一種分泌抗喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，尤其設及一種分泌抗哇諾酬類藥物單克隆抗體的雜交 瘤細胞株及其應用。
【背景技術】
[0002] 哇諾酬類(QuinoIones，QNs)是一類化學合成的抗菌藥，由于運類藥物高效低毒、 價格低廉，所W多年來被廣泛應用于畜禽、水產養殖領域，用于預防和治療疾病。過量或不 當使用哇諾酬類藥物會造成其在動物農產品中殘留和蓄積。哇諾酬類藥物品種繁多，其在 動物體內還會轉化生成多種其它哇諾酬類藥物，而且即使用的是獸用藥，在體內也會轉化 成臨床藥物品種。
[0003] 人體攝入被QNs污染的農產品后，除了可能會引起關節病變、消化道反應、肝腎毒 性、血液系統毒性等不良反應，長期食用含低劑量的抗菌素，機體還會產生耐藥性，甚至產 生超級細菌，從而不利于該類藥物對人類疾病的治療。
[0004] 目前，對于哇諾酬類藥物殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法、液相-串聯質譜 法，運些方法具有定量精度高的特點，但儀器成本高、操作復雜、檢測時間長、不能用于現場 檢測，因而不適用于基層單位的應用，無法滿足農產品市場準入制度實施對檢測方法時效 性的需求。利用抗體與抗原的反應為核屯、發展起來的免疫學檢測方法主要有:酶聯吸附免 疫法巧LISA)和免疫膠體金法(GICT)分別具有高通量檢測和操作簡便、快速等優點，因而尤 其適合在基層單位的應用和現場快速檢測。
[000引開發藥物殘留檢測免疫試劑盒所面臨的主要難題除了檢測結果假陽性、假陰性率 偏高，還有其核屯、原料(抗體)批量小、批間差異大且價格昂貴。出現假陽性和假陰性分別是 由于方法的特異性和靈敏度不夠，而免疫學檢測方法的特異性和靈敏度又主要由抗體所決 定。常用的單克隆抗體生產方法是將雜交瘤細胞輸入動物體內，當動物腹部膨大產生腹水 時，再抽取腹水獲得抗體，但此方法不足之處為小鼠腹水量少而且動物個體差異使每只動 物所產抗體的質量和產量均有較大差異，從而造成抗體批量小且批間差異大;而有些國家 和地區禁止在動物體內制備抗體。
[0006] 申請公布號為CN102618502A的發明專利申請文獻公開了一種分泌抗哇諾酬類藥 物單抗的雜交瘤細胞株及其單抗應用，該細胞株的保藏編號為CGMCC N05608,能夠分泌亞 型為IgGlK鏈的單克隆抗體，經間接競爭化ISA分析表明該單抗與環丙沙星、恩諾沙星、氧氣 沙星、達氣沙星等哇諾酬類藥物有特異反應，IC50為3.65ng/mL可用于檢測食品中哇諾酬類 藥物的殘留。
[0007] 申請公布號為CN101792738A的發明專利申請文獻公開了一種環丙沙星單克隆抗 體細胞株及其單克隆抗體，該細胞株由骨髓瘤細胞與產生抗環丙沙星抗體的脾細胞融合制 備而成，保藏編號為CCTCC NO. C200947，能夠與環丙沙星、恩諾沙星攢在90 %的交叉反應， 而氧氣沙星、雙氣沙星、沙拉沙星、氯霉素、孔雀石綠均無交叉反應，IC5G為3.45ng/mL，實現 在水產品中快速檢測殘留的環丙沙星。

【發明內容】

[0008] 本發明提供了一種分泌抗哇諾酬類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，該 雜交瘤細胞株能夠在體外培養條件下大量分泌高靈敏度、高特異性的抗哇諾酬類藥物的單 克隆抗體。
[0009] -種分泌抗哇諾酬類藥物單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株 5H1E犯8D7H12,已于2015年8月26日保藏于中國典型培養物保藏中屯、（化ina Center for Type Culture Collection,簡稱CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO.C2015118;中國典型培養物 保藏中屯、的地址為：中國.武漢.武漢大學。
[0010] 本發明提供了所述雜交瘤細胞株在制備哇諾酬類藥物檢測試劑盒中的應用。
[0011] 本發明提供了所述雜交瘤細胞株在制備用于檢測哇諾酬類藥物的試紙條中的應 用。
[001引本發明提供了 一種所述雜交瘤細胞株的制備方法，包括：
[0013] (1)將牛血清白蛋白和環丙沙星混合制備偶聯物，再用所述偶聯物免疫動物，獲得 能夠產生抗哇諾酬類藥物抗體的脾細胞；
[0014] (2)將所述脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經篩選、克隆后，獲得所述雜交瘤細胞株；
[0015] 其特征在于，所述牛血清白蛋白與環丙沙星的投料比為1:10~30;所述偶聯物的 偶聯比為2~6:1。
[0016] 作為優選，所述的篩選和克隆在無抗菌素的條件下進行。
[0017] 具體地，所述的動物為BALB/c小鼠。
[0018] 本發明還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體由所述的雜交瘤細胞株或其傳代 細胞株分泌產生。
[0019] 具體地，所述單克隆抗體的亞型為IgGU鏈，與哇諾酬類藥物有特異性反應。
[0020] 作為優選，所述單克隆抗體通過體外培養的方式獲得。
[0021] 本發明還提供了所述的單克隆抗體在檢測哇諾酬類藥物中的應用。
[0022] 本發明還提供了所述的單克隆抗體在檢測動物源食用農產品殘留哇諾酬類藥物 中的應用。
[0023] 作為優選，所述的哇諾酬類藥物為環丙沙星、恩諾沙星、氧氣沙星、諾氣沙星、丹諾 沙星、沙拉沙星、麻保沙星、培氣沙星、洛美沙星、雙氣沙星、依諾沙星、氣甲哇、加替沙星、嗯 哇酸、氣羅沙星和司帕沙星中的至少一種。
[0024] 本發明還提供了一種哇諾酬類藥物的檢測試劑盒，含有所述的單克隆抗體。
[0025] 具體地，所述的試劑盒中含有所述雜交瘤細胞株或其傳代細胞株分泌產生的單克 隆抗體、酶標板、哇諾酬類藥物標準品，酶標記物(酶標二抗）、底物和終止液，其中，酶標板 上包被有人工合成的抗原(競爭物）。使用時，待待檢樣品與抗體加入酶標板完成反應后，再 加入酶標記物，若樣品中含有哇諾酬類藥物，則會與酶標板上的抗原競爭結合抗體，再加入 底物反應，終止顯色。顯色強度與樣品中殘留的哇諾酬類藥物量成反比。根據哇諾酬類藥物 標準品做出的標準曲線，計算出樣品中的哇諾酬類藥物的含量。
[0026] 本發明還提供了一種用于檢測哇諾酬類藥物的試紙條，包括:樣品墊、標記物墊、 反應膜和吸樣墊，所述標記物墊包被有膠體金標記、巧光標記或量子點標記的由所述雜交 瘤細胞株或其傳代細胞株分泌產生的單克隆抗體。
[0027] 本發明的試紙條中，所述反應膜的檢測線(T線)處包被有環丙沙星-卵清蛋白偶聯 物(CIP-0VA)，所述反應膜的質控線(C線)處包被有二抗。所述二抗選用羊抗鼠 IgG。
[0028] 與現有技術相比，本發明具有的有益效果為：
[0029] 本發明W環丙沙星與牛血清白蛋白形成的偶聯物為抗原，免疫BALB/c小鼠，再將 免疫后的小鼠的脾臟細胞與復壯的SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，并采用不添加抗菌素的培 養基進行細胞培養，經多次篩選和克隆獲得雜交瘤細胞株;該雜交瘤細胞株分泌的單克隆 抗體靈敏度高，特異性強，可用于哇諾酬類藥物的快速、準確免疫檢測和免疫分析。
【附圖說明】
[0030] 圖1為免疫抗原環丙沙星-牛血清白蛋白偶聯物(CIP-BSA)的質譜圖；
[0031] 圖2為單抗對環丙沙星(CIP)間接競爭化ISA的標準曲線；
[0032] 圖3為雜交瘤細胞株甜化犯8D7H12的染色體標本；
[0033] 圖4為重組純化蛋白（Protein G)純化抗體電泳圖；
[0034] 圖5為免疫膠體金法檢測豬肉添標樣本中的哇諾酬類藥物的結果。
【具體實施方式】 [003引實施例1
[0036] 雜交瘤細胞株5H化犯8D7H12于2015年8月26日送達中國典型培養物保藏中屯、（地 址：中國.武漢.武漢大學），該細胞株的存活性于2015年9月10日檢測結果為存活，保藏編號 CCTCC No:C2015118〇
[0037] 該雜交瘤細胞株通過環丙沙星(CIP)與牛血清白蛋白（BSA)的偶聯物(CIP-BSA)為 抗原免疫BALB/c小鼠，將免疫后小鼠的脾臟細胞與經復壯的SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，采 用不添加抗菌素的培養基進行細胞培養，經過篩選和4次克隆獲得。具體過程如下：
[0038] 1.免疫抗原(CIP-BSA)的合成
[0039] (1)稱取牛血清白蛋白（BSA) 125mg，碳二亞胺化DC)90mg，加4.5mL水溶解，制成A 液。
[0040] (2)稱取鹽酸環丙沙星（Ciprofloxacin hy化ochloride，簡稱CIP，CAS號：86483- 48-9分子式:Ci7化9CIFN3化分子量:367.8) 15mg，加水1.5mL溶解后制成B液，將B液加入A液。
[0041] (3)將上述混合后的溶液置于搖床上，4°C避光震蕩1她W上，上下顛倒5次。
[0042] (4)收集反應液，先用O.lmol/L化0H溶液透析化，再用PBS(7.4)透析3天，換水6 次，得CIP-BSA溶液。
[0043] (5)用考馬斯亮藍染色法檢測抗原蛋白濃度：CIP-BSA溶液稀釋40倍，測得值 0.2420 mg/mL，原溶液濃度為9.68mg/mL。
[0044] (6)用高分辨率離子阱質譜檢測CIP-BSA分子量為67995.2734道爾頓（見圖1)，W 相同方法測得BSA分子量為66366.2578道爾頓，計算偶聯比為：
[004引2.包被抗原(CIP-0VA)的合成
[0046] (1)稱取卵清蛋白（0VA)125mg，邸C 90mg，加4.5mL水溶解，制成B液。
[0047] (2)稱取CIP 15mg，加水1.5mL溶解后，加入B液。
[0048] (3)將上述混合后的溶液置于搖