少許，并將組織碎塊接種到培養瓶。待細 胞爬出并長到70~80%匯合時，進行傳代培養或冷凍保存。
[0018] 1. 3克隆胚胎構建及培養： 將成熟42~46 h的豬卵母細胞在0. 1~0. 3 %的透明質酸酶中渦旋震蕩，去除卵丘 細胞；挑選排出第一極體的成熟卵母細胞進行去核【在顯微操作儀下用盲吸法去核法進行 去核，簡述如下：用固定針固定卵母細胞，用外徑為18~2〇Mm的去核針吸取第一極體及其 周圍的少量細胞質，然后用去核針輕壓