Nkt細胞的培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于細胞生物學領域，具體設及一種NKT細胞的培養方法，尤其是NKT細胞 的Ξ維培養方法。
【背景技術】
[0002] 腫瘤是指機體在各種致瘤因子作用下，局部組織細胞增生所形成的新生物，因為 運種新生物多呈占位性塊狀突起，也稱寶生物。根據新生物的細胞特性及對機體的危害性 程度，又將腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩大類，而癌癥即為惡性腫瘤的總稱。
[0003] 傳統的腫瘤治療方法有手術治療、放療和化療。但手術對于對分散的、不可見的癌 細胞無法消除，故存在著復發和轉移的風險。放化療可W消滅腫瘤細胞，緩解病情，但放化 療沒有識別的能力，往往在殺死腫瘤細胞的同時殺傷了正常的細胞，長期的放化療會讓患 者免疫力降低，出現毒副作用。為彌補運些治療方法的缺陷，細胞免疫治療出現了。
[0004] 細胞免疫治療是一種新興的治療技術。細胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細 胞，經過體外培養，使其數量成百倍增多，祀向性殺傷功能增強，然后再回輸到人體來殺滅 血液及組織中的病原體、癌細胞、突變的細胞，打破免疫耐受，激活和增強機體的免疫能力， 兼顧治療和保健的雙重功效。細胞免疫治療可W恢復與增強腫瘤患者自身的免疫監測和殺 瘤功能，有效地殺滅患者術后和放化療后體內殘存的腫瘤細胞，達到治療腫瘤、預防復發與 轉移和最終根治腫瘤的目的，具有特異性強、副作用輕等優點。
[0005] NKT細胞是免疫細胞治療中非常重要的一類細胞群。NKT(na化ral killer T)細胞 是一群細胞表面既有T細胞受體TCR，又有NK細胞受體的特殊T細胞亞群，可分泌大量的IL-4 和IFN- 丫因子，是免疫調節和細胞殺傷性作用的重要細胞群。NKT細胞活化后具有NK細胞樣 細胞毒活性，可溶解NK細胞敏感的祀細胞，主要效應分子是穿孔素、Fas配體和IFN-丫。目前 NKT細胞作為具有強力殺傷祀細胞的一類細胞群，在腫瘤免疫細胞治療中具有非常重要的 作用。經體外培養得到的NKT細胞能很好的起到腫瘤免疫治療和保健作用。
[0006] 在NKT細胞常規培養中，主要是利用培養瓶或培養袋按一定細胞密度直接進行培 養，具體培養方法是:普通培養瓶用包被液A(Retronectin蛋白）和包被液B(Anti-CD3蛋白） 包被;外周血分離單個核細胞(PBMC)，經磁珠分選獲得NK/NKT細胞，接種至經包被后的培養 瓶中；培養14天收集NK/NKT細胞。
[0007] 然而傳統培養瓶培養NKT細胞，部分細胞很容易貼壁。當細胞增殖培養時，大量的 成團細胞很容易沉于底部，易導致NKT細胞不能充分接觸培養液，減緩細胞增殖，并且容易 使成團的細胞死亡。

【發明內容】

[000引有鑒于此，本發明的目的在于針對現有技術存在的問題，提供一種NKT細胞的培養 方法。本發明所述培養方法利用徑丙基甲基纖維素在NKT細胞培養初期建立起培養液的Ξ 維結構，W解決NKT細胞在增殖過程中成團細胞堆積底部而無法很好的接觸培養液的問題。
[0009] 為了實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：
[0010] -種NKT細胞的培養方法，單個核細胞接種X-VIV015無血清培養基，加入徑丙基甲 基纖維素溶液、比-2、比-15、比-21W及CD3單克隆抗體培養NKT細胞。
[0011] 徑丙基甲基纖維素化PMC):是選用高度純凈的棉纖維素作為原料，在堿性條件下 經專口酸化而制得，溶于水及大多數適當比例的乙醇/水、丙醇/水、二氯乙燒等，在冷水中 溶脹成澄清或微濁的膠體溶液。本發明所述培養方法利用徑丙基甲基纖維素的常溫成膠效 果，加入徑丙基甲基纖維素溶液，在NKT細胞培養初期建立起培養液的Ξ維結構，使NKT細胞 在Ξ維空間內增殖，空間更大、接觸到的培養液面積更充足，避免NKT細胞在增殖過程中成 團細胞堆積底部，不能很好的繼續增殖。
[001^ 其中，在一些實施方案中，所述NKT細胞的培養方法中所述徑丙基甲基纖維素的終 濃度為0.8wt % -6wt %，粘度為20Mpa. s-80Mpa. S。
[0013] 在一些實施方案中，所述NKT細胞的培養方法中所述單個核細胞接種X-VIV015無 血清培養基的接種量為5 X 106個/mL-15 X 106個/血。
[0014] 本發明所述培養方法除了加入了徑丙基甲基纖維素外還加入了一下細胞因子，包 括比-2、比-15、比-21W及CD3單克隆抗體。
[0015] 在一些實施方案中，本發明所述培養方法中所述IL-2的終濃度為200-1000U/mL、 比-15的終濃度為200-1000U/mL、比-21的終濃度為200-1000U/mL、CD3單克隆抗體的終濃度 為lOO-lOOOU/mL。
[0016] 本發明所述培養方法培養時間優選為14天W上。
[0017] 進一步的，在一些實施方案中，本發明所述培養方法每隔2-3天補液一次。
[0018] 其中，每次補液添加 X-VIV015無血清培養基、徑丙基甲基纖維素溶液、化-2、IL- 15、比-21W及CD3單克隆抗體。
[0019] 優選的，每次補液IL-2的終濃度為200-1000U/mL、化-15的終濃度為200-1000U/ mL、化-21的終濃度為200-1000U/mL、CD3單克隆抗體的終濃度為/1^;徑丙基甲基 纖維素的終濃度為0.8wt %-6wt %，粘度為20Mpa. s-50Mpa. S。
[0020] 在一些優選實施方案中，本發明所述的培養方法從第Ξ次補液開始不添加 IL-21 和CD3單克隆抗體。即從第Ξ次補液開始只添加 X-VIV015無血清培養基、徑丙基甲基纖維素 溶液、比-2和比-15。化-2的終濃度為200-1000U/mL、比-15的終濃度為/1^;徑丙 基甲基纖維素的終濃度為0.8wt %-6wt %，粘度為20Mpa. s-50Mpa. S。
[0021] 本發明所述培養方法中所述徑丙基甲基纖維素溶液可W由通過商業渠道購買的 徑丙基甲基纖維素加水配制而成。
[0022] 在一些實施方案中，所述徑丙基甲基纖維素溶液的制備方法為70-75Γ熱水溶解 徑丙基甲基纖維素冷卻至室溫，配制質量濃度為8 % -20 %，粘度40Mpa. s-lOOMpa. S的徑丙 基甲基纖維素溶液，并調節PH至6.8-7.5。
[0023] 本發明所述培養方法中所述單個核細胞可W由外周血或廝帶血分離得到。
[0024] 在一些實施方案中，所述單個核細胞的制備方法為外周血或廝帶血加入生理鹽水 稀釋，緩慢加入到含淋己細胞分離液的離屯、管中，使稀釋的血液與淋己細胞分離液分層清 晰，500-800g 罔屯、2〇-30min。
[002引由上述技術方案可知，本發明提供了一種NKT細胞的培養方法，單個核細胞接種X- VIV015無血清培養基，加入徑丙基甲基纖維素溶液、比-2、IL-15、IL-21W及CD3單克隆抗體 培養NKT細胞。本發明所述培養方法利用徑丙基甲基纖維素的常溫成膠效果，加入徑丙基甲 基纖維素溶液，在NKT細胞培養初期建立起培養液的Ξ維結構，使NKT細胞在Ξ維空間內增 殖，空間更大、接觸到的培養液面積更充足，避免NKT細胞在增殖過程中成團細胞堆積底部， 不能很好的繼續增殖。實驗結果顯示采用本發明所述NKT細胞的培養方法培養NKT細胞，細 胞狀態好、增殖速度快、增殖倍數高，可W獲得更高純度的NKT效應細胞，得到的NKT細胞殺 傷效果也明顯高于常規的培養方法。
【附圖說明】
[0026] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0027] 圖1示試驗例1各組增殖曲線；
[0028] 圖2示試驗例1中組2在培養14天時NKT顯微觀察的細胞形態圖，放大倍數為40倍；
[0029] 圖3示試驗例1中組5在培養14天時NKT顯微觀察的細胞形態圖，放大倍數為40倍；
[0030] 圖4示試驗例1中組2培養的NKT細胞表面標記物CD3+CD56+表達情況圖；
[0031] 圖5示試驗例1中組5培養的NKT細胞表面標記物CD3+CD56+表達情況圖；
[0032] 圖6示試驗例1中組巧日組5培養14天后的細胞對K562細胞的殺傷能力檢測圖。
【具體實施方式】
[0033] 下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發明保護的范圍。
[0034] 為了更好的理解本發明，下面結合具體實施例對本發明進行詳細闡述。其中所述 徑丙基甲基纖維素化PMC)購自山東蘇諾克化工有限公司；
[0035] 實施例1:單個核細胞的分離
[0036] 采集外周血20mL，加入lOmL生理鹽水稀釋，緩慢加入到含淋己細胞分離液15mL的 離屯、管中，使稀釋的血液與淋己細胞分離液分層清晰，500g-800g離屯、力，升降速為0,離屯、 20-30min，提取中間白膜層細胞，即得單個核細胞，加生理鹽水清洗兩遍，計數，細胞量為2 X10M"-4X10M"。
[0037] 實施例2、徑丙基甲基纖維素溶液的配制
[0038] 取一定量去離子水加熱至70°C-75°C，按lOOmL去離子水加入10g-20g徑丙基甲基 纖維素，配制質量濃度為8%-20%徑丙基甲基纖維素溶液，在磁力攬拌器上溶解，攬拌機轉 速3(K)r/min，溶解lOmin，靜置消除氣泡，冷卻至室溫，得到的徑丙基甲基纖維素溶液粘度控 制在室溫40Mpa. s-lOOMpa. S，0.1mol/mL的肥1或NaOH溶液調節PH至6.8-7.5，備用。
[0039 ]實施例3、本發明所述NKT細胞的培養方法
[0040] 1、獲取單個核細胞(PBMC)2-4X107個，按5-15Xl〇VmL接種X-VIV015無血清培養 基，同時加入徑丙基甲基纖維素溶液、比-2、IL-15、化-21W及CD3單克隆抗體培養NKT細胞； 其中，按lOOmL培養液加入HPMC溶液lOmL，維持HPMC質量百分比為1.5-2 %，溶液粘度 20Mpa. s;比-2終濃度為200U/mL，化-15終濃度為200U/mL，比-21終濃度為200U/mL，CD3單克 隆抗體終濃度為1〇〇υ/ιΛ;
[0041] 2、每隔2-3天補液一次，每次補液添加 X-VIV015無血清培養基、徑丙基甲基纖維素 溶液、比-2、化-15、化-21W及CD3單克隆抗體;其中，按1 OOmL培養液加入HPMC溶液1 OmL，維 持HPMC質量百分比為1.5-2 %，溶液粘度20Mpa. S;化-2終濃度為200U/