一種特異性抑制twist1基因表達的小干擾rna及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及基因工程技術領域，具體地說涉及一種特異性抑制TWIST1基因表達的 小干擾RNA及其應用。
【背景技術】
[0002] RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術是指是指在進化過程中高度保守的、由雙 鏈RNA(double_strandedRNA，dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象，RNA分子通 過破壞特定的mRNA，以抑制某種基因表達的生物學過程。該技術具有以下幾點優勢：1高效 性;2特異性;3位置效應;4高穩定性;5可傳播性;6濃度時間依賴性。由于使用RNAi技術可以 特異性剔除或關閉特定基因的表達，該技術迅速成為基因功能研究和基因治療研究領域最 受關注的研究工具之一，已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領 域。
[0003] 惡性黑色素瘤(malignantmelanoma，MM):是源自于黑色素細胞的一種惡性腫瘤， 好發于皮膚，惡性程度高，治療難度大。雖然黑素瘤僅占全部皮膚腫瘤的4%，但卻占皮膚腫 瘤死亡人數的80%，是皮膚腫瘤中死亡率最高的一種惡性腫瘤。美國國家癌癥研究所(NCI) 的數據顯示，在2003-2007年間，患病人數為每年20.1人/10,000人。截止到2010年，估計有 68130個患者被診斷患有黑色素瘤，其中8700個患者將因此喪生（// www.cancer.gov/)。惡性黑色素瘤的發生率在全世界范圍內正在不斷地上升，包括以前發 病率低的地區，它已成為一種嚴重威脅人們健康的惡性疾病。在中國黑色素瘤患者有逐年 增高的趨勢。北京市八城區統計資料顯示，2000年MM發病率為0.2例/10萬，到了2004年已達 1例/10萬。根據中國臨床腫瘤協會(CSC0)黑色素瘤專家委員會發表的《中國黑色素瘤診治 指南（2011版）》，我國每年新發病例約2萬例，已經成為了嚴重危及我國人民健康的疾病之 〇
[0004]Twistl是屬于b螺旋-環-螺旋家族的轉錄因子，位于7q21.2,包含2個外顯子和1個 內含子。該轉錄因子的分子量約為SlkDadwistl的b螺旋-環-螺旋結構域在人類，小鼠，蛙， 果蠅等很多物種中高度保守。Twistl蛋白中1()9Q-T121是最主要的結構域，負責結合DNA。該基 因主要在中胚層來源的組織中表達。在人體正常組織中，Twistl在胎盤，心肌和骨骼肌等組 織中高表達，在胰腺，腎臟等組織中低表達，而在腦(外胚層來源），肺和肝（內胚層來源）的 組織中不表達。Twistl可以調控很多下游靶基因，通過這種方式，來參與控制各種各樣的生 物學進程和信號通路件，例如FGF信號通路，SHH信號通路，以及TGF0信號通路等。
[0005]除了在正常組織中發揮作用，Twistl還與包括乳腺癌，肝癌，前列腺癌，胃癌，膀胱 癌，食道鱗狀細胞癌和胰腺癌等多種惡性腫瘤密切相關。在這些腫瘤中，Twistl可以在腫瘤 發生，發展和轉移中扮演多種角色。特別是可以阻礙腫瘤誘導的細胞衰老和凋亡，增強腫瘤 干細胞群體，并且可以幫助癌細胞侵襲和轉移，以及上皮-間葉轉化(EMT)。其中EMT是腫瘤 細胞發生轉移的第一個步驟。近來發現，乳腺癌、惡性黑色素瘤以及其他腫瘤中Twist過表 達可作為預后不良的一個指標，許多證據表明Twistl蛋白也參與調節細胞凋亡。在人類腫 瘤中Twistl活化可能具有非常重要的臨床意義，Twistl很可能作為指導診斷、判斷預后的 指標，并可作為腫瘤生物治療的一個新靶點。
[0006] 下調TWIST1的表達，可以有效降低腫瘤抵抗衰老和凋亡的能力，抑制EMT的發生， 從而抑制腫瘤細胞的迀移和侵襲能力。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于提供一種能夠特異性抑制TWIST1基因表達的小干擾RNA (siRNA)及其應用。
[0008] 本發明根據RNAi發生原理，設計并合成了針對TWIST1基因的小干擾RNA，其GC含量 為52.63%，且正義鏈和反義鏈的長度均為19nt。
[0009]進一步地，本發明的小干擾RNA雙連體分子的正義鏈和反義鏈序列分別為：
[0010] 正義鏈：5 'CCGGAGACCUAGAUGUCAUdTdT-3 '，（SEQIDN0 · 1)
[0011] 反義鏈：5'-TdTdGGCCUCUGGAUCUACAGUA-3'（SEQIDN0.2)。
[0012] 本發明提供的上述小干擾RNA，能夠特異性下調細胞或生物體中TWIST1基因的表 達量。
[0013] 進一步地，本發明的小干擾RNA作用于TWIST1基因的靶序列為：5'_ CCGGAGACCTAGATGTCAT-3'（SEQIDN0.3)。
[0014] 一種編碼本發明所述小干擾RNA的DNA序列屬于本發明的保護范圍。
[0015] 本發明提供一種表達載體，其包含編碼上述小干擾RNA的DNA序列。
[0016] -種宿主細胞，其為可表達本發明所述小干擾RNA的細胞。
[0017] 一種含有上述小干擾RNA的藥物屬于本發明的保護范圍。
[0018]進一步地，所述的藥物為抗腫瘤的藥物。所述的腫瘤為黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、前 列腺癌、胃癌、膀胱癌、食道鱗狀細胞癌和胰腺癌。
[0019]進一步地，所述的藥物為免疫治療劑。
[0020] -種可表達上述小干擾RNA的細胞系也屬于本發明的保護范圍。
[0021 ]本發明提供了上述小干擾RNA在制備調節細胞或生物體中的TWIST1基因表達藥物 中的用途。
[0022] 本發明提供了上述小干擾RNA在制備抑制腫瘤細胞迀移和侵襲的藥物中的用途。
[0023]優選地，所述腫瘤細胞為黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、前列腺癌細胞、胃 癌細胞、膀胱癌細胞、食道鱗狀細胞癌細胞和胰腺癌細胞。
[0024]本發明提供了上述小干擾RNA在制備治療疾病的藥物中的用途，所述的疾病為黑 色素瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、食道鱗狀細胞癌和胰腺癌。
[0025]有效的靶向治療是目前國內外不斷尋找的輔助治療方法，本發明提供的特異性靶 向針對TWIST1基因的siRNA轉染黑色素瘤細胞后，發現siRNA能夠顯著下調TWIST1基因的表 達，有效抑制腫瘤細胞的迀移和侵襲能力，對于開發新的抗腫瘤基因藥物和腫瘤藥物的治 療效果具有重要指導作用，可用于開發制備抗腫瘤藥物，將會取得巨大的社會效益和經濟 價值。
【附圖說明】
[0026]圖1為本發明的siRNA對A375細胞TWIST1基因表達的敲低效果。其中1:未轉染siRNA的A375細胞;2:轉染陰性對照序列的A375細胞;3:轉染siRNA的A375細胞。
[0027]圖2為A375細胞中TWIST1基因mRNA敲低水平的電泳檢測結果，其中泳道1:分子量 標記;泳道2:轉染siRNA的A375細胞;泳道3:轉染陰性對照序列的A375細胞;泳道4:未轉染 siRNA的A375細胞。
[0028] 圖3為A375細胞TWIST1蛋白敲低水平的Westernblot檢測，其中泳道1:未轉染siRNA的A375細胞;泳道2:轉染陰性對照序列的A375細胞;泳道3:轉染siRNA的A375細胞。
【具體實施方式】
[0029]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神 和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0030] 若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規市售試劑，實施例中所用的技 術手段為本領域技術人員所熟知的常規