在固體表面保存核酸的方法及其保存液的制作方法
【專利說明】在固體表面保存核酸的方法及其保存液
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技術領域
[0002]本發明涉及核酸的溫度保存，尤其涉及在固體表面保存核酸的方法及其保存液。
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【背景技術】
[0004]能夠從細胞裂解物和其他來源提取核酸的微流技術的發展促進了對生物樣品的核酸進行快速分析。快速提取方法可以與聚合酶鏈式反應(PCR)之類的擴增技術組合以從血液、組織、培養的細胞或其他生物材料的微量樣品中提取有用量的核酸。
[0005]然而，核糖核酸(RNA)是最難以保存的生物分子之一。因此，來自于生物樣本的RNA的提取和保存是一個難點，那些降解RNA的條件不僅包括但不限于用于提取或收集的RNA，pH值，溫度，還有最主要和特別的無處不在的強大的核糖核酸酶。
[0006]因此，RNA 一般需要存放在零下80度的環境下才能比較穩定，防止水解酶降解，保存最完整的RNA樣品。當前在環境條件下以液體狀態保存RNA的方法都集中在通過使用核糖核酸酶失活，例如,去垢劑,還原劑,過渡金屬，有機溶劑,螯合劑,蛋白酶,核糖核酸酶肽抑制劑，抗RNA酶抗體。大多數市售的RNA保存產品，但只能保存在液體狀態的RNA在室溫下幾天或幾周。
[0007]因此，業界需要可成功將RNA的收集和穩定保存在干燥的固相載體上。
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【發明內容】

[0009]為了克服現有技術的不足，本發明旨在提供固體表面保存核酸的方法及其保存液。
[0010]為了達到上述發明目的，本發明的一個方面為一種在固體表面保存核酸的方法，其特征在于，包括如下步驟:
(a)制備保存液；(b)設置固相載體，并將所述保存液放置在所述固相載體上；(c)使得所述保存液干燥，以形成固相保存介質；(d)使得核糖核酸與所述固相保存介質混合，以形成保存混合物?’及(e)使得所述保存混合物干燥，從而在所述固相載體上保存所述核酸。
[0011]—些實施例中，所述固相載體為金屬，并且所述金屬固相載體的表面形成有多個圓形槽。
[0012]一些實施例中，在所述圓形槽的內周壁涂覆所述保存液，并且在所述孔的底部涂覆纖維素膜。
[0013]一些實施例中，所述步驟(c)中，對所述保存液進行凍干，以形成所述固相保存介質。
[0014]一些實施例中，所述步驟(d)中，所述核糖核酸為液相核糖核酸，并且沿所述內周壁將所述液相核糖核酸滴入所述圓形槽。
[0015]一些實施例中，所述步驟(e)中，使得所述混合物自然風干。
[0016]—些實施例中，包括:液相保存基質；及金屬螯合劑。
[0017]一些實施例中，所述液相保存基質包括2-氨基-2 -羥甲基丙烷-1，3 - 二醇液(Tris),檸檬酸鹽緩沖液，或磷酸鹽緩沖液，或者它們的組合。
[0018]一些實施例中，所述液相保存基質還包括2 - (N-嗎啉代)乙磺酸(MES)，3，(N_嗎啉代)丙磺酸(M0PS)，或4 - (2 -羥乙基)_1 -哌嗪乙磺酸(HEPES)，或者它們的組合。
[0019]一些實施例中，還包括紫外保護劑，所述紫外線保護劑為氫醌單甲醚(MEHQ)，氫醌(HQ)，甲基氫醌(THQ)，抗壞血酸，或者它們的組合。
[0020]一些實施例中，還包括蛋白質變性劑，所述蛋白質變性劑為鹽酸胍，異硫氰酸胍(GITC)，精氨酸鈉，十二烷基硫酸鈉(SDS)，或尿素，或者它們的組合。
[0021]一些實施例中，還包括還原劑，所述還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)，2_巰基乙醇(2-ME )，或三(2-羧乙基)膦(TCEP )，或者它們的組合。
[0022]一些實施例中，還包括RNA酶抑制劑，所述RNA酶抑制劑為氧釩核糖核苷復合物(VRC)的核苷酸類似物，或市售的RNA酶抑制劑。
[0023]本發明的優點在于，現有檢測試劑盒一般是將樣本存放于核酸保存液，待回到實驗室后，使用其它提取方法進行提取，整個過程超過一個小時，如果樣本多的情況下，提取時間還會大大延長，因此，提取速度決定了標本的一半以上的檢測時間。本技術可以將細胞等樣本放入核酸提取保存液后，并使DNA穩定保存于核酸提取保存液中，節省實驗室提取核酸時間。
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【附圖說明】
[0025]結合附圖，參考下文對多個實施例的描述，可更全面地理解本發明，其中:
圖1示出了根據本發明實施例之方法的流程圖。
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【具體實施方式】
[0027]參見示出本發明實施例的附圖，下文將更詳細地描述本發明。然而，本發明可以以許多不同形式實現，并且不應解釋為受在此提出之實施例的限制。相反，提出這些實施例是為了達成充分及完整公開，并且使本技術領域的技術人員完全了解本發明的范圍。這些附圖中，為清楚起見，可能放大了層及區域的尺寸及相對尺寸。
[0028]應理解，本發明的描述/圖示為單個單元的部分可存在于兩個或兩個以上的物理上獨立但合作實現所描述/圖示之功能的實體。此外，描述/圖示為兩個或兩個以上物理上獨立的部分可集成入一個單獨的物理上實體以進行所描述/圖示的功能。
[0029]現通過詳細說明根據本發明的固體表面保存核酸的方法及其保存液的較佳具體實施例，以對本發明做進一步闡述。
[0030]本實施例中，可對血清、血漿、細胞進行保存和裂解。細胞可例如包括口腔脫落細胞、上皮組織細胞等。然而，本發明不限于此，而是可對任何合適的需要進行DNA裂解和提取的樣本進行保存。
[0031]根據本發明的實施例的核酸提取保存液，包括:緩沖液，非離子型表面活性劑，生物表面活性劑，及牛血清白蛋白。根據本發明的實施例，所述核酸提取保存液可對樣本進行保存和DNA裂解。本實施例中，所述樣本可為以陰道分泌物為代表的含有較多雜質和干擾物質的樣本。
[0032]緩沖液含10mM Tris-HCl，pH為8.3-9.Ο (室溫)，而在延伸溫度(72 °C)下，pH值接近7.2。緩沖液中含有一種二價陽離子，用于激活DNA聚合酶的活性中心，一般使用Mg2+，有時使用Mn2+。一般以MgC12的形式提供，標準濃度為1.5mM。Mg2+濃度的高低會影響擴增的特異性和產率。緩沖液中還含有50mM的鉀離子。有些緩沖液中還加入一些添加劑和共溶劑可降低錯配率，提高富含G+C模板的擴增效率。
[0033]本實施例中，所述緩沖液包括Tris-HCl,氯化鉀，或氯化鎂，或者它們的組合。較佳實施例中，Tris-HCl的含量為20 — 400毫摩爾/升，氯化鉀的含量為20 — 50毫摩爾/升，氯化鎂的含量為1 一 3毫摩爾/升。
[0034]提供水中的一個離子緩沖濃度，此為常用的緩沖體系。Tris是一種雙極性離子緩沖液，20°C 時其 pKa 值為 8.3，ApKa 值為-0.021/°C。因此，20mmol/l Tris-HCl (ρΗ8.3，20°C )。在實際PCR中，pH變化于6.8-7.8之間。改變反應液的緩沖能力，如將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9，有時會增加產量。
[0035]反應混合液中50mmol/L以內的KCl，pH8.9有利于引物的退火，鎂離子為DNA聚合酶酶催化過程中，結合到酶一底物結合體上，從而使催化反應的活化能更加降低。使得反應能夠進行。
[0036]本實施例中，所述非離子型表面活性劑為聚山梨酯或聚乙二醇辛基苯基醚，或者它們的組合。較佳實施例中，所述聚山梨酯的含量為0.01%-1%質量百分比，聚乙二醇辛基苯基醚的含量為0.01%-1%質量百分比。
[0037]本實施例中，所述聚山梨酯可選用吐溫20，以起到保護DNA聚合酶作用。所述聚乙二醇辛基苯基醚可選用Triton X-100，分子量為646.86 (C34H62011)，其能溶解脂質，以增加抗體對細胞膜的通透性。
[0038]本實施例中，所述生物表面活性劑為表面活性肽。較佳實施例中，所述表面活性肽的含量為0.01%-1%質量百分比。
[0039]牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛的應用，例如在western blot中作為Blockingage ;在酶切反應緩沖液中加入BSA，通過提高溶液中蛋白質的濃度，對酶起保護作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶的變性，能減輕有些不利環境因素如加熱，表面張力及化學因素引起的變性的。本實施例中，所述牛血清白蛋白的含量為1-3毫克/毫升。
[0040]此外，根據本實施例的核酸提取保存液，還可包括0.1-1%質量百分比的十二烷基硫酸鈉，0.01-1%質量百分比的蛋白酶K，及/或0.1-1%質量百分比的疊氮化鈉。
[0041 ] 較佳實施例中，根據本實施例的核酸提取保存液還包括脫氧核苷三磷酸(dNTP)。脫氧核苷三磷酸是DNA合成的底物，標準的PCR反應體系中含有等摩爾濃度的4種dNTP，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP，濃度一般為 350-600 毫摩爾 / 升。
[0042]較佳實施例中，為了進一步加快后續的DNA分解，所述核酸提取保存液還可包括
0.1-2 U /毫升的DNA聚合酶。本實施例中，所述DNA聚合酶可為Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶，Pwo DNA聚合酶，或Pfu DNA聚合酶。
[0043]現詳細描述根據本發明實施例的核酸提取保存液的實例。
[0044]需要30萬級及以下潔凈區，使用分子級別潔凈水，除水及緩沖液之外的所有成分采購自成家SIGMA，使用大型燒杯和磁力攪拌器。
[0045]實例一