一種用于檢測c-kit基因突變的引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種用于檢測C-KIT基因突變的引物、 探針及相關試劑盒。
【背景技術】
[0002]C-KIT是一種原癌基因，位于染色體4qll_12,全長約80kb。C-KIT編碼的C-KIT 蛋白屬于III型受體酪氨酸激酶家族成員，它是分子量約為145KD的跨膜蛋白，包含了胞內 的酪氨酸激酶區、跨膜區和配體結合位點胞外區。當配體與其結合后能激活自身酪氨酸蛋 白激酶活性，通過一系列反應激活下游信號轉導通路，從而調節細胞的生長與增殖。
[0003]胃腸道間質瘤（GIST)是消化道最常見的間葉源性腫瘤。研究表明，在GIST患者 中C-KIT基因突變率約為90%。
[0004]目前Sanger測序法是C-KIT基因突變檢測的主要方法。然而，該方法的靈敏度低， 會導致漏檢及假陰性的發生，而且檢測時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求。臨床上迫切 需要開發一種高靈敏度、快速的C-KIT基因突變檢測技術。
[0005] 本發明的發明人在胃腸道間質瘤（GIST)的日常檢測中發現了與胃腸道間質瘤有 關的位于C-KIT基因的新突變位點，即1723-1728位缺失突變。本發明的發明人針對該突 變開發了一種快速、高靈敏、操作簡便的檢測試劑盒及相關的檢測方法，可以用于GIST化 療預后。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種用于檢測C-KIT基因突變的引物和探針，所述突變是 1723-1728位缺失6堿基突變（1723_1728del6,Q575_L576del)。本發明的引物與探針 包括如下序列：
[0007]正向引物（F) :GITTACATAGACCCAACACCTTA(SEQIDNo:1)
[0008]反向引物（R) :CCCTGITTCATACTGACCAA(SEQIDNo:2)
[0009]探針（PB) :CTCAGCCTGTITCTGGGAAACTCCC(SEQIDNo:3)
[0010] 本發明另一方面提供一種用于檢測C-KIT基因突變的檢測試劑盒，所述試劑盒包 括SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 2所示的引物和SEQIDNo. 3所示的探針。
[0011] 根據所采用的PCR方法，本發明的試劑盒還可以包括內參基因和內控基因。
[0012] 本發明另一方面提供一種用于檢測C-KIT基因突變方法，其包括以下步驟：
[0013] (1)針對C-KIT的突變位點，設計特異性引物和探針；
[0014] (2)提取檢測樣本中基因組DNA，檢測樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織、全 血和血漿等；
[0015] (3)建立實時熒光PCR擴增反應體系；
[0016] (4)根據熒光PCR儀顯示的Ct值判斷檢測結果：檢測反應體系的FAM熒光強度， 以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰性、陽性判定標準，Ct值> 38或 無擴增為陰性，ct值< 38為陽性。
[0017] 本發明采用了特異性引物和探針技術，可以特異性檢測C-KIT基因突變。此方法 靈敏度高、特異性強、檢測速度快。
【附圖說明】
[0018] 圖1為檢測陰性樣本的PCR圖。
[0019] 圖2為檢測突變陽性樣本的PCR圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體實施例，對本發明進一步闡述。應理解，這些實施例僅用于本發明而 不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照本領域技術人員熟 知的常規條件，或者按照制造廠商建議的條件。
[0021] 一 ?原理
[0022] 本發明的特異性引物與探針同DNA模板結合后，TaqDNA聚合酶以脫氧核苷酸 (dNTP)為底物，對內參基因（InternalReference，IR)及C-KIT基因突變型基因進行體外 擴增。檢測采用熒光PCR技術，通過特異性探針水解釋放熒光，監測PCR反應的進行，確定 C-KIT基因突變情況。
[0023] 本發明的試劑盒單獨設置了內參基因檢測體系。內參基因是區別于待檢C-KIT基 因的管家基因。通過檢測內參基因的擴增情況（FAM通道），可分析待檢DNA是否能被正常 擴增，從而排除DNA純度、濃度不佳，或者含有PCR抑制劑等造成PCR檢測失敗的情況。
[0024] 本發明的試劑盒在C-KIT基因突變型檢測體系中同時設置了內控基因（Internal Control，IC)檢測體系。兩種體系在同一PCR管中同時進行反應。內控基因也是區別于待 檢基因C-KIT的管家基因。將識別C-KIT基因突變模板的探針修飾為FAM熒光基團，而將 識別內控基因模板的探針修飾為ffiX熒光基團。通過檢測內控基因擴增情況（HEX通道）， 可分析待檢DNA是否能被正常擴增，從而排除漏加試劑或樣本、樣本含有PCR抑制劑等造成 PCR檢測失敗的情況。
[0025] 進行本試劑盒檢測結果判定時，陰性質控品（NC)中FAM、HEX通道檢測均應無擴增 (不呈典型的S型曲線。注：典型的S型曲線依次表現為指數期、直線期及平臺期）或無ct 值，陽性質控品（PC)中FAM、HEX通道檢測均應有擴增（呈典型的S型曲線）且Ct值彡28; 否則認為實驗無效，需重復實驗。
[0026] 二.實驗材料和設備
[0027] 1.針對突變位點設計合成特異性引物和探針
[0028] 針對C-KIT基因突變位點設計特異引物和探針。通過特異性引物和探針優化，以 便實現尚靈敏和快速檢測。
[0029] 優化后的引物與探針如下：
[0030]正向引物（F) :GITTACATAGACCCAACACCTTA(SEQIDNo:1)
[0031]反向引物（R) :CCCTGITTCATACTGACCAA(SEQIDNo:2)
[0032]探針（PB) :FAM-CTCAGCCTGTITCTGGGAAACTCCC-BHQ-1(SEQIDNo:3,含熒光標記）
[0033] 2.檢測樣本處理與DNA的提取
[0034] 檢測樣本可以是新鮮病理組織、石蠟包埋組織、全血、血漿和腹腔積液。以下僅以 石蠟包埋組織樣本為例進行說明。
[0035] 在樣本采集之前，病人未經過酪氨酸激酶抑制劑（tyrosinekinaseinhibitors， TKIs)類藥物治療；由于DNA樣品質量會影響檢測結果，因此應確定DNA樣品來源的石蠟包 埋組織樣本中含有癌組織細胞，并且不少于整個樣本的25% ;且DNA樣品0D260/0D280 = 1. 8±0. 2, 0D260/0D230 彡 1. 7 ;濃度為 5-10ng/y1。
[0036] 石蠟包埋組織樣本在室溫下保存時限不超過12個月，提取后的DNA樣品在_20°C 冷凍條件下保存時限不超過6個月。
[0037] 3.適用儀器
[0038] Stratagene Mx3000P〇
[0039] 4.試劑盒的組成
[0040] 試劑盒組成見表1。試劑盒中不含核酸提取成份，使用QIAampDNAFFPETissue Kit(Qiagen公司生產，貨號：56404)試劑盒完成石蠟包埋組織樣本DNA提取。檢測試劑組成 及C-KIT基因待檢突變位點見表2。IR檢測試劑只含內參基因檢測體系（FAM通道），C-KIT 檢測試劑同時含有C-KIT基因突變檢測體系（FAM通道）及內控基因檢測體系（HEX通道）。
[0041] 表1 :試劑盒組成
[0042]
[0043] 其中所述內參基因和內控基因的具體序列可以由本領域技術人員根據實驗情況 容易地確定。
[0044] 三.檢測方法
[0045] 1?使用QIAampDNAFFPETissueKit(Qiagen公司生產）試劑盒，按照使用說明 書進行石蠟包埋組織樣本DNA提取。
[0046] 2.取試劑盒中的檢測試劑以及陽性質控品（PC)。待檢測試劑及陽性質控品PC融 化后短暫離心，置于冰上。
[0047] 3.按17 : 0.3的體積比例混合IR檢測試劑和TaqDNA聚合酶，按17 : 0.3的體 積比例混合C-KIT檢測試劑和TaqDNA聚合酶。按17. 3/孔分裝IR檢測試劑和C-KIT檢 測試劑至八連管中。向裝有IR檢測試劑和C-KIT檢測試劑的八連管中分別加入2. 7y1待 檢DNA樣品、陰性質控品（NC，溶解DNA的緩沖液，由使用者自備）及陽性質控品PC，吹打混 勻，蓋緊管蓋后短暫離心。注意：混勻時不要使用漩渦振蕩儀；混勻后立即進行后續操作。
[0048] 4.熒光PCR儀檢測通道設定需同時選擇FAM、HEX通道（參比染料設置為"無"）。 反應程序設置如下（表2):
[0049]表 2 :
[0050]
[0051] 四.檢測結果的解釋
[0052] 1.Ct值確定：首先設定StratageneMX3000P熒光PCR儀的基線：選擇"適合基線 (Adaptivebaseline)"設定時的焚光信號，閾值（threshold)設定原則以閾值線剛好超過 正常陰性質控品NC擴增曲線（無規則的噪音線）的最高點，即令陰性質控品NC擴增曲線 顯示"NoCt"為準。從軟件中讀取各樣本在各位點檢測的Ct值。
[0053] 2.定性分析：
[0054] (1)實驗質量評判：若NC中FAM、HEX通道檢測均無擴增（不呈典型的S型曲線。 注：典型的S型曲線依次表現為指數期、直線期及平臺期）或無Ct值，PC中FAM、HEX通道 檢測均有擴增（呈典型的S型曲線）且Ct值< 28,則可繼續分析；否則認為實驗無效，需 重復實驗。
[0055] (2)待檢DNA樣品中內參基因（IR)檢測情況評判：若內參基因檢測（FAM通道） 有擴增且19 <Ct值< 25,則可繼續分析；若其Ct值較小，則認為DNA樣品濃度過高；若其 Ct值較大或無擴增，則認為DNA樣品濃度過低、發生降解，或其中可能含有PCR抑制劑。
[0056] (3)待檢DNA樣品中內控基因檢測情況評判：若內控基因檢測（HEX通道）有擴增 且Ct值< 25,則可繼續分析；若內控基因檢測（HEX通道）Ct值較大或無擴增，但突變位點 檢測（FAM通道）有擴增且Ct值< 38,則可繼續分析（可能由于突變位點擴增對內控基因 擴增產生抑制）；若內控基因檢測（HEX通道）Ct值較大或無擴增，而突變位點檢測（FAM通 道）無擴增或有擴增但Ct值> 38,則無法繼續分析，需重復實驗（可能由于DNA樣品發生 降解、其中含有PCR抑制劑或未加樣品）。
[0057] (4)待檢DNA樣品中基因突變情況評判：若樣品中某突變位點檢測（FAM通道）有 擴增且Ct值< 38,則判定該樣本突變結果為陽性；若Ct值> 38或無擴增，則判定該樣本 突變結果為陰性。
[0058] 注意：同一DNA樣品中可能同時存在多種突變。
[0059] 圖1為檢測結果為陰性的樣本的PCR圖，圖2為檢測結果為陽性的樣本的PCR圖。
[0060] 通過對比檢測，證實本發明的熒光PCR方法和傳統測序方法的結果是相符的，而 本發明的熒光PCR方法的靈敏度和選擇性高于傳統測序方法。
[0061] 因此，本發明熒光PCR反應體系可檢測C-KIT基因1723-1728位缺失6堿基突變， 檢測方便快捷，準確性高，可滿足C-KIT基因突變快速檢測的要求。
【主權項】
1. 一種用于檢測C-KIT基因突變的引物和探針，其特征在于，所述引物如SEQ ID No. I-SEQ ID No. 2所示，所述探針如SEQ ID No. 3所示。2. -種用于檢測C-KIT基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括SEQ ID No. I-SEQ ID No. 2所示的引物和SEQ ID No. 3所示的探針。3. 如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，其還包括內參基因和內控基因。
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測C-KIT基因突變的引物、探針及試劑盒。所述引物如SEQ？ID？No.1-SEQ？ID？No.2所示，所述探針如SEQ？ID？No.3所示。利用本發明的試劑盒進行實時熒光PCR，可以檢測C-KIT基因1723-1728位缺失突變。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105112500
【申請號】CN201510364301
【發明人】莫敏俐, 李暉, 陳釗, 丁鳳
【申請人】北京雅康博生物科技有限公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年6月29日