專利名稱：多糖粘液形成菌的靶基因缺失的制作方法
技術領域：
本發明涉及鞘氨醇膠多糖制備領域。特別地，其涉及用于改進制備鞘氨醇膠的菌株的定點基因方法。
背景技術：
鞘氨醇單胞菌(sphingomonas)菌株，例如ATCC 53159和ATCC 31461產生大量的莢膜多糖。盡管在某些條件下，多糖可以由細胞釋放[5，6]，但在具有豐富碳源的生長過程中(如發酵)，多糖牢固附著于細胞表面。提高丟坦糖膠(diutan)和吉蘭糖膠(gellan)發酵產率的嘗試受到莢膜性質的多糖的限制，所述莢膜性質的多糖可以破壞營養素的吸收。另外，如果用于多糖的生物合成的位點數量有限，就會有由各細胞能產生多糖的最大量。已經觀察到多糖吉蘭糖膠與細胞凝集有關，這是由于不產生任何多糖的突變體在懸浮液中均勻地生長[3]。這些細胞凝集塊可以干擾多種技術，例如通過光密度測定細胞數量，細胞的離心(例如用于分離DNA或蛋白質)，以及用于多糖純化的細胞分離或裂解。先前尚未確定與鞘氨醇單胞菌中多糖附著于細胞表面有關的附著機制和基因。已經分離了以粘液形式產生多糖的鞘氨醇單胞菌菌株ATCC31461、ATCC 31555、ATCC 31554和ATCC 21423的誘導突變體，但是未確定突變基因，且未公開誘導和篩選突變體的方法。已經分離了用于吉蘭糖膠[3，8]、丟坦糖膠[I]和鞘氨醇膠S-88[9]生物合成的基因。許多這些基因的功能通過生物化學試驗給出或者通過與數據庫例如GenBank中的已知功能的基因的同源性給出。例如，已經鑒定了與四糖重復單元[7，8]的裝配和前體dTDP-L-鼠李糖[3，9]的合成有關的基因。預期僅影響多糖附著于細胞表面的基因仍具有產生多糖的表型(即固體培養基和粘性發酵液上的粘液樣菌落)。除了不在基因簇中的用于吉蘭糖膠合成的四種基因外，還描述了跨越21kb的18種用于吉蘭糖膠生物合成的基因的基因簇。Harding N.E., Y.N.Patel, and R.Coleman,2004。伊樂藻鞘氨醇單胞菌ATCC 31461中具有吉蘭糖膠多糖生物合成所需的基因的結構。J Ind Microbiol Biotech 31:70_82，參考文獻3。其DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登錄號AY217008)。基因簇中的基因有gelM、gelN以及gell。構建了大多數相鄰基因gelM和gelN的缺失。通過插入滅活gell基因。gelM-gelN缺失株和gell突變株顯示產生數量有所減少的吉蘭糖膠和更具流動性的發酵液，且顯示所產生的吉蘭糖膠具有與野生株的吉蘭糖膠相同的組成。多糖至細胞的附著未有報道。伊樂藻鞘氨醇單胞菌的gelR、gelS及gelG基因似乎以與S_88sps基因簇中相同的順序存在于操縱子中，但不鄰近18個 基因的基因簇中的基因(參考文獻3)。GelR蛋白較其S-88同源物稍小(659和670個氨基酸相比)，具有49%的同源性，且與表層蛋白和其他膜蛋白具有同源性。gelR、gelS及gelG基因的DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登錄號AY220099)。該報道中未構建gelR的突變(參考文獻3)。Yamazaki等報道在基因spsR中具有突變的菌株仍為粘液樣，表明它們產生多糖，但多糖不具有流變學或附著于細胞的特征([9]和 T.J.Pollock 等，DNA segments and methods for increasingpolysaccharide production.U.S.Patent N0.5, 854, 034)。Yamazaki描述了四種鞘氨醇單胞菌菌株的典型突變體，其產生作為粘液而非附著于細胞的多糖。美國專利第6，605，461號。Yamazaki未描述如何篩選粘液表型的誘變培養物。Yamazaki未鑒定出哪個基因或哪些基因被誘變。Sa-Correia綜述了關于吉蘭糖膠合成的基因的分離的工作。Sa-Correia 1.,A.M.Fialho, P.Videira, L.M.Moreira, A.R.Marques and H.Albano0 Gellan gumbiosynthesis in Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461:Genes, enzymes andexopolysaccharide production engineering.J Ind Microbiol Biotechnol.29:170-176。Sa-Correia描述了某些基因的部分測序，包括urf32和urf26(=上述的參考文獻3的gelM和gelN)。這些基因的完整序列于2003年4月存放于GenBank (GenBank登錄號AY242074)。這些基因的功能未有報道。在GenBank遞交中，僅分別將基因urf32和urf26指定為推定的膜蛋白和推定的運輸蛋白。未存放gell或gelR的序列。Coleman描述了用于丟坦糖膠生物合成的基因的分離和某些基因功能的石開究° R.Coleman,2001, Cloning and analysis of Sphingomonas sp.ATCC53159polysaccharide genes.Master’s Thesis, San Diego State University。描述了 dpsM 和dpsN基因(由Coleman命名為orf3和orf4)，但未指明功能。描述了來自鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 31554的用于S-88多糖的生物合成的基因簇。Yamazaki M.，L Thorne, M.Mikolajczak, R.ff.Armentrout 和 T.J.Pollock.1996.Linkage of genes essential for synthesis of a polysaccharide capsule inSphingomonas strain S88 .J Bacteriol 178:2676_2687 和美國專利第 5，854，034 號。未描述基因 urf32 和 urf26 的功能(dpsM、gelM 和 dpsN、gelN 的同源物)和 spsl (gell、dpsl的同源物)。將spsR基因(gelR、dpsR的同源物)描述為編碼與細菌和真菌多糖裂解酶大不相似的蛋白。其DNA序列存放于GenBank中(登錄號U51197)。本領域仍需要改進制備工業上實用的鞘氨醇膠的方法和改進鞘氨醇膠的性質。

發明內容
本發明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和/或N的全部或部分；誘導所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N ;分離所述第二種細菌的子代，其中所述突變的片段已經整合入基因組并置換所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。在本發明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法的實施方案中，可通過擴增來分離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過合成來分離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過由基因組DNA的純化來分離所述基因組DNA的片段。本發明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA的兩個非連續片段，其中所述片段側鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和/或N ;將所述兩個非連續片段連接在一起；將所述連接的非連續片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N ;分離所述第二種細菌的子代，其中所述連接片段已經整合入基因組并置換所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。在本發明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法的實施方案中，可通過擴增來分離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過合成來分離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過由基因組DNA的純化來分離所述基因組DNA的片段。本發明提供了一種組合物，其含有丟坦糖膠多糖，所述丟坦糖膠多糖賦予流體對于由菌株ATCC 53159產生的等量丟坦糖膠增加的粘度。在本發明的一個實施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少30%。在本發明另一個實施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少40%。在本發明又一個實施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少50%。在本發明再一個實施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少60%。在本發明再一個實施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少70%。在本發明再一個實施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC 53159至少80%。在本發明再一個實施方案中，所述增加的粘度可以為大于菌株ATCC53159 至少 90%。本發明提供了一種分離和純化的鞘氨醇菌屬細菌，其含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N的一種基因或兩種基因的缺失。在本發明的一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以是伊樂藻菌種。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以不是伊樂藻菌種。在本發 明又一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以是與作為ATCC53159存放的細菌相同的菌種的鞘氨醇單胞菌亞種。在本發明再一個實施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是丟坦糖膠。在本發明再一個實施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是吉蘭糖膠。在本發明再一個實施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以不是吉蘭糖膠。在本發明再一個實施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是韋蘭糖膠。在本發明再一個實施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是鼠李糖膠。本發明的實施方案還提供了一種培養物發酵液，其含有本段上述的所有細菌，并且已經進行從培養物發酵液中除去細菌的步驟。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以不含有外源性DNA。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部gelM缺失。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部gelN缺失。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部dpsM缺失。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部dpsN缺失。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部gelM和gelN缺失。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。
本發明提供了一種制備鞘氨醇膠多糖的方法，其包括在適于制備鞘氨醇膠多糖的條件下于培養基中培養含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N的一種基因或兩種基因的缺失的分離和純化的鞘氨醇菌屬細菌，由此在所述培養基中制備鞘氨醇膠多糖。所述方法還可以包括從所述培養基中的細菌分離鞘氨醇膠多糖的步驟。在本發明的一個實施方案中，所述分離步驟可通過離心進行。在本發明另一個實施方案中，所述分離步驟可通過沉降進行。在本發明另一個實施方案中，所述分離步驟可包括使用堿處理培養基。在本發明另一個實施方案中，所述物理分離步驟可包括使用酶處理培養基。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是丟坦糖膠。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是吉蘭糖膠。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以不是吉蘭糖膠。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以是伊樂藻菌種。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以不是伊樂藻菌種。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以是與作為ATCC53159存放的細菌相同的菌種的鞘氨醇單胞菌亞種。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是韋蘭糖膠。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇膠多糖可以是鼠李糖膠。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部gelM缺失。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部gelN缺失。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部dpsM缺失。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部dpsN缺失。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部gelM和gelN缺失。在本發明另一個實施方案中，所述鞘氨醇菌屬細菌可以含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。本發明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因I的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因I的全部或部分；誘導所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I ;分離所述第二種細菌的子代，其中所述突變的片段已經整合入基因組并置換所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I。在本發明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法的實施方案中，可通過擴增來分 離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過合成來分離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過由基因組DNA的純化來分離所述基因組DNA的片段。本發明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因I中的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段，其中所述片段側鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因I ;將所述突變的片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I ;分離所述第二種細菌的子代，其中所述片段已經整合入基因組并置換所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因I。在本發明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法的實施方案中，可通過擴增來分離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過合成來分離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過由基因組DNA的純化來分離所述基因組DNA的片段。本發明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的全部或部分；誘導所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R ;分離所述第二種細菌的子代，其中所述突變的片段已經整合入基因組并取代所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R。在本發明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法的實施方案中，可通過擴增來分離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過合成來分離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過由基因組DNA的純化來分離所述基因組DNA的片段。本發明提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段，其中所述片段側鄰或含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因R ;將所述片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R ;分離所述第二種細菌的子代，其中所述片段已經整合入基因組并取代所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因R。在本發明所述制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法的實施方案中，可通過擴增來分離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過合成來分離所述基因組DNA的片段。在本發明方法的實施方案中，可通過由基因組DNA的純化來分離所述基因組DNA的片段。根據本發明的一個實施方案，提供了一種制備細菌的方法。所述細菌是鞘氨醇單胞菌屬，并含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的M、N、I或R基因的一種或多種基因的突變。在某些出版物中(例如參考文獻8和9)，所述基因M和N還分別稱為urf2、urf26基因(未知的閱讀框)。分離了鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA片段。所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成 基因簇的基因M和/或N或I或R的全部或部分。誘導所述片段中的片段以形成突變的片段。將所述突變的片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌。所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分離了所述第二種細菌的子代，其中突變的片段整合入所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因組并置換的野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇單胞菌可以是伊樂藻菌(伊樂藻菌)或者不是伊樂藻菌。根據本發明另一個實施方案，提供了制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的另一種方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細菌含有選自鞘氨醇多糖生物合成基因簇的基因M、N、I和R的一種或多種基因的突變。分離了鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組DNA的兩個非連續片段。所述片段側鄰或包括鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N。相似地，可分離側鄰基因I或R的片段。將所述兩個非連續片段連接在一起。將所述連接的非連續片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌。所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分離了所述第二種細菌的子代，其中所述連接的片段整合入所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因組并置換野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇單胞菌可以是伊樂藻菌或者不是伊樂藻菌。根據本發明又一個實施方案，提供了一種組合物。所述組合物含有吉蘭糖膠多糖，所述吉蘭糖膠多糖賦予改進的流變學性質，包括凝膠強度。根據本發明又一個實施方案，提供了一種組合物。所述組合物含有丟坦糖膠多糖，所述丟坦糖膠多糖賦予液體較由ATCC53159菌株產生的等重的丟坦糖膠增加的粘度。根據本發明又一個實施方案，提供了分離和純化的鞘氨醇單胞菌屬的細菌。所述細菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M、N、I或R的一種或多種基因的突變。所述細菌可以在適于產生鞘氨醇膠多糖的條件下于培養基中培養而在所述培養基中產生鞘氨醇膠多糖。所述細菌的培養物發酵液可以直接或在使用乙醇沉淀之后用作增粘劑或膠凝劑。可選地，所述培養物發酵液可進行下述步驟:在其用作增粘劑或膠凝劑之前從所述培養物發酵液去除細菌或從所述發酵液回收。所述鞘氨醇單胞菌可以是伊樂藻菌或者不是伊樂藻菌。一經閱讀該說明書，對本領域技術人員來說顯而易見的這些和其他實施方案提供了本領域用于制備增粘劑和膠凝劑的新的方法、菌株以及組合物。附圖簡述

圖1.鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 31554,ATCC 31461和ATCC 53159中多糖生物合成的基因簇的比較。圖2.S60WTC gelM-gelN突變體的粘液形成特征。圖3.S60WTC gelN和gell突變體的粘液形成特征。圖4.dp SN的缺 失位點的DNA序列(SEQ ID NO: 19)，和融合肽的氨基酸序列(SEQID NO:20)。圖5A-5C.dp SN突變體的粘液形成特征。圖6A-6B.dpsM突變體的粘液形成特征。
具體實施例方式在兩種鞘氨醇單胞菌菌株中，已經鑒定了控制多糖附著于細菌細胞的的基因。gelM(dpsM)和gelN(dpsN)任一者或二者的缺失或gell的失活導致多糖作為粘液釋放至培養基中而非作為莢膜多糖附著于細胞表面。粘液型多糖的形成使得細菌培養物易于處理，改進了在發酵過程中的混合，可以增加產量，且在某些情況下，改進多糖的流變學性質。定點誘變基于多種原因較隨機誘變用于篩選粘液形成突變體更有利，所述多種原因包括速度和無關突變的避免。發現基因gelR的失活可以改進粘液形式的膠凝多糖的流變學性質(凝膠強度)。可以對任何鞘氨醇單胞菌菌株中的dpsM、dpsN、gelM、gelN和gell的直向同源物進行滅活以獲得粘液形成表型。可以對gelR的直向同源物進行滅活以防止多糖降解，從而導致改進的流變學性質。合適的鞘氨醇單胞菌包括但不限于產生鼠李糖膠(rhamsan，ATCC 31961)、韋蘭糖膠(welan，ATCC 31555)、吉蘭糖膠(ATCC 31461)和丟坦糖膠(ATCC53159)的那些菌株，以及產生多糖的菌株 S7(ATCC 21423)、S88 (ATCC 31554)、S198 (ATCC31853)和 NWll (ATCC 53272)。ATCC 號指美國典型培養物收藏所(American Type CultureCollection)的菌株的存放號。這些細菌通過伊樂藻菌ATCC 31461和鞘氨醇單胞菌ATCC53159來舉例說明，但也可以使用其他菌株。可使用的合適的鞘氨醇單胞菌包括adhaesiva鞘氨醇單胞菌，aerolata鞘氨醇單胞菌，alaskensis鞘氨醇單胞菌，aquatilis鞘氨醇單胞菌，aromaticivorans鞘氨醇單胞菌，asaccharolytica鞘氨醇單胞菌，aurantiaca鞘氨醇單胞菌，莢膜鞘氨醇單胞菌，chlorophenolica鞘氨醇單胞菌，chungbukensis鞘氨醇單胞菌，下水道鞘氨醇單胞菌，海膽鞘氨醇單胞菌，伊樂藻鞘氨醇單胞菌，faeni鞘氨醇單胞菌，herbicidovorans鞘氨醇單胞菌，koreensis鞘氨醇單胞菌，macrogoItabidus鞘氨醇單胞菌，mali鞘氨醇單胞菌，melonis鞘氨醇單胞菌,游泳池鞘氨醇單胞菌，parapaucimobilis鞘氨醇單胞菌，paucimobilis鞘氨醇單胞菌，pituitosa鞘氨醇單胞菌，樓桃鞘氨醇單胞菌，玫瑰鞘氨醇單胞菌，sanguinis鞘氨醇單胞菌,鞘氨醇單胞菌，stygda鞘氨醇單胞菌，subarctica鞘氨醇單胞菌，suberifaciens鞘氨醇單胞菌，地下鞘氨醇單胞菌，tae jonensis鞘氨醇單胞菌，terrae鞘氨醇單胞菌，trueperi鞘氨醇單胞菌，ursincola鞘氨醇單胞菌，wittichii鞘氨醇單胞菌，xenophaga鞘氨醇單胞菌，yabuuchiae鞘氨醇單胞菌，以及矢野鞘氨醇單胞菌。可根據基因定位和鞘氨醇膠生物合成基因簇中的結構、根據總的同源性和/或根據結構域同源性鑒定直向同源物。通常，與dpSM、dpSN、gelM、gelN、gelI或gelR基因之一的總的同源性的水平將大于44%，常大于55%、66%、77%、88%或98%。直向同源物理想地與這四種基因的至少之一具有大于80%的同源性。定點誘變可用于在所需的已知靶基因或基因組區產生突變。這消除了隨機誘導的誘變或自發誘變的試驗與誤差。缺失 的形成確保了突變將不會復原，例如可能在點(替代)突變和插入突變中可見的。缺失也具有不應用外源性DNA的益處，例如藥物抗性標記或其他環境不需要的標記。基因組DNA的分離片段是不連接在正常情況下與其結合的基因組DNA的DNA，其含有鞘氨醇膠生物合成基因簇的M和/或N、I或R或側鄰的DNA。作為非限制性實施例，所分離的DNA可通過由天然來源純化、通過合成或通過擴增來獲得。所分離的DNA通常位于體外的DNA片段上，但是所分離的DNA還可以位于載體上，例如質粒或轉導噬菌體，其含有鞘氨醇單胞菌基因組的所需部分。側鄰的DNA通常來自緊鄰M和/或N、I或R的約500bp基因或約l_2kb基因內的基因組區。本領域任何已知的方法可用于將突變引入所分離的片段，所述片段含有鞘氨醇膠生物合成基因簇的基因M和/或N、I或R的全部或部分。例如，可使用限制性內切酶和再連接非連續的核苷酸而引入缺失。可通過擴增和連接基因的兩個非連續片段或側鄰靶基因的DNA的兩個非連續片段來形成缺失。可以使用核酸內切酶消化和連接在所分離的片段中產生插入。化學誘變可用于基因組DNA的分離片段。可選擇任何誘變方法并根據具體情況而使用。在誘導突變之后，基因組DNA的片段可再導入受者細菌。通常情況下，但不是一定，受者將是與片段的供者相同的物種。可使用本領域已知的任何方法用于將外源性DNA導入細菌。合適的方法包括但不限于電穿孔、接合、原生質體形成、氯化鈣沉淀和轉化、脂質體和病毒轉導。可根據具體情況選擇和使用任何核酸導入方法。如果導入受者細菌中的突變基因組DNA片段不具有復制自身的途徑，那么它必須在受者細菌中整合入復制子以得到維護。通常,這種整合事件將整合整個攝入的質粒。可以檢測導入的DNA上的標記，以鑒定所述DNA已經整合。為了檢測整合的實現，可以篩選或選擇所導入的DNA上的標記的喪失。實現該目的的合適的標記為本領域已知，且任何標記可用作此處的指示物。為了確定其中所導入的鞘氨醇膠基因取代了受者的野生型基因的分離株，可通過例如PCR測定DNA的大小或序列。如下文所證明的，通過鞘氨醇膠生物合成基因簇的基因M和/或N產生粘液形式的鞘氨醇膠，突變體可以較附著于細菌細胞上的形式具有改進的流變學性質。所述改進的流變學性質通過相同重量的材料提供更具粘力的能力而得到反映。所述改進可以是輕度的，例如至少5 %、10 %、15 %、20 %或25 %，或其可為更顯著的，相對于由形成莢膜的親代產生的鞘氨醇膠改進至少30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %。流變學性質可使用本領域已知的任何技術測定。合適的技術包括但不限于自來水溶液中的低切變率粘度(LowShear Rate Viscosity, LSRV),和高鹽溶液中的海水粘度(Sea Water Viscosity, SWV)。由例如gelN突變體產生的粘液形式的吉蘭糖膠和推定的裂解酶基因gelR的突變相結合導致高凝膠強度的吉蘭糖膠的形成。凝膠強度通常大于1000，而莢膜菌株通常產生凝膠強度為600至900但小于1000的吉蘭糖膠。根據本發明的純化細菌是已經被微生物學純化的細菌，例如使用液體稀釋技術或于固體培養基上劃線以形成單菌落。微生物學領域已知的標準技術可用于該目的。根據本發明的突變體可使用用于親代菌株相同或相似的技術來培養和增殖。所述突變體的液體培養物性質可以得到改進，允許增加通風和混合。所述突變體的培養物發酵液也可以提供較附著形式的多糖具有較高效的回收。另外，所述突變體還可以提供較附著形式的多糖具有改進的澄明度的產物。細菌可任選通過過濾、離心或通過沉降從所述突變體產生的多糖去除。所述培養物發酵液可根據需要在去除細菌之前或之后被化學、酶或溫度(熱或冷)處理。涉及吉蘭糖膠附著于細胞表面的伊樂藻菌ATCC 31461的基因為gelM和gelN(圖1,SEQ ID NO:13)和gell (圖1，SEQ ID NO:25)。已經構建了具有大部分基因gelM和gelN缺失從而產生粘液形成表型的菌株。已 經構建了 gelN特定缺失,并構建了基因gell的插入。這兩種突變均產生了粘液形成表型。在SEQ ID N0:13中，gelM和gelN的編碼序列分別位于核苷酸501-1382和1366-2064。在SEQ ID NO:25中，gell的編碼序列分別位于核苷酸501-1403。編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO:26。發現基因gelR的缺失導致粘液形式的吉蘭糖膠的凝膠強度改進。在SEQ ID N0:27中，gelR的編碼序列分別位于核苷酸478-2457。編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO:28。涉及丟坦糖膠附著于細胞表面的鞘氨醇單胞菌ATCC53159的基因為dpsM和dpsN(圖1，SEQ ID NO:14)，并根據與gell的同源性推測dpsl。已經構建了 dpsM和dpsN的各基因的缺失，兩者均產生了粘液形成表型。在SEQ ID NO: 14中，dpsM和dpsN的編碼序列分別位于核苷酸456-1337和1321-2019。編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO:18和17。對于本領域技術人員來說顯而易見的是，用于吉蘭糖膠合成的相同或相似的方法也可以用于丟坦糖膠合成。基因dpsl和dpsR的這種突變可容易構建。在SEQ ID NO:29中，dpsl的編碼序列分別位于核苷酸501-1472。編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO:30。在SEQ ID NO:31中，dpsR的編碼序列分別位于501-2498。編碼的氨基酸序列示于SEQ IDN0.32。上述公開內容大體上描述了本發明。本文所公開的所有參考文獻明確地通過引用并入。通過參考本文提供的下述具體實施例，可以獲得更完整的理解，所述實施例僅用于說明目的，不意于限制本發明的范圍。實施例1——吉蘭糖膠粘液形成突變體的制備對于伊樂藻鞘氨醇單胞菌的突變體的構建，使用了名為SeOwtc1的ATCC 31461的衍生物，其具有改進的DNA攝取。該菌株可容易地由本領域技術人員制備。PCR擴增用于擴增側鄰基因gelM-gelN的區域。見參考文獻3。通過雙交換同源性重組，將擴增的片段克隆至pL02載體中并通過接合導入S60wtc中以置換具有缺失的基因組上的基因gelM和gelNo載體pL02不在S60wtc中復制,所以對于卡那霉素抗性的最初選擇選擇了其中質粒通過同源重組整合入染色體的那些菌落。所述載體還含有基因sacB。該基因賦予了對蔗糖的敏感性。這種對蔗糖的選擇性可用于篩選喪失質粒的分離株并保留缺失或野生型基因的一個拷貝。C伊樂藻菌ATCC 31461具有低的DNA攝取效率，特別是大質粒(約10_7)。分離具有增加的DNA攝取效率的ATCC 31461的自發突變體。懷疑這些少數的細胞為成功的質粒受者,例如廣泛宿主范圍的質粒PLAFR3,表現受者群體具有增加的攝取該質粒DNA能力的突變。為了使得質粒喪失，在非選項性條件下增殖三種含有PLAFR3的轉接合子(即無四環素抗生素)，連續傳代約30代。檢測了三種獨立的質粒處理的菌株(即來自每一起始轉接合子的四環素敏感性衍生物)，所有三種顯示的增加的接合率(4.2X 10_3、0.6X 10_2以及
1.5X 10_2)，表現與野生型菌株相比具有IO5倍的增加。該增加的接合率是穩定的且可再生的。這些菌株之一被命名為S60wtc。見參考文獻3。)
使用提供轉移功能的pRK2013，并使用于YM_Sm(25ug/ml)_Km(7.5ug/ml)培養基上選擇的轉接合子，通過三親代偶配將含有gelM-gelN缺失區域的質粒導入S60wtc。鏈霉素防止大腸桿菌菌株的生長。分離卡那霉素抗性質粒整合體。蔗糖敏感性用于選擇消除載體的第二重組事件。在非選擇性條件下，即無抗生素，將五個分離株傳代兩次。然后將整分等份鋪于含有8%蔗糖的培養基上。分離蔗糖抗性菌落，并檢測卡那霉素敏感性。分離基因組DNA，并使用PCR測定哪些Kms分離株保留了缺失。對于缺失的預期大小的擴增片段由四種菌株的基因組DNA產生。于YM培養基上純化這四種缺失菌株。四種菌株均顯示比野生型粘性較小、較軟、較平坦且黃色較深。實施例2——gelM-gelN缺失菌株的特征在搖瓶發酵中評價gelM-gelN缺失分離株。與較堅固、粘度較大的S60wtc發酵液相比，Λ gelM-gelN培養物發酵液為液體且光滑。與S60wtc纖維相比，由突變菌株使用異丙醇沉淀產生較長、較厚的纖維。然而，缺失突變體的全部可沉淀物質的產量減少22%，且僅產生30%的野生型的發酵液粘度。所產生的吉蘭糖膠具有正常的糖、甘油和乙酰基取代基組成。使用幾種技術評價突變體的粘液形成特征，包括顯微鏡評價、細胞凝集、細胞沉淀物形成以及熱沉降試驗，如圖2所示。熱沉降試驗包括在高壓滅菌器中加熱吉蘭糖膠發酵液10分鐘以熔化吉蘭糖膠，然后將熱發酵液轉移至大試管中并在95°C過夜培養(以維持發酵液為液體)。對于莢膜菌株，細胞附著多糖并保持懸浮。對于粘液形成菌，細胞未附著多糖并在過夜培養過程中沉降。通過該試驗顯示gelM-gelN缺失菌株為粘液形成菌株。
對于離心試驗，在含有I %葡萄糖的DM2培養基中過夜培養菌株并在Eppendorf離心機中以最大速度進行離心。基因gelM-N的失活導致細胞表面多糖的附著完全喪失，使得細胞可通過離心而沉淀。通過顯微鏡評價,大部分S60wtc Δ gelM_N細胞游離并具有動力，而S60wtc處于樹膠基質中。在細胞培養物中，S60wtcAgelM-N細胞在懸浮液中生長，而S60wtc細胞形成凝塊。實施例3——吉蘭糖膠粘液形成突變體的構建構建了 gelN的缺失用于吉蘭糖膠生物合成。將PCR引物設計成擴增gelN基因的上游DNA片段(500bp)和下游DNA片段(40Ibp) [3]。使用的引物示于表I中。表1.用于構建gelN缺失突變體的引物
權利要求
1.一種鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其含有至少一種基因修飾，所述基因修飾包括基因R中的突變、插入或缺失。
2.權利要求1所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述基因R是gelR基因。
3.權利要求2所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述菌株產生吉蘭糖膠。
4.權利要求3所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述吉蘭糖膠是粘液形式的多糖。
5.權利要求3所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述吉蘭糖膠具有相比于由野生型鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 31461天然產生的吉蘭糖膠改進的凝膠強度。
6.權利要求1所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述基因R是dpsR基因。
7.權利要求6所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述菌株產生丟坦糖膠。
8.權利要求7所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述丟坦糖膠是粘液形式的多糖。
9.權利要求7所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述丟坦糖膠具有相比于由野生型鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 53159天然產生的 丟坦糖膠改進的流變學性質。
10.權利要求1所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，還含有將所述菌株從莢膜形成菌轉變成粘液形成突變體的第二種基因突變、插入或缺失。
11.權利要求10所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中將所述菌株從莢膜形成菌轉變成粘液形成突變體的所述第二種基因突變、插入或缺失是在基因N中。
12.權利要求11所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述基因N是gelN基因。
13.權利要求11所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述基因N是dpsN基因。
14.權利要求10所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中將所述菌株從莢膜形成菌轉變成粘液形成突變體的所述第二種基因突變、插入或缺失是在基因M中。
15.權利要求14所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述基因M是gelM基因。
16.權利要求14所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述基因M是dpsM基因。
17.權利要求10所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，將所述菌株從莢膜形成菌轉變成粘液形成突變體的所述第二種基因突變、插入或缺失是在基因I中。
18.權利要求17所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述基因I是gell基因。
19.權利要求17所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述基因I是dpsl基因。
20.權利要求1所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述突變體鞘氨醇單胞菌菌株是野生型鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 31461的變體，其中所述變體已被基因改造以消除gelR基因的表達。
21.權利要求1所述的鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其中所述突變體鞘氨醇單胞菌菌株是野生型鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 53159的變體，其中所述變體已被基因改造以消除dpsR基因的表達。
全文摘要
本發明涉及一種多糖粘液形成菌的靶基因缺失。本發明涉及鞘氨醇膠多糖制備領域。更具體地，本發明涉及一種鞘氨醇單胞菌突變體菌株，其含有至少一種基因修飾，所述基因修飾包括基因R中的突變、插入或缺失。
文檔編號C07G99/00GK103087940SQ20121032822
公開日2013年5月8日 申請日期2006年2月3日 優先權日2005年2月4日
發明者南茜·E·哈丁, 帕特洛·雅美尼, 拉塞爾·J·科爾曼 申請人:Cp凱爾科美國公司