一種卡介菌多糖及其制備與分析鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥領域，具體涉及一種卡介菌多糖及其制備與結構表征方法。 技術背景
[0002]多糖作為生命活動的物質基礎之一包含豐富的生物信息，其來源廣泛，結構組成 復雜且差異大，具有多樣的生物活性，在生命科學研究中有極其重要的作用及應用前景。研 究表明多糖類及其衍生物，如許多植物和真菌多糖在免疫調節，抗腫瘤，抗凝，降血脂等方 面都具有顯著的藥理活性，近年來受到國內研究者的青睞，但有關細菌多糖的研究還比較 少。
[0003]卡介菌多糖核酸（Polysaccharide nucleic acid fraction of Bacillus Calmette Guerin, BCG-PSN)是我國首創的新型治療和免疫調節劑，其中多糖占70% W上， 核酸占20% W上，臨床上用于免疫調節、抗炎，抗過敏、抗腫瘤及輔助用藥。但是BCG-PSN組 成成分的復雜性，藥物作用的選擇性降低，不良反應增多；有效成分不明確，給藥物質量控 制研究，新型制劑開發，構效關系及作用機制闡釋造成了一定的困難，進而制約了卡介菌類 藥物的優化創新，影響了其藥用價值和在同類藥物中的市場競爭力。關于卡介菌多糖的結 構研究，國內外報道未見，送對闡釋卡介菌多糖的構效關系和作用機制帶來了挑戰。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種卡介菌多糖及其制備方法，并且對得到的高純度多糖化 學結構進行了鑒定闡釋，明確其有效成分，為優化現有卡介菌多糖核酸藥物、質量控制及深 入研究其構效關系和作用機制奠定基礎。具體方法和步驟如下：
[0005] -種卡介菌多糖，分子量為1. 78X104Da，W(1 - 4) -α-D-Glcp為主鏈，含有少量 的一 4, 6) -α-D-Glcp- (1 -分支的葡聚糖，平均每8個主鏈糖殘基含有1個分支，具有W下 結構：
[0006]
[0007] 進一步的，上述卡介菌多糖，由W下方法制備：
[0008] 1)取卡介菌多糖核酸原料，去離子水溶解，上DEAE-32纖維素色譜柱，W去離子水 為洗脫劑進行洗脫；
[0009] 2)將步驟1)收集的洗脫液減壓濃縮，透析袋透析，濃縮透析袋內洗脫液，冷凍干 燥，即得。
[0010] 進一步的，步驟1)中，DEAE-32纖維素色譜柱的規格為；2. 5*40畑1，用0. 5mol/L的 化Cl溶液平衡3個柱體積，再將多糖溶液樣品上樣，上樣后吸附5小時，去離子水洗脫3個 柱體積，收集洗脫液。
[0011] 進一步的，步驟2)中的透析袋截留分子量為3000化，，透析72小時，每5小時換一 次去離子水。
[0012] 上述卡介菌多糖的結構表征方法，其特征在于，包括W下步驟：
[0013] 1)取多糖樣品，采用高效凝膠滲透色譜法檢測多糖的純度和分子量；
[0014]。取多糖樣品，用P2〇e干燥，經邸r壓片，測定紅外光譜；
[001引如取多糖樣品，完全酸水解，N，0-雙（立甲基娃焼）立氣己醜胺衍生，GC-MS法檢 測單糖組成；
[001引 4)取多糖樣品，甲基化，水解，還原，己醜化，進行GC-MS分析，推斷單糖殘基連接 方式；
[0017] 5)取多糖樣品溶于〇2〇中，冷凍干燥，經過Η次〇2〇交換和冷凍干燥后，溶于〇2〇 中。測定核磁共振譜，檢測溫度為25°C。Wtrimethylsil^-propionicacid-d4為內標獲 得多糖的一維ih、"cnmr譜圖，W及二維相關譜伯-古cosy、ih-"c服QC)。
[0018] 進一步的，上述結構表征方法，步驟1)中采用高效凝膠滲透色譜法檢測多糖的純 度和分子量，用分子量分別為 180、2500、4600、7100、10000、21400、41100、84400、133800、 2000000化的DextranT標準品進樣繪制標準曲線。進樣濃度為2mg/mL的溶液，0. 45μm 濾膜過濾，取濾液50μL注入液相色譜儀；
[0019] 檢測條件
[0020] Agilent1200HPLC系統；AgilentG1311A泉；AgilentG1362A示差檢測器；
[0021] 色譜柱；ShodexOhpakSB-804冊凝膠色譜柱
[00過色譜條件：流動相；0.Imol/L化C1 (過濾、脫氣）；流速；0. 5血/min;柱溫；35°C; 示差檢測器溫度；35°C;進樣量；50ul。
[0023] 結合2)、3)、4)、5)所得的結果分析得到多糖的初級結構：該卡介菌多糖是W (1 一 4) -α-D-Glcp為主鏈，含有少量的一 4, 6) -α-D-Glcp-(1 -分支的葡聚糖，平均每8 個主鏈糖殘基含有1個分支。平面結構如下：
[0024]
[0025] 本發明得到的卡介菌多糖具有通過調節機體內細胞免疫、體液免疫、增強機體抵 抗力、抗過敏等功效，臨床上用于免疫調節、抗炎，抗過敏、抗腫瘤及輔助用藥。本發明通過 DEAE-32纖維素色譜柱層析，透析除鹽分離純化得到卡介菌多糖，該方法操作簡單高效，設 備要求低，不破壞其他有效成分。通過對分離得到的卡介菌多糖進行結構鑒定分析，為卡介 菌多糖核酸類藥物的分析鑒定和研究其構效關系奠定基礎。
【附圖說明】：
[0026] 附圖1.卡介菌多糖的HPGPC色譜圖。譜圖呈現單一對稱峰形，表明該多糖為均一 分子量多糖。
[0027] 附圖2.卡介苗多糖的單糖組成總離子流色譜圖。與混合單糖總離子流色譜圖對 比得知，該多糖由葡萄糖組成。圖中；a)阿拉伯糖，b)核糖，c，d)葡萄糖，e)D-甘露糖
[0028] 附圖3.卡介菌多糖的紅外光譜圖。由紅紅外譜圖所呈現的信息得知該多糖為 α-化喃葡聚糖。
[0029] 附圖4.卡介菌多糖的核磁共振氨譜。
[0030] 附圖5.卡介菌多糖的核磁共振碳譜。
[0031] 附圖6.卡介菌多糖的核磁共振Η-Η相關二維譜。
[003引附圖7.卡介菌多糖的核磁共振C-H相關二維譜。
【具體實施方式】：
[0033] 實施例1卡介菌多糖的制備
[0034] 取卡介苗多糖核酸樣品300mg適量去離子水溶解，上預先處理并用3倍柱體積的 0. 5mol/L化C1溶液平衡過得DEAE-32纖維素柱（2. 5*40畑1)，樣品吸附5小時。用去離子 水洗脫3個柱體積，收集洗脫液，濃縮至適量，用透析袋（截留分子量3000Da)透析72小 時，每5小時換一次去離子水。透析袋內的溶液7(TC濃縮冷凍干燥，得到白色固體多糖，得 率為34. 2%。所得卡介菌多糖用于W下實驗分析。
[0035] 理化性質及結構分析
[003引性狀；白色固體，易溶于水。
[0037] 紫外吸收：在200-800nm無吸收，硫酸蔥麗法顯色在630nm有強吸收峰。
[0038] 分子量及純度：分子量約1. 78X104Da，根據面積歸一法計算得知該分子量多糖純 度為99%。
[0039] 單糖組成：葡萄糖。
[0040]紅外光譜（cm1) :3417. 88, 2928. 07, 1023. 06, 1080. 12, 1154. 70, 933. 04, 847. 7 [00川多糖甲基化GC-MS分析；一 4)-Glcp-(l-構成多糖的主鏈，Glcp-α-為非還原 末端片段，一 4, 6)-Glcp-(1 -為分支，Η個片段的比例為：7.7:1.2:1. 1。詳見表1.
[0042] 核磁共振分析；各個片段的的碳氨信號歸屬，詳見表2.
[0043] 表1卡介菌多糖甲基化GC-MS分析結果
[0044]
[0047] 實施例2卡介菌多糖對免疫功能低下模型鼠的Τ淋己細胞亞群和細胞因子的影響
[004引1.免疫功能低下模型鼠的建立
[0049] 免疫功能低下小鼠模型是參照《抗炎免疫藥物藥效學指導原則.新藥（西藥）臨 床前研究指導原則匯編（藥學藥理學毒理學）》完成，即每天注射氨化可的松（lOOmg/kg， ic，0.Iml/lOg體重），每日1次，共進行7天。
[0050] 2.實驗分組
[0051] 試驗分為4組；正常動物對照組、免疫功能低下模型組、卡介菌多糖注射組（濃度 =l.Omg/ml，多糖含量96%)、市售卡介菌多糖核酸注射液組（濃度=l.Omg/ml，多糖含量 W75%，核酸含量W15% )。
[0052] 卡介菌多糖注射組、卡介菌多糖核酸注射液組小鼠在造模前2周至造模期間，后 肢股部肌內注射相應的樣品（0.Iml/lOg體重），間日一次，末次給藥后24小時進行試驗。 正常動物對照組后肢股部肌內每天注射生理鹽水（ic，0.Iml/lOg體重），每日1次，共進行 21天。
[0053] 3.小鼠T淋己細胞亞群和細胞因子的檢測
[0054] ①總T細胞％ ;常規制備淋己細胞懸液，并用RPMI1640完全培養液調細胞濃度至 4X109個/L。用生理鹽水將SRBC洗3次，并用培養液調至1%濃度。在1ml塑料離必管 中，每管加入淋己細胞懸液和培養液各50μ1，37°C水浴中保溫1小時。再加入SRBC懸液 100μ1混勻，37°C水浴保溫10分鐘。離必（80化pm, 5分鐘）水浴2小時。將細胞輕輕懸 起，加100μ1 4%戊二醒固定液（用鋒酸緩沖液配制）混勻。計數前將上清液全部移除，加 生理鹽水100μ1和20倍稀釋的1 %美藍染色液100μ1染色，20分鐘后計數，即得總T細 胞％。
[0055] ②茶堿抵抗細胞花環％ ;在50μ 1淋己細胞懸液中加入含lOOmmol/L茶堿的培養 液50μ1混勻，其余步驟同上。
[0056] ⑨化、Ts細胞％;按下式計算。
[0057]
[0058]
[0059]Ts細胞％ = 100 %-Th細胞％
[0060] ④血清IFN-Y的測定：用ELISA方法，按試劑盒說明書進行。
[00川4.實驗結果
[006引小鼠連續皮下注射氨化可的松（l00mg/kg，l次/日）7天，可顯著降低總T細胞、 化細胞、Ts細胞數W及血漿IFN-Y水平；卡介菌多糖注射組、市售卡介菌核酸多糖核酸注 射液組可升高總T細胞、化細胞、Ts細胞數W及血漿IFN-Y水平，詳見表3。
[0063] 表3卡介菌多糖對小鼠細胞免疫功能的影響（.ν±Λ.，n=9-l())
[0064]
[0065] *P<0. 05, **P<0.Olvs正常動物對照組；"P<0.Olvs免疫功能低下組；
[0066] 實施例3卡介菌多糖對豚鼠生殖器單純瘡疹病毒化SV-2)感染的影響
[0067] 1.動物模型的建立
[0068]建模方法參見度ernateinDI，etal.JInfectDis，2001 ;183(6) :844)，即首先 用生理鹽水清洗外陰，干棉簽磨擦陰道數次，造成陰道粘膜損傷，然后用接有灌胃針頭的注 射器吸取服V-2(效價為104 一 6TCI^。，由中國科學院武漢病毒研究所提供）〇. 1ml，將針頭 插入豚鼠陰道內約3~4cm將病毒注入陰道彎塵后緩慢退出，用明膠海綿塞入陰道W維持 毒液，針頭上少許毒液滴在外陰，用玻璃棒輕輕涂抹均勻，使病毒滲入皮膚。
[006引2.動物分組