一種用于誘導橡膠樹多主棒孢霉真菌產孢方法
【技術領域】
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[0001]本發明涉及一種用于誘導橡膠樹多主棒孢霉真菌產孢方法，屬于生命科學技術領域。
【背景技術】
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[0002]橡膠樹多主樹棒孢霉落葉病是繼南美葉疫病之后的一種毀滅性病害，能為害橡膠幼苗、幼樹和成齡樹，侵害各齡期葉片，造成嫩葉、嫩梢回枯，葉片大量反復脫落，導致膠乳減產高達20 %?25 %，甚至造成橡膠樹死亡。國內學者在研究中都遇到該真菌在室內人工培養條件下不易產孢，影響病原菌的形態鑒定及相關的科研工作。有學者采用室內培養基自然產孢法、紙片產孢法和菌絲打斷法等對橡膠樹多主棒孢霉真菌C ο r y n e s P ο r acassiicola(Berk Curt)Wei菌株做誘導產孢，只有極少數橡膠樹棒孢霉真菌在培養基上能產孢，用紙片法和菌絲打斷法雖然能產孢，但孢子的形態與自然條件下形成的形態差異較大，難以用于形態鑒定。

【發明內容】

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[0003]本發明目的在于克服現有技術之不足，而提供一種用于誘導橡膠樹多主棒孢霉真菌產孢方法。為后續多主棒孢霉真菌形態鑒定、病原菌入侵方式、致病性和種群遺傳學等相關研究奠定基礎。
[0004]發明人在研究中發現:在接近自然條件在溫室中，采用人工接種活體橡膠樹葉片、誘導其產孢，能夠保持多主棒孢霉真菌生長在原來的寄主，而且其生長及產孢的環境與野生環境相似，所產生的孢子形態與野生條件下形成的一致，且能用于多主棒孢霉真菌孢子形態觀察。
[0005]本發明的用于誘導橡膠樹多主棒孢霉真菌產孢方法，其具體步驟如下:
[0006](I)接種橡膠苗木準備
[0007]選用主栽橡膠樹品為嫁接苗，盆栽放置于溫室中，常規方法澆水、施肥管理，當橡膠樹新長出葉片處于淡綠色時用于接種多主棒孢霉真菌誘導產孢；
[0008](2)多主棒孢霉真菌培養
[0009]將多主棒孢霉真菌接到常規的TOA培養基平板上，置于28°C、自然光照環境條件下培養7d;
[0010](3)多主棒孢霉真菌接種
[0011 ]用直徑為0.5cm的打孔器從28°C、自然光照、常規的PDA培養7d的橡膠樹多主棒孢霉真菌菌落的外圈切取帶菌瓊脂塊，接種到橡膠葉被牙簽刺傷部位，菌絲體直接接觸葉片，每片橡膠葉接種一個帶菌瓊脂塊；
[0012](4)誘導產孢
[0013]橡膠葉接種后，保持溫室內相對濕度保持在80%以上，溫度在20°C?30°C，自然光照條件，3d后除出葉片上接種的帶菌瓊脂塊，待多主棒孢霉真菌侵染橡膠葉片產生病斑，Sd后受害葉部位呈灰褐色時多主棒孢霉真菌在病斑處長出棒狀分生孢子。
[0014]本發明的有益效果在于:
[0015]1、本方法保持多主棒孢霉真菌生長在原來的寄主，而且其生長及產孢的環境與野生環境相似，所產生的孢子形態與野生條件下形成的一致，避免了現有室內人工基質培養導致多主棒孢霉真菌孢子變異。
[0016]2、接種環境條件能人工調控不受季節限制、便于操作，節約了人力物力及時間。【具體實施方式】:
[0017]下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0018](I)接種橡膠苗木準備
[0019]選用GTl或RRM600或云研277-5主栽橡膠樹品為嫁接苗，盆栽放置于溫室中，按常規方法澆水、施肥管理，當橡膠樹新長出葉片處于淡綠色時用于接種多主棒孢霉真菌。
[0020](2)培養基制備及多主棒孢霉真菌培養
[0021 ]先將土豆洗凈去皮，再稱取200g土豆切成小塊，加水煮沸20min，用8層紗布過濾，向過濾液中加18g瓊脂，攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入20g葡萄糖，攪拌均勻，冷卻后再補足水分至1000ml，分裝入三角瓶內，蓋上硅膠塞、用4層牛皮紙蓋住硅膠塞后再用橡皮筋包扎，121°C滅菌20min后取出三角瓶搖勻，在超凈工作臺中將培養基倒入無菌的培養皿中，冷卻后挑取多主棒孢霉真菌的菌絲體接種于培養基中央，將多主棒孢霉真菌放入28°C、自然光照環境條件下培養7d。
[0022](3)多主棒孢霉真菌接種
[0023]接種前用滅菌牙簽刺傷的淡綠色橡膠葉片中央待接種的部位。用直徑為0.5cm的打孔器從28°C、自然光照、常規的PDA培養7d的橡膠樹多主棒孢霉真菌菌落的外圈切取帶菌瓊脂塊，接種到橡膠葉被牙簽刺傷部位，菌絲體直接接觸葉片，每片橡膠葉接種一個帶菌瓊月旨塊。
[0024](4)誘導產孢環境條件
[0025]橡膠葉接種后，保持溫室內相對濕度保持在80%以上，溫度在20°C?30°C之間，自然光照條件。3d后除出葉片上接種的帶菌瓊脂塊，待多主棒孢霉真菌侵染橡膠葉片產生病斑，8天后受害葉部位呈灰褐色時多主棒孢霉真菌在病斑處長出孢子。取Icm2的感病橡膠葉組織剪成小塊放入裝有1.0mL水的離心管中、渦旋振蕩，使感病橡膠葉組織上的多主棒狀真菌的分生孢子脫落，制成孢子懸浮液，血球計數板上計數并計算單位面積的產孢量，多主棒狀真菌的產孢量達到0.6 X 13個孢子/cm2的感病葉組織。
【主權項】
1.一種用于誘導橡膠樹多主棒孢霉真菌產孢方法，其特征在于該方法的具體步驟如下: (1)接種橡膠苗木準備 選用主栽橡膠樹品系的嫁接苗，盆栽放置于溫室中，常規方法澆水、施肥管理，當橡膠樹新長出葉片處于淡綠色時用于接種多主棒孢霉真菌誘導產孢； (2)多主棒孢霉真菌培養 將多主棒孢霉真菌接到PDA培養基平板上，置于28°C、自然光照環境條件下培養7d; (3)多主棒孢霉真菌接種 用直徑為0.5cm的打孔器從28°C、自然光照、PDA培養7d的橡膠樹多主棒孢霉真菌菌落的外圈切取帶菌瓊脂塊，接種到橡膠葉被牙簽刺傷部位，菌絲體直接接觸葉片，每片橡膠葉接種一個帶菌瓊脂塊； (4)誘導產孢 橡膠葉接種后，保持溫室內相對濕度保持在80%以上，溫度在20°C?30°C，自然光照條件，3d后除出葉片上接種的帶菌瓊脂塊，待多主棒孢霉真菌侵染橡膠葉片產生病斑，Sd后受害葉部位呈灰褐色時多主棒孢霉真菌在病斑處長出棒狀分生孢子。
【專利摘要】本發明涉及一種用于誘導橡膠樹多主棒孢霉真菌產孢方法，屬于生命科學技術領域。本發明方法包括：接種橡膠苗木準備、多主棒孢霉真菌培養、多主棒孢霉真菌接種、及誘導產孢步驟。本發明的有益效果在于：1、本方法保持多主棒孢霉真菌生長在原來的寄主，而且其生長及產孢的環境與野生環境相似，所產生的孢子形態與野生條件下形成的一致，避免了現有室內人工基質培養導致多主棒孢霉真菌孢子變異。2、接種環境條件能人工調控不受季節限制、便于操作，節約了人力物力及時間。
【IPC分類】C12N3/00, C12R1/645
【公開號】CN105586305
【申請號】CN201610124393
【發明人】蔡志英, 李國華, 穆洪軍, 劉一賢, 施玉萍
【申請人】云南省熱帶作物科學研究所
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年3月4日