一種長爪沙鼠的肝星狀細胞的分離和培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及肝星狀細胞的分離培養領域，具體涉及一種長爪沙鼠的肝星狀細胞的分禺和培養方法。
【背景技術】
[0002]肝星狀細胞(hepaticstellate cel I，HSC)，又稱儲脂細胞(Fat-store cell，FSC)、間質細胞，主要分布于肝細胞與肝竇內皮細胞之間的竇周隙內(Disse間隙)ASC在肝纖維化的發生發展中具有核心作用，是促進肝纖維化發展的主要因素。靜息狀態的HSC主要參與維生素A的代謝調節，當肝臟受到化學、物理及生物因素刺激而發生損傷后，HSC發生增殖并被活化，合成以膠原蛋白為主的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)及各類細胞因子如MMPs、TNF-a等，參與受損肝組織的修復。刺激持續發生時，HSC大量激活，引發ECM的合成與降解失衡，進而導致肝臟內結締組織異常沉積，發生肝纖維化。
[0003]肝星狀細胞是肝纖維化的主要效應細胞，在肝竇內，還有肝竇內皮細胞、kupffer細胞等。肝星狀細胞占整個肝臟細胞的8.00?13.00%左右，被認為是肝臟中主要的貯存和代謝維生素A的細胞。肝星狀細胞激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞，各種致纖維化因素均把HSC(肝星狀細胞)作為最終靶細胞，正常情況下肝星狀細胞處于靜止狀態。當肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，肝星狀細胞被激活，其表型由靜止型轉變為激活型。激活的肝星狀細胞一方面通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成和肝內結構的重建，另一方面通過細胞收縮使肝竇內壓升高。
[0004]國內一些作者采用原位灌流法分離HSC，因肝臟在體灌注，灌注液不易回收，酶的用量較大，且難以掌握酶灌流時的溫度，肝消化后摘取困難。目前針對大、小鼠分離培養HSC的方法已經較為成熟，但是國內尚無關于長爪沙鼠HSC的研究，而國外也尚未建立完善的培養體系，且長爪沙鼠HSC的研究不同于大、小鼠，彼此不能相互借鑒。
[0005]申請公布號為CN103805553A(申請號為201210455728.4)的中國發明專利申請公開了一種小鼠肝星狀細胞的分離方法，通過插管固定、灌注消化、細胞分散、小鼠肝星狀細胞分離等步驟完成對小鼠肝星狀細胞的分離。用上述方法得到了需要的小鼠肝星狀細胞，質量很好，比傳統大鼠的分離質量好很多，而且在整個過程比較便捷，在普通實驗室就能完成，很穩定，由于采用了小鼠，不用一些特殊的設備，降低了這種分離方法的成本，在得到高質量的小鼠肝星狀細胞，為進一步深入研究小鼠肝星狀細胞的生物學行為創造了條件。該技術方案采用原位灌流法分離HSC，因肝臟在體灌注，灌注液不易回收，酶的用量較大，且難以掌握酶灌流時的溫度，肝消化后摘取困難。同時該技術方案不適合用于長爪沙鼠HSC。

【發明內容】

[0006]針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種長爪沙鼠的肝星狀細胞的分離方法，能夠提高肝星狀細胞的產量和活率，可以保證HSCs純度。
[0007]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0008]一種長爪沙鼠的肝星狀細胞的分離方法，包括:
[0009]I)將長爪沙鼠的肝臟，先移入聯合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson鞘，粉碎肝臟呈糊狀，再移入混合酶液，攪拌消化，得到攪拌消化后的產物；
[0010]2)向攪拌消化后的產物中加入第一 Hank ’ s液，過濾，得肝組織;然后向肝組織中加第二Hank’ s液，初步離心，得沉淀；用第三Hank’ s液重懸沉淀，再向其加入Nycodenz液混勾，再次離心，得渾濁帶，渾濁帶即為分離得到的肝星狀細胞。
[0011]本發明的分離方法，成功地分離了長爪沙鼠的肝星狀細胞，簡便可行，并為進一步研究HSC與肝纖維化的關系奠定了基礎。同時，本發明方法能夠提高肝星狀細胞的產量和活率，可以保證HSCs純度，為進一步研究肝星狀細胞在肝損傷后細胞基質的沉積及纖維化的形成奠定了基礎。
[0012]以下作為本發明的優選技術方案:
[0013]步驟I)中，所述的長爪沙鼠的肝臟的獲得包括:對長爪沙鼠進行開腹，游離腹主動脈，向游離腹主動脈中灌注預灌注液，取下肝臟，即得到長爪沙鼠的肝臟。
[0014]所述的長爪沙鼠為生前體重400g左右(400g±50g)、營養狀況良好的長爪沙鼠；體重較輕者，可預先用維生素A處理，即通過維生素A灌胃，確保肝星狀細胞具有一定的浮力。
[0015]所述的預灌注液為4°C、含肝素25U/ml的Hank’s液。
[0016]所述預灌注液的用量為50ml/只。
[0017]所述的聯合酶液，由以下體積百分數的組分組成:0.02%?0.08%的鏈酶蛋白酶和0.05%?0.2%的膠原酶以及余量的Hank’s液，進一步優選，由以下體積百分數的組分組成:0.05 %的鏈酶蛋白酶、0.1 %的膠原酶以及余量的Hank’ s液。
[0018]所述的灌注消化的條件為:35°C?39°C灌注消化5?20min;進一步優選，所述的灌注消化的條件為:37°C灌注消化lOmin。
[0019]所述的混合酶液，由以下體積百分數的組分組成:0.02%?0.08%的鏈酶蛋白酶、
0.05%?0.2%的膠原酶、0.0005%?0.003%的DNaseI以及余量的Hank’s液。進一步優選為，由以下體積百分數的組分組成:0.05%的鏈酶蛋白酶、0.1 %的膠原酶、0.001 %的DNaseI以及余量的Hank’s液。
[0020]所述的攪拌消化的條件為:35 °C?3 9 °C攪拌消化1?2 O m i η;進一步優選，所述的攪拌消化的條件為:3 7 °C攪拌消化1?15m i η。
[0021 ] 步驟2)中，第一Hank’s液、第二Hank’s液和第三Hank’s液均為Hank’s液，可采用現有技術。
[0022]所述的過濾采用80目?120目的鋼絲篩，進一步優選，所述的過濾采用100目鋼絲篩。
[0023]所述的初步離心的條件為:300g?400g、5min?20min，進一步優選，所述的初步離心的條件為:350g、10min。
[0024]所述的再次離心的條件為:2°C?6°C、1200g?1600g、13min?23min。進一步優選，所述的再次離心的條件為:4°C、1400g、18min。
[0025]所述的Nycodenz液可選用20%Nycodenz液，由體積百分比20%的Nycodenz分離液和體積百分比80%的Hank’s液，即20%Nycodenz液由體積比20%:80%的Nycodenz分離液和Hank’s液制成。
[0026]本發明還提供了一種長爪沙鼠的肝星狀細胞的分離培養方法。
[0027]—種長爪沙鼠的肝星狀細胞的分離培養方法，包括:所述的長爪沙鼠的肝星狀細胞的分尚方法以及培養；
[0028]所述的培養包括:取分離得到的肝星狀細胞，以IX 15-1 X 16個/ml接種密度進行原代培養;當細胞融合度為80 %?90 %時，進行傳代培養。
[0029]優選地，所述的原代培養的培養基由體積百分數5%?15 %的胎牛血清和85 %?95 %的DMEM培養液組成;所述的原代培養和傳代培養的條件為:在35 °C?39 °C、由體積百分數2 %?8 % 0)2和92 %?98 %空氣組成的氣氛中培養。進一步優選，所述的原代培養的培養基由體積百分數10%的胎牛血清和90%的DMEM培養液組成;所述的原代培養和傳代培養的條件為:在37 0C、由體積百分數5 % 0)2和95 %空氣組成的氣氛中培養。空氣可優選為潮濕空氣，濕度50%?90 %。
[0030]本法采用離體膠原酶、鏈霉蛋白酶灌注法，每只雄性長爪沙鼠肝臟約獲得星狀細胞 1.5X107 個。
[0031]為提高細胞得率主要從以下方面進行改進:
[0032]1、一般選用體重400g左右、營養狀況良好的雄性長爪沙鼠較為合適。體重較輕者，可預先用維生素A處理雄性長爪沙鼠，確保肝星狀細胞具有一定的浮力，在密度梯度離心時較好地與其它細胞分離。
[0033]2、用4°C的預灌注液腹主動脈灌注，灌注液可以通過門靜脈與肝動脈進入肝臟，肝內血細胞沖冼得相對較為干凈，低溫灌注可以減少肝熱缺血對肝臟的損傷，取下肝臟后行門靜脈插管固定再行灌注與肝表面清洗，盡可能的減少血細胞對消化酶的活性產生的不良影響。
[0034]3、肝臟消化是否適度，是影響細胞得