用于檢測辣椒斑駁病毒的引物組合物及其應用、由其組成的試劑盒及試劑盒的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業科學技術領域，尤其涉及一種用于檢測辣椒斑駁病毒的引物組合物及其應用、由其組成的試劑盒及試劑盒的應用。
【背景技術】
[0002]辣椒斑駁病毒(/tefloerPepMoV)是辣椒上一種危害嚴重的病毒病，PepMoV是一種(+ )單鏈RNA病毒，是馬鈴薯Y病毒屬QPotyvirus),馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的確定種。該病毒通過蚊蟲以非持久性傳播，主要侵染包括辣椒、西紅柿等重要茄科作物。PepMoV的田間癥狀主要表現為植株矮縮，葉片花葉、斑點、萎縮，果實畸形，造成減產，以及更為嚴重的是造成果實的商品性降低，從而帶來巨大的經濟損失。該病毒最先在美國報道，隨后在韓國、墨西哥、日本等地相繼有危害的報道，對當地的茄科作物的生產造成嚴重影響。2011年在我國臺灣省報道有該病毒病的發生，而我國內陸尚無P印MoV發生危害的報道。2015年湖南省植物保護研究所從湖南和福建等省采集的辣椒上檢測到該病毒，為進一步了解該病毒的分布情況及其危害范圍，建立一套快速檢測辣椒斑駁病毒的方法刻不容緩。
[0003]目前針對P印MoV的檢測方法主要有電鏡觀察法，RT-PCR和qRT_PCR法，但這些方法都需要繁瑣的操作和昂貴的儀器，同時檢測過程需要長時間的擴增過程，以及繁瑣的電泳紫外觀察過程。

【發明內容】

[0004]本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種可特異性檢測檢測辣椒斑駁病毒的檢測試劑盒，還提供了該檢測試劑盒的應用方法，該應用方法可應用于辣椒斑駁病毒的快速診斷和鑒別，靈敏度高、特異性強，檢測方法方便快捷。
[0005]為解決上述技術問題，提供了一種用于檢測辣椒斑駁病毒的引物組合物，包括外引物和內引物，所述外弓I物包括外引物F3和外引物B3，所述外引物F3的DNA序列為SEQ IDN0.1所述的DNA序列，所述外引物B3的DNA序列為SEQ ID N0.2所述的DNA序列；所述內引物包括內引物FIP和內引物BIP，所述內引物FIP的DNA序列為SEQ ID N0.3所述的DNA序列，所述內引物BIP的DNA序列為SEQ ID N0.4所述的DNA序列。
[0006]上述的引物組合物，優選的，所述外引物F3的濃度為5 μΜ?10 μM ;進一步優選為ΙΟμΜ。所述外引物Β3的濃度為5μΜ?ΙΟμΜ ;進一步優選為10 μ Μ。
[0007]上述的引物組合物，優選的，所述內引物FIP的濃度為20 μ M?40 μ M ;進一步有選為40 μ Μ。所述內引物BIP的濃度為20 μΜ?40 μΜ;進一步有選為40 μ Μ。
[0008]作為一個總的技術構思，本發明還提供了上述引物組合物作為LAMP檢測的引物檢測辣椒斑駁病毒中的應用。
[0009]作為一個總的技術構思，本發明還提供了一種試劑盒，優選的，所述試劑盒包括上述引物組合物，還包括DNA聚合酶。進一步優選的，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。
[0010]上述的試劑盒，優選的，所述外引物F3、外引物B3、內引物FIP、外引物BIP、DNA聚合酶、cDNA 的體積比為:0.5: 0.5:1:1:1: 2。
[0011]上述的試劑盒，優選的，所述檢測試劑盒還包括RM反應緩沖液和DEPC水。
[0012]作為一個總的技術構思，本發明還提供了一種上述的檢測試劑盒在檢測辣椒斑駁病毒中應用。
[0013]上述的檢測試劑盒，優選的，所述應用方法為:
(O提取待測樣品的總RNA，并反轉錄為CDNA ;
(2)以步驟(I)中的cDNA為模板，采用所述的檢測試劑盒進行LAMP反應得到擴增產物；
(3)將所述步驟(2)中得到的擴增產物按照以下A、B中的一種或兩種方法進行檢測: A JpASYBR Green I顯色；如果變成綠色，則證明待測樣品中含有辣椒斑駁病毒，如果顏色為橙色，則證明待測樣品中不含辣椒斑駁病毒；
B:取擴增產物于進行電泳檢測，如果電泳結果顯示梯狀條帶，表明待測樣品中含有辣椒斑駁病毒，如果不顯示梯狀條帶，則待測樣品中不含有辣椒斑駁病毒。
[0014]上述的應用，優選的，所述步驟(2)中所述LAMP反應的溫度為60°C?64°C。
[0015]上述的應用，優選的，所述步驟(2)中所述LAMP反應的反應時間為45 min?120
mino
[0016]上述的應用，優選的，所述步驟(3)中所述電泳檢測為0.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0017]與現有技術相比，本發明的優點在于:
(I)本發明提供了一種可用于檢測辣椒斑駁病毒的引物，該引物根據辣椒斑駁病毒的核苷酸序列，選擇該序列中相對保守且特異區域4180?4378bp，利用LN832375上的對應區域通過在線引物設計軟件 primerExplorer V4 (http: //primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設計引物。本發明的引物3’端或5’端穩定性高，及引物二聚體等參數優于其他引物。
[0018](2)本發明提供了一種可用于檢測辣椒斑駁病毒的檢測試劑盒，可快速檢測辣椒斑駁病毒，靈敏度高、特異性強，檢測方法方便快捷。
[0019](3)本發明提供了一種采用檢測試劑盒檢測辣椒斑駁病毒的應用方法，采用環介導等恒溫核酸擴增技術(loop-mediated isothermal amplicat1n, LAMP)進行檢測，檢測方法快速簡便，靈敏度高。LAMP技術是近年來開發的一種新型的DNA擴增技術，該方法不需要如qRT-PCR的復雜操作和昂貴的實時定量PCR儀器，也不需要如RT-PCR長時間的擴增過程以及繁瑣的電泳紫外觀察過程。LAMP方法從采樣到得出結果的全過程僅需lh，并且靈敏度遠高于傳統的檢測方法；更重要的是，可用目測比色直接判斷反應結果。LAMP技術在恒溫下即可直接進行基因擴增反應，不需要長時間的溫度循環；且擴增反應特異性高、效率尚O
【附圖說明】
[0020]為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整的描述。
[0021]圖1為采用熒光染料檢測實施例2中的擴增產物中是否含有PepMoV的檢測結果圖。
[0022]圖2為采用實施例2中RT-LAMP方法檢測P印MoV的效果圖，圖中，I為0.147 μ g/μ I ；2 為 0.147 X 10 1 μ g/ μ I ;3 為 0.147 X 10 2 μ g/ μ I ;4 為 0.147 X 10 3 μ g/ μ I ;5 為 0.147X10 Vg/μ I ;6 為 0.147 X 10 5 μ g/μ I ;7 為 0.147X10 Vg/ μ I ;8 為0.147X 10 7 μ g/μ I ;9 為 0.147X10 Vg/μ I cDNA ;10 為陰性對照。
[0023]圖3為采用對比例I中RT-PCR方法檢測P印MoV的效果圖，圖中，I為0.147 μ g/μ I ；2 為 0.147 X 10 1 μ g/ μ I ;3 為 0.147 X 10 2 μ g/ μ I ;4 為 0.147 X 10 3 μ g/ μ I ;5 為 0.147X10 Vg/μ I ;6 為 0.147 X 10 5 μ g/μ I ;7 為 0.147X10 Vg/ μ I ;8 為0.147X 10 7 μ g/μ I ;9 為 0.147X10 Vg/μ I cDNA ;10 為陰性對照。
[0024]圖4為不同反應溫度條件對RT-LAMP反應效果的電泳圖，圖中M為標準分子量；1為 60°C ；2 為 61 °C ；3 為 62°C ；4 為 63°C ；5 為 64°C ；6 為 65°C ；7 為 66°C ；8 為陰性對照。
[0025]圖5為不同反應時間條件對RT-LAMP反應效果的電泳圖，圖中M為標準分子量；1為 30min ；2 為 45min ；3 為 60min ；4 為 75min ；5 為 90min ；6 為 120min。
【具體實施方式】
[0026]以下結合說明書附圖和具體優選的實施例對本發明作進一步描述，但并不因此而限制本發明的保護范圍。
實施例
[0027]以下實施例中所采用的材料和儀器均為市售。
[0028]實施例1
根據辣椒斑駁病毒的核苷酸序列，選擇該序列中相對保守且特異區域4180?4378bp，利用LN832375上的對應區域通過在線引物設計軟件primerExplorer V4 (//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html)設計引物，通過比對引物相應的3’端或5’端穩定性及引物二聚體等參數，最終選取一組最合適的引物，具體為外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP。
[0029]其中，外引物F3的DNA序列為SEQ ID N0.1所述的DNA序列，具體為:CTTCAATGGCATTTAGAAGCT。
[0030]外引物B3的DNA序列為SEQ ID N0.2所述的DNA序列，具體為:CCGTATTGGATCATGTCACAA。
[0031 ] 內引物FIP的DNA序列為SEQ ID N0.3所述的DNA序列，具體為:GTGAACTCCACCTCTCTGCC-ACACTAATTGTAAGGTTTTGAAGG。
[0032]內引物BIP的DNA序列為SEQ ID N0.4所述的DNA序列，具體為:ACACAATTCCCAGTGAAATTAGTGG-TTGCTACCTGTGCCTTGA。
[0033]實施例2:
一種檢測試劑盒，包括:
外引物F3 (濃度ΙΟμΜ):0.5μ1 ;
外引物Β3 (濃度ΙΟμΜ):0.5μ1 ; 內引物FIP (濃度40μΜ):1 μ I ;
內引物BIP (濃度40μΜ):1 μ I ;
2 X RM反應緩沖液:12.5 μι ；
Bst DNA 聚合酶:1 μ I。
[0034]補充DEPC 水至:25 μ I。
[0035]一種本實施例中檢測試劑盒的應用方法，具體包括以下步驟:
Cl)提取植株總RNA:從福建、湖南等地采集病株，運用RT-PCR篩選出的辣椒斑駁病毒樣品，參照TRIzo1-A+ Reagents (TIANGEN)使用說明，提取辣椒斑駁病毒樣品中的總RNA，參照 Hiscript?II 1st strand cDNA synthesis Kit (Vazyme)使用說明，使用 Randomhexamers將總RNA反轉錄成cDNA。
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