一種h3n2犬流感病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立及其單克隆抗體的制備與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞工程技術領域，更具體地，涉及一種H3N2犬流感病毒的單克隆抗 體雜交瘤細胞株的建立及其單克隆抗體的制備與應用。
【背景技術】
[0002] 犬流感（Canine influenza，CI)是由正粘病毒科A型流感病毒（IAV)屬犬流感病 毒（CIV)引起的一種犬屬動物接觸性呼吸道傳染病。該病首次于2004年在美國爆發，隨后 在歐亞大陸等地區相繼報道。CI主要分為H3N2和H3N8兩種亞型，歐美以H3N8亞型為主， 大部分亞洲國家以H3N2亞型為主。近十多年來，IAV不斷突破種間束縛，在人和動物中交 叉感染，引起了人們對流感的普遍關注。
[0003] 犬是與人類接觸最為親密的動物之一，可能在流感傳染過程中扮演著重要角色。 因此，需要加強對CI的研宄；申請號為201410535918.6的中國專利公開了針對H3N2亞型 犬流感病毒HA2蛋白的單克隆抗體，它是以犬流感病毒分離株JS/10制備雜交瘤細胞后獲 得，現有技術對于H3N2犬流感病毒的研宄較少，不利于臨床研宄與發展。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是克服現有技術所存在的上述缺陷，提供一種H3N2 亞型犬流感病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株。
[0005] 本發明的第二個目的是提供一種H3N2亞型犬流感病毒的單克隆抗體。
[0006] 本發明的第三個目的是提供含有上述單克隆抗體的試劑盒。
[0007] 本發明的第四個目的是提供上述單克隆抗體的應用。
[0008] 本發明的第五個目的是提供基于上述單克隆抗體的免疫檢測方法。
[0009] 本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的：
[0010] 一種H3N2亞型犬流感病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株H3N2-CIV-HA-2C5,所述細 胞株于2015年5月13日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC C201555,保 藏地址為湖北省武漢市武漢大學。
[0011] 上述雜交瘤細胞株的制備方法：取血清效價符合融合要求的BALB/c小鼠脾細胞 與SP2/0骨髓瘤細胞按常規方法用50% PEG-1000進行融合；用HAT培養基篩選融合細胞， 用純化后的H3N2CIV包被酶標板，采用間接ELISA方法篩選目的融合細胞；經過多次有限稀 釋，最后獲得穩定分泌犬流感病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0012] 由上述雜交瘤細胞株分泌得到單克隆抗體；所述單克隆抗體為IgG2a亞型，輕鏈 為Kappa鏈。
[0013] 所述單克隆抗體的制備方法：應用保藏編號為CCTCC C201555的雜交瘤細胞株， 以I X IO6/只的量注入經FICA處理的8~10周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養觀察小鼠 腹部膨大時抽取腹水。采用瓊脂糖親和介質（Protein A)純化腹水獲得。
[0014] 血凝素（HA)是流感病毒的主要抗原蛋白，參與病毒結合細胞受體以及病毒與靶 細胞膜融合。流感病毒只有當HA裂解為HAl和HA2時才能發揮病毒感染作用，因此，制備 針對HA抗原位點的具有中和活性的單克隆抗體被作為評價流感病毒保護性的標準，本發 明所述雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體為抗H3N2CIV HA的抗體。
[0015] 另外，本發明還提供含有上述單克隆抗體的試劑盒；所述試劑盒可用于檢測流感 病毒。
[0016] 上述單克隆抗體在制備預防或控制流感病毒的藥物或免疫制劑中的應用。
[0017] 上述單克隆抗體在制備預防或控制流感病毒的藥物或免疫制劑組合物中的應用。
[0018] 上述單克隆抗體在檢測流感病毒中的應用。
[0019] 本發明還提供基于上述單克隆抗體的免疫檢測方法
[0020] 優選地，上述流感病毒為犬流感病毒。
[0021] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0022] 本發明提供了一種H3N2亞型犬流感病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株，所述雜 交瘤細胞株于2015年5月13日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC C201555 ;其分泌的單克隆抗體與H3N2亞型犬流感病毒血凝素特異性結合，親和力高，純 化后效價為 1 :320, 000,它與 CDV、CPV、CPIV、CAV- II、CRV 及 H7N9、H10N8、H9N2 亞型流感 病毒均不發生反應。通過注射本發明所述單克隆抗體用于預防和控制流感病毒的感染，與 傳統的疫苗接種手段相比，特異性更強，風險更低，安全性更高。具有實際的應用價值。
【附圖說明】
[0023] 圖1為H3N2CIV濃縮純化結果圖。
[0024] 圖2為雜交瘤細胞第7d生長狀態圖。
[0025] 圖3為小鼠腹水與兔血清純化效果圖；M :蛋白質分子量標準；A :純化后的兔血清 效果圖；B :純化后小鼠腹水。
[0026] 圖4為單克隆抗體亞型鑒定結果；a :2C5分泌的McAb亞型檢測結果；b :試紙條標 準顯色條帶說明。
[0027] 圖5為單克隆抗體間接免疫熒光鑒定結果；a :H3N2CIV感染的MDCK細胞；b :陰性 對照。
[0028] 圖6為單克隆抗體WB試驗鑒定結果；a :真核表達的H3N2CIV NP、HA、PB1、PB2、PA 鑒定結果；b :真核表達的H3N2CIV NS2、M2、M1、NA鑒定結果；M :蛋白質分子量標準；C :未轉 染質粒的正常293T細胞對照組。
[0029] 圖7為陰性雞胚尿囊液正態分布圖。
[0030] 圖8為雙抗夾心ELISA敏感性試驗。
[0031] 圖9為雙抗夾心ELISA特異性試驗。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本 發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單 修改或替換，均屬于本發明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術 人員所熟知的常規手段。
[0033] 實施例1雜交瘤細胞株的制備
[0034] 一、H3N2亞型犬流感病毒的抗原制備
[0035] 本發明所用的毒株 A/canine/Guangdong/1/2006 (H3N2)(簡稱 CGDl)，其 Genbank 的登陸號為⑶433345. 1、⑶433346. 1、⑶433347. 1、⑶433348. 1、⑶433349. 1、⑶433350. 1、 GU433351. 1、GU433352. 1，毒株及其序列參照網址：//www. ncbi. nlm. nih. gov/ nuccore/ ? term = A% 2Fcanine% 2FGuangdong% 2F1% 2F 2006% 28H3N2% 29〇
[0036] 1、病毒擴大培養：將稀釋后的CGDl毒株雞胚尿囊液接種10日齡SPF雞胚尿囊腔， 接種量為〇. 15mL/胚，37°C孵育。每12h觀察一次，棄24h內死亡雞胚，將24h后的死胚置 于4°C冰箱保存。96h后將所有雞胚于4°C冷卻過夜，無菌收集雞胚尿囊液，10, OOOr/min，離 心10min，去沉淀留上清。參照國標方法（GB/T 14926. 53-2001)，取少量尿囊液上清測定血 凝單位（HAU)，其余尿囊液上清于4°C暫存備用。
[0037] 2、病毒的滅活：在H3N2CIV尿囊液上清中加入體積分數約0. 1 %的甲醛溶液，充分 混勻，4°C滅活3d，每隔Id充分振蕩1次。測定滅活病毒液的HAU，尿囊液置4°C保存。
[0038] 3、病毒的純化：a.將滅活的病毒液轉入超離心管（超離心管內不能有氣泡，應完 全裝滿，以免離心過程中爆管），35, OOOr/min離心Ih ;b.及時棄上清，抽干離心管底部殘留 上清。用已高壓的2mL PBS重懸病毒沉淀，將重懸液轉移至新EP管中備用；c.把不同濃度 的蔗糖加入密度梯度離心管（總體積12mL)中，先加15%蔗糖溶液2mL，再順序加入30%、 45 %蔗糖溶液各4mL，每次加蔗糖溶液時應將針頭完全置于管底，用較高濃度蔗糖溶液將較 低濃度鹿糖溶液抬升。把步驟b的重懸病毒液ImL加至鹿糖溶液最上層，35, OOOr/min下離 心2h ;d.在光線明亮處，小心吸取各濃度蔗糖層面交界處純化產物，分別置于不同超離心 管中，加滿PBS，35, OOOr/min下離心2h，去蔗糖；e.棄上清，加入PBS重懸沉淀，各管重懸液 吸出后分別轉移至新高壓EP管中，通過HA試驗確定病毒粒子的分布。用分光光度計測定 純化病毒（H3N2CIV)蛋白濃度后，-20°C保存備用。
[0039] 實驗結果：共收集到雞胚尿囊液約600mL，HAU為28,0. 1 %甲醛滅活后HAU下降一 個單位，為27。H3N2CIV主要存在于30%與45%蔗糖層面交界處，有許多小顆粒物分布，呈 白色條帶。去蔗糖后，可見濃縮純化的H3N2CIV呈黃白色斑塊，如圖1。試驗共獲得4mL病 毒懸液，HAU為1 :3, 200,分光光度計測得蛋白濃度為I. 65mg/mL ;在其它各濃度蔗糖層面也 發現流感病毒存在，但HAU均相對較低。
[0040] 4、小鼠免疫程序
[0041] 將純化好的H3N2CIV免疫3只雌性8周齡BALB/c小鼠，共免四次（如表1)。首次 免疫使用FCA與純化的H3N2CIV以1 :1超聲乳化，取0. 3mL腹腔注射。在第14d和第28d 分別進行加強免疫時，以FICA與純化的H3N2