Idh1/2基因突變檢測體系及其試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種基因突變的檢測產品W及該產品所用到的引物、探針、檢測體系， 屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 異巧樣酸脫氨酶（isocitratedehy化ogenase，IDH)是一類在Η駿酸循環中起重 要作用的酶家族，不僅在能量代謝、氨基酸和維生素合成中扮演重要角色，而且對該酶的活 性調節將直接影響IDH或IDH底物參與不同的生物途徑、發揮不同的生物功能。在哺乳動 物細胞中，IDH同工酶有Η種形式：依賴NAD的線粒體IDH，依賴NADP的線粒體IDH，依賴 NADP的胞質IDH。
[0003] 編碼依賴NADP的人異巧樣酸脫氨酶1(isocitratedehy化ogenase1，IDH1)的 基因位于染色體2q33. 3,其轉錄mRNA長2339bp，含有10個外顯子，編碼由414個氨基酸殘 基組成的異巧樣酸脫氨酶1，主要定位于細胞漿和過氧化物酶體。IDH1作用于一個稱為巧 樣酸周期的能量生成途徑。細胞溶質的IDH1突變是原發性人體腦瘤主要亞型的共同特點。 研究表明癌癥相關的IDH1突變使該酶具有新的作用，當精氨酸132突變為組氨酸時，活性 部位殘基所產生的結構變化傾向于減少IDH1對異巧樣酸鹽的氧化脫駿作用；催化NADK1依 賴性的還原反應，把α-麗戊二酸還原成2-居基戊二酸（2HG)。2HG作為異巧樣酸脫氨 突變后生成并累及的代謝廢物，一般在人體細胞中含量很低，如果大量累積，就會導致正常 細胞向惡性轉化。2HG通過對DNA、組蛋白甲基化、缺氧誘導因子Ια化ypoxiain化cible factor-1，HIFlα)和HIF2α的作用改變了基因的轉錄；2HG過多累積會直接抑制包括人體 內''組蛋白去甲基化酶"與DNA去甲基化酶在內的多個重要雙加氧酶的活力，雙加氧酶的活 力降低，改變細胞的增殖和生長方式，進而誘發腫瘤。已證實2HG的過度蓄積將導致患有先 天性2HG代謝異常的患者出現惡性腦瘤風險升高。同樣，在人體惡性神經膠質瘤部位，研究 發現2HG水平顯著升高。
[0004] 另一方面，化an等人發現IDH1突變會釋放他們稱為的"表觀遺傳混亂 (巧igeneticchaos)"而干擾一種能調控DNA甲基基團積累的酶的作用。送種"甲基化"能 開啟和關閉基因表達。IDH1突變的腦癌具有改變了的DNA甲基化模式；同時他們還發現表 達突變IDH1的星形膠質細胞發育出一個與DNA甲基化相呼應的像干細胞一樣的表型，表明 突變IDH1可能防止了分化。復旦大學的研究人員曾發現腫瘤衍生的IDH1突變會破壞酶 的親和力，導致酶與底物結合能力降低，并且突變的IDH1還能與野生型IDH1競爭底物，突 變的IDH1與底物結合形成二聚體，進一阻斷IDH1的活性；據此提出IDH1具有腫瘤抑制子 的作用，一旦ΙΜΠ發生突變失活則導致HIF-1通路發生改變促進腫瘤發生。
[0005] 編碼依賴NADP的線粒體ID肥酶的ID肥基因位于染色體15q26. 1。其轉錄mRNA 長1740bp，編碼由452個氨基酸殘基組成的異巧樣酸脫氨酶2.其與IDH1基因具有較高的 同源性，其突變同樣與腦膠質瘤的發生發展相關。
[0006] 研究表明，在12%的人腦膠質瘤中存在I畑1基因Argl32位點的突變。在 和IV膠質瘤中，送種突變率更是達到了 71. 37 % ,64.31 %和76. 42%。Yan等研究顯示， 17. 1%的膠質瘤患者攜帶有I畑1基因R132突變，1%患者攜帶ID肥基因R172突變。另據 mycancergenome網站的統計數據表明，神經膠質瘤中I畑1基因突變發生的頻率為33. 0%， ID肥基因突變發生的頻率為1. 7%，其中ΙΜΠ基因突變中87. 6%為C. 395G〉A(R132H)， 2. 9%為C.394C〉T(R132C);其中ID肥基因突變中 58. 2%為C.515G〉A(R172K)。IDH1/2 的 體細胞突變與神經膠質瘤病理亞型、遺傳圖譜和臨床特征緊密相關，已成為神經膠質瘤最 重要的分子標記之一。
[0007] 另一方面的研究還顯示I畑1和ID肥都參與了細胞內氧化損傷的防御機制，但 IDH1在脂質的代謝機制中起了重要作用。通過全基因組測序發現IDH1和IDH2突變存在 于急性髓系白血病（AML)、急性淋己細胞白血病（ALL)及骨髓增殖性疾病（MPD)中，在慢 性粒細胞白血病（CML)中尚未檢測到突變。2012年化tel等人的研究顯示，帶有正常核型 和核磯蛋白（Nueleo地osmin，NPMl)基因突變的病人中，IDH2基因突變與急性髓系白血病 (AML)預后良好相關。文獻報道ΙΜΠ和IDH2突變在原發性正常核型急性粒細胞白血病 (CN-AML)患者中的發生率分別為5. 5~9. 6%和3~11%，并認為具有ΙΜΠ和ID肥突變 的AML患者具有較低的CR,較高的RR和較短得0S。另據mycancergenome網站的統計數據 表明，在AML中，I畑2基因突變發生的頻率為6. 4%，I畑2基因突變發生的頻率為9. 1 %，其 中IDH1 基因突變中 34. 5%為C.3940T巧1320,24. 5%為C.395G〉A(R132H) ;ID肥基因突 變中 74. 8%為C.419G〉A(R140曲，20. 9%為C.515G〉A巧 172K)。
[0008] IDH1/2基因突變檢測對于膠質瘤和血液病患者意義重大，可輔助腫瘤病理正確診 斷、分型及分級，判斷腫瘤預后，指導臨床治療。同時該檢測對腫瘤發病機制的研究具有重 要意義，也有利于針對IDH1/2基因不同突變型的相關治療藥物開發。
[0009] 由于臨床上的需求，目前已有針對檢測I畑1/2基因突變的商業化應用，如廣州好 芝生物科技有限公司開發的"人類IDH1/IDH2基因突變檢測試劑盒"，其基于英光PCR-HRM 法，可檢測1~5%的基因突變。開發一種檢測IDH1/2基因熱點突變的產品，W實現更高靈 敏度、更低成本、更方便快捷的IDH1/2基因突變檢測是非常有必要的。

【發明內容】

[0010] 本發明要解決的技術問題是提供一種可W覆蓋多突變位點檢測，模板量低，且快 速、準確、高靈敏度的IDH1/2基因突變檢測體系及其試劑盒。
[0011] 本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是；一種IDH1/2基因突變檢測 體系，包括引物、探針和擴增阻斷引物；
[0012] 所述引物包括質控正向引物、檢測正向引物和通用反向引物；
[0013] 所述質控正向引物包括針對ΙΜΠ基因C394T/G395A位點核巧酸序列如SEQID No. 1所示的質控正向引物和針對ID肥基因G419A/G515A位點核巧酸序列如SEQIDNo. 2 所示的質控正向引物；
[0014] 所述檢測正向引物包括針對ΙΜΠ基因C394T突變位點核巧酸序列如SEQIDNo. 3 所示的檢測正向引物、針對IDHl基因G395A突變位點核巧酸序列如SEQIDNo. 4所示的檢 測正向引物、針對ID肥基因G419A突變位點核巧酸序列如SEQIDNo. 5所示的檢測正向引 物、針對ID肥基因G515A突變位點核巧酸序列如SEQIDNo. 6所示的檢測正向引物；
[0015] 所述通用反向引物作為檢測反向引物和質控反向引物使用，包括針對1畑1基因 C394T/G395A位點核巧酸序列如SEQIDNo. 7所示的通用反向引物和針對ID肥基因G419A/ 65154位點核巧酸序列如569 10齡.8所示的通用反向引物；
[0016] 所述探針包括針對ΙΜΠ基因C394T/G395A位點的核巧酸序列如SEQIDNo. 9所 示的探針、針對ID肥基因G419A位點核巧酸序列如SEQIDNo. 10所示的探針和針對IDH2 基因G515A位點核巧酸序列如SEQIDNo. 11所示的探針，所述探針序列的5'端設有一種 英光標記，所述探針的核巧酸序列的3'端設有另一種英光標記；
[0017] 所述擴增阻斷引物是針對ID肥基因G419A位點核巧酸序列如SEQIDNo. 12所示 的擴增阻斷引物，所述擴增阻斷引物的核巧酸序列的3'端設有磯酸化修飾。
[0018] 本發明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是；一種IDH1/2基因突變檢 測體系，包括引物、探針和擴增阻斷引物；
[0019] 所述引物包括質控正向引物、檢測正向引物和通用反向引物；
[0020] 所述質控正向引物包括針對ΙΜΠ基因C394T/G395A位點核巧酸序列如SEQID No. 1所示的質控正向引物和針對ID肥基因G419A/G515A位點核巧酸序列如SEQIDNo. 2 所示的質控正向引物；
[0021] 所述檢測正向引物包括針對I的Π基因C394T突變位點核巧酸序列如SEQID No. 13所示的檢測正向引物、針對ΙΜΠ基因G395A突變位點核巧酸序列如SEQIDNo. 14所 示的檢測正向引物、針對ID肥基因G419A突變位點核巧酸序列如SEQIDNo. 15所示的檢 測正向引物、針對ID肥基因G515A突變位點核巧酸序列如SEQIDNo. 16所示的檢測正向 引物；
[0022] 所述通用反向引物作為檢測反向引物和質控反向引物使用，包括針