一種用于快速檢測人類vkorc1和cyp2c9基因多態性的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術，具體涉及一種用于快速檢測人類VKORC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒及其使用方法。本發明所述試劑盒包括3對引物、3條探針、6條PNA序列，1對β-Actin內標引物及1條內標探針，還包括Mg2+的PCR反應緩沖液、dNTP混合物、Taq酶和ddH2O。利用本發明試劑盒能夠對VKORC1和CYP2C9基因多態性位點進行定性檢測，根據SNP位點進行兩管PNA-PCR熒光擴增反應，只需根據兩管熒光曲線是否起線就能進行結果判斷，不會產生人為誤差，假陽性和假陰性率低；本發明試劑盒更容易實現高通量檢測，更能滿足臨床使用。
【專利說明】-種用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試 劑盒及其使用方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術，具體涉及一種用于快 速檢測人類VKORCl和CYP2C9基因多態性的試劑盒及其使用方法。

【背景技術】
[0002] 華法林是目前廣泛應用的香豆素類口服抗凝藥，用于預防和治療血栓栓塞性疾病 的口服抗凝治療。但是華法林的劑量窗口較窄，不同病人的所需用量可以相差十倍以上。目 前研究發現，CYP2C9和維生素 K環氧化物還原酶（VKOR)基因多態性對華法林治療劑量的 影響逐漸被認識，其中他01?(：1(-16396/^)，0￥?209*2(430(：/1')和0￥?209*3(10754/〇多態 性位點與華法林治療劑量關系最為密切，這些位點多態性都與華法林代謝酶的損傷有關， 從而導致個體間和民族間華法林用量的差異。目前，國際華法林實施協會根據VKORCl和 CYP2C9基因多態性制定了詳細的華法林劑量計算公式，從而可以實現患者個體化給藥。
[0003] 目前，用于基因分型的檢測方法分為四類：測序法，聚合酶鏈反應-限制性片段長 度多態性技術（PCR-RFLP)、芯片法、熒光定量PCR法（qPCR)四種方法。
[0004] 測序法：先進行PCR擴增，得到含有目的SNP位點的PCR產物，然后純化PCR產物， 再對其進行測序，根據測序峰圖判讀基因型。優點：結果準確，測序法是基因多態性位點檢 測的金標準。但是其成本較高，操作繁瑣，試驗周期長，限制了其在臨床使用。
[0005] PCR-RFLP技術：先進行PCR擴增，得到含有目的SNP位點的PCR產物，然后對PCR 產物進行酶切，電泳檢測酶切條帶，根據酶切條帶進行判讀。優點：成本低，結果比較直觀； 缺點：有的多態性位點所在位置沒有合適的限制性酶切位點，需要人工引入突變，另外容易 造成產物污染，導致假陽性結果，同時操作繁瑣，試驗周期長。
[0006] 芯片法：先進行PCR擴增，得到含有目的SNP位點的PCR產物，然后將PCR產物與 突變探針、野生探針雜交，通過比較兩個探針雜交的信號強度判斷樣品基因型。缺點=PCR 產物需要進行后續分析，操作繁瑣；另外結果不好判讀，容易出現假陽性。
[0007] qPCR法：又分為ARMS-PCR法、HRM法和Taqman探針法。qPCR的優點是操作簡單， 試驗周期短，PCR產物無需進行后續分析即可判斷結果，因全過程在封閉的管內進行，減少 產物交叉污染。同時該方法操作簡單，檢測周期短。目前該方法已成為臨床常用的檢測方 法。
[0008] ARMS-PCR法又叫等位基因特異PCR，TaqDNA聚合酶缺少:V - 5'外切酶活性，在 一定條件下PCR引物3'末端的錯配導致產物的急劇減少，針對不同的已知突變，分別設計 突變引物、野生引物，2個引物主要是3'末端堿基不同。由于3'末端不配對的引物產物量 減少或不擴增，突變引物和野生引物的Ct值會有顯著差異，通過設定區分野生型和突變型 的閾值，當突變引物與野生引物Ct值差值（ACt)大于閾值時即為突變型。缺點：引物設計 困難，對于多態性位點還有大量GC或AT序列時，往往束手無策，同時結果判斷較為困難。
[0009] HRM法：高分辨率熔解曲線分析技術（High Resolution Melting，HRM)，有染料法 和熒光共振能量轉移（FRET)雙探針法等。染料法對熒光染料、PCR儀器要求較高，臨床檢 測比較少用。FRET (fluorescence resonance energy transfer, FRET)探針比較常用，羅氏 專利的FRET探針又稱為雙雜交探針。在SNP位點設計兩條FRET探針，當兩條探針和模版 互補、且相鄰的特異探針組成，上游探針的3'端標記供體熒光基團，相鄰下游探針的5' 端標記Red640受體熒光基團。當復性時，兩探針同時結合在模板上，供體基團和Red640受 體基團緊密相鄰，激發供體產生的熒光能量被Red640基團吸收，使得檢測探頭可以檢測到 Red640發出波長為640的熒光。當變性時，兩探針游離，兩基團距離遠，不能檢測到640波 長的熒光。FRET探針檢測的信號是退火時的實時信號，每次檢測信號始終嚴格對應模版的 數量，非累積信號，可以用于做Tm曲線進行SNP檢測。優點：一個SNP位點基因型，只需要 一管PCR完成檢測；缺點：根據HRM溶解曲線Tm值差異不容易判讀，不同基因型溶解曲線峰 圖差異不明顯。
[0010] MGB-Taqman探針法：Taqman探針是一種經典的定量PCR技術，現階段得到廣泛應 用，在PCR反應體系中加入一對引物的和一個特異性熒光探針，探針只與兩條引物之間特 異性模板結合，利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程。探針的5'端連接報告熒光，3' 端連接淬滅熒光，隨后進行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸 時，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下，淬滅 熒光不再能對報告熒光進行抑制，使得報告熒光發光。針對SNP位點分別設計兩個不同熒 光標記突變探針、野生探針，根據突變探針、野生探針熒光信號強度進行SNP位點基因型判 讀。缺點=Taqman探針需要采用MGB-Taqman探針，當SNP位點的上游和下游含有大量GC或 AT堿基時，MGB-Taqman探針的設計和合成非常困難，且價格非常昂貴。


【發明內容】

[0011] 本發明針對現有技術的不足，目的在于提供一種用于快速檢測人類VKORCl和 CYP2C9基因多態性的試劑盒及其使用方法，本發明提供的是一種基于PNA-PCR方法的基因 多態性檢測試劑盒，該試劑盒成本低廉、操作簡單、特異性和敏感性好，能夠快速靈敏地檢 測待測位點基因類型，從而準確對人類VKORCl和CYP2C9基因多態性進行基因分型。
[0012] 為解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現：
[0013] 一種用于快速檢測人類VKORCl和CYP2C9基因多態性的試劑盒，包括3對引物、3 條探針、6條PNA序列，1對β-Actin內標引物及1條內標探針序列，具體的包括：
[0014] 用于檢測VKORCl基因 -1639G位點的引物序列如SEQ NO. 1、SEQ NO. 2所示，探針 序列如SEQ NO. 7所示，PNA序列如SEQ NO. 10所示；
[0015] 用于檢測VK0RC1基因 -1639A位點的引物序列如SEQ NO. 1、SEQ NO. 2所示，探針 序列如SEQ NO. 7所示，PNA序列如SEQ NO. 11所示；
[0016] 用于檢測CYP2C9基因 430C位點的引物序列如SEQ NO. 3、SEQ NO. 4所示，探針序 列如SEQ NO. 8所示，PNA序列如SEQ NO. 12所示；
[0017] 用于檢測CYP2C9基因 430T位點的引物序列如SEQ NO. 3、SEQ NO. 4所示，探針序 列如SEQ NO. 8所示，PNA序列如SEQ NO. 13所示；
[0018] 用于檢測CYP2C9基因 1075A位點的引物序列如SEQ NO. 5、SEQ NO. 6所示，探針序 列如SEQ NO. 9所示，PNA序列如SEQ NO. 14所示；
[0019] 用于檢測CYP2C9基因 1075C位點的引物序列如SEQ NO. 5、SEQ NO. 6所示，探針序 列如SEQ NO. 9所示，PNA序列如SEQ NO. 15所示；
[0020] 用于β -Actin內標擴增的引物序列如SEQ NO. 16、SEQ NO. 17所示，內標探針序列 如SEQ NO. 18所示。
[0021] 按上述方案，所述的用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒還 包括Mg2+的PCR反應緩沖液、dNTP混合物、Taq酶和ddH 20。
[0022] 按上述方案，所述的用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒 還包括6個不同的陽性對照品和1個陰性對照品，所述陽性對照品為包含有VK0RC1基 因 -1639G、VK0RC1 基因 1639A、CYP2C9 基因 430C、CYP2C9 基因 430T、CYP2C9 基因 1075A 或 CYP2C9基因 1075C的重組質粒和包含有內標基因的重組質粒的混合物，所述陰性對照品為 不包含內標基因和目的基因位點的重組質粒。
[0023] 按上述方案，所述3條探針為Taqman探針，探針5'端的熒光基團為FAM，3'端的 淬滅基團為BHQl。
[0024] 按上述方案，所述1條內標探針為Taqman探針，探針5'端的突光基團為R0X，3' 端的淬滅基團為BHQl。
[0025] -種用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒的使用方法，包括 如下步驟：（1)提取待測人的基因組DNA作為檢測樣品；
[0026] (2)取1個PCR8聯管，在其中A?F 6個管中分別加入檢測樣品，另取一個PCR8 聯管，在A?F 6個管中分別加入6個不同的陽性對照品，再取一個PCR8聯管，在A?F 6 個管中分別加入陰性對照品；
[0027] (3)將PCR8聯管置于熒光PCR儀器中進行熒光PCR擴增反應，采集FAM和ROX熒 光信號；
[0028] (4)結果判斷：a.當陽性對照均有FAM和ROX熒光信號起線，陰性對照均無 FAM和 ROX熒光信號起線，檢測樣品均有ROX熒光信號起線時，判斷試驗成功；b.根據檢測樣品A 管和B管的FAM熒光信號是否起線判斷VK0RC1基因 -1639的分型，根據檢測樣品C管和D 管的FAM熒光信號是否起線判斷CYP2C9基因 430的分型，根據檢測樣品E管和F管的FAM 熒光信號是否起線判斷CYP2C9基因 1075的分型。
[0029] 按上述方案，所述PCR 8聯管中A和B管內含有與檢測人類VK0RC1基因 -1639分 型相關的PCR反應液，所述C管和D管內含有與檢測人類CYP2C9基因 430分型相關的PCR 反應液，所述E管和F管中含有與檢測人類CYP2C9基因 1075分型相關的PCR反應液，所述 PCR反應液包含與檢測基因位點相對應的引物、探針、PNA序列、內標引物及內部探針、Taq 酶、dNTP混合液、Mg2+的PCR反應緩沖液和CldH2O。
[0030] 按上述方案，所述陽性對照品為包含有VK0RC1基因 -1639G、VK0RC1基因 1639A、 CYP2C9 基因 430C、CYP2C9 基因 430T、CYP2C9 基因 1075A 或 CYP2C9 基因 1075C 的重組質粒 和包含有內標基因的重組質粒的混合物，所述陰性對照品為不包含內標基因和目的基因位 點的重組質粒。
[0031] 本發明試劑盒是基于PNA-PCR方法的基因多態性檢測試劑盒，其技術原理是：肽 核酸是（peptide nucleic acids,PNA) -類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它 是在第一代、第二代反義試劑的基礎上，通過計算機設計構建并最終人工合成的第三代反 義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了 DNA 中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對的形 式識別并結合DNA或RNA序列，形成穩定的雙螺旋結構。由于PNA不帶負電荷，與DNA和 RNA之間不存在靜電斥力，因而結合的穩定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA 間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜 交能力遠優于DNA/DNA或DNA/RNA，表現在很高的雜交穩定性、優良的特異序列識別能力、 不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA與互補DNA具有1個堿基不匹配時，其溶解溫度會下 降8°C?20°C，2個堿基不匹配時則完全不能雜交，當PNA與互補DNA完全匹配時，因其PNA 為肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵，所以能夠阻止DNA擴增。本試劑盒利用PNA的這些特性 進行人類VKORCl和CYP2C9基因多態性位點分型，此處以VKORCl基因 -1639分型為例說明 本發明試劑盒的工作原理：首先根據VKORCl基因 -1639G設計PNA序列1 (序列如SEQ ID NO. 10所示），根據VKORCl基因 -1639A設計PNA序列2 (序列如SEQ ID NO. 11所示），然 后對待測基因同時進行兩管PNA-PCR熒光PCR反應（即在進行熒光PCR反應時加入PNA序 列），其中一管PNA-PCR熒光PCR反應中加入PNA序列1，另一管PNA-PCR熒光PCR反應中 加入PNA序列2,當PNA與待測基因的DNA序列相匹配時，熒光PCR反應被阻斷，熒光PCR反 應無起線；當PNA與待測基因的DNA序列不相匹配時，熒光PCR反應順利進行，熒光PCR反 應有起線，因此可以根據兩管熒光PCR反應是否起線來判斷VKORCl基因 -1639的分型，所 述分型為純合野生型（僅一管PCR反應起線）、雜合型（二管PCR反應同時起線）或純合突 變型（僅一管PCR反應起線）。
[0032] 本發明的有益效果：
[0033] (1)利用本發明試劑盒能夠對人類VKORCl和CYP2C9基因多態性位點進行定性檢 測，根據SNP位點進行兩孔PNA-PCR熒光擴增反應，只需根據兩孔熒光曲線是否起線就能進 行結果判斷，不會產生人為誤差，假陽性和假陰性率低，客服了傳統ARMS-PCR方法需要根 據Λ ct值進行結果判斷，結果判定困難的缺點；
[0034] (2)本發明試劑盒所使用的熒光檢測探針為Taqman探針，該探針費用低廉；同時 本發明所有的反應全程閉管操作，PCR反應后不需要進行PCR產物純化、電泳、酶切、雜交 等，在節省了檢測成本的同時，大大縮短了檢測周期，提高了檢測的效率，另外降低了 PCR 產物污染引起假陽性的風險。
[0035] (3)本發明試劑盒中包括內標引物和探針，通過檢測內標基因，減少了因樣本提取 問題導致的假陰性。
[0036] (4)本發明中使用的PNA設計簡單，不需要進行特殊的修飾就可以滿足人類 VKORCl和CYP2C9基因多態性檢測分析。
[0037] (5)本發明試劑盒是采用PNA鉗夾熒光定量PCR技術平臺，相對于測序法、 PCR-RFLP、芯片法更容易實現高通量檢測，更能滿足臨床使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 附圖1是VKORCl基因 -1639純合野生型擴增曲線。
[0039] 附圖2是VKORCl基因 -1639雜合型擴增曲線。
[0040] 附圖3是VKORCl基因 -1639純合突變型擴增曲線。
[0041] 附圖4是CYP2C9基因 430純合野生型擴增曲線。
[0042] 附圖5是CYP2C9基因 430雜合型擴增曲線。
[0043] 附圖6是CYP2C9基因 430純合突變型擴增曲線。
[0044] 附圖7是CYP2C9基因 1075純合野生型擴增曲線。
[0045] 附圖8是CYP2C9基因 1075雜合型擴增曲線。
[0046] 附圖9是CYP2C9基因 1075純合突變型擴增曲線。
[0047] 附圖10是內標β -Actin基因擴增曲線。 具體實施方案
[0048] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。
[0049] 一種用于快速檢測人類VKORCl和CYP2C9基因多態性的試劑盒，試劑盒中包括以 下多態性檢測的3對引物，3條探針、6條PNA序列、1對β-Actin內標引物和1條內標探 針。
[0050] 用于VKORCl基因 -1639G位點檢測的引物、探針和PNA序列：
[0051] 上游引物：AGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAAC(SEQ ID NO. 1)
[0052] 下游引物：TGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT(SEQ ID NO. 2)
[0053] PNA 序列：ATTGGCCAGGTGC(SEQ ID NO. 10)
[0054] 探針：FAM-CCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGA-BHQ1 (SEQ ID NO. 7)
[0055] 用于VKORCl基因 -1639A位點檢測的引物、探針和PNA序列：
[0056] 上游引物：AGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAAC(SEQ ID NO. 1)
[0057] 下游引物：TGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT(SEQ ID NO. 2)
[0058] PNA 序列：ATTGGCCGGGTGC(SEQ ID NO. 11)
[0059] 探針：FAM-CCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGA-BHQ1 (SEQ ID NO. 7)
[0060] 用于CYP2C9基因 430C位點檢測的引物、探針和PNA序列：
[0061] 上游引物：GACGCTGCGGAATTTTGG(SEQ ID NO. 3)
[0062] 下游引物：CTACTCCATATCACTGACCTTAC(SEQ ID NO. 4)
[0063] PNA 序列：AGCATTGAGGACTGTG(SEQ ID NO. 12)
[0064] 探針：FAM-TCCACAAGGCAGCGGGCTTCC-BHQ1 (SEQ ID NO. 8)
[0065] 用于CYP2C9基因 430T位點檢測的引物、探針和PNA序列：
[0066] 上游引物：GACGCTGCGGAATTTTGG(SEQ ID NO. 3)
[0067] 下游引物：CTACTCCATATCACTGACCTTAC(SEQ ID NO. 4)
[0068] PNA 序列：AGCATTGAGGACCGTG(SEQ ID NO. 13)
[0069] 探針：FAM-TCCACAAGGCAGCGGGCTTCC-BHQ1 (SEQ ID NO. 8)
[0070] 用于CYP2C9基因 1075A位點檢測的引物、探針和PNA序列：
[0071] 上游引物：TGCAAGACAGGAGCCACATG(SEQ ID NO. 5)
[0072] 下游引物：CATGGAGTTGCAGTGTAGGAGAA(SEQ ID NO. 6)
[0073] PNA 序列：TCCAGAGATACCTTGAC(SEQ ID NO. 14)
[0074] 探針：FAM-CTGCCCCATGCAGTGACCTGTGAC-BHQ1 (SEQ ID NO. 9)
[0075] 用于CYP2C9基因 1075C檢測的引物和PNA序列：
[0076] 上游引物：TGCAAGACAGGAGCCACATG(SEQ ID NO. 5)
[0077] 下游引物：CATGGAGTTGCAGTGTAGGAGAA(SEQ ID NO. 6)
[0078] PNA 序列：TCCAGAGATACATTGAC(SEQ ID NO. 15)
[0079] 探針：FAM-CTGCCCCATGCAGTGACCTGTGAC-BHQ1 (SEQ ID NO. 9)
[0080] 用于β-Actin內標擴增的引物和探針序列：
[0081] 上游引物：TTTTCGGGCCAGCTTTCAG(SEQ NO. ID 16)
[0082] 下游引物：TTTCACACGTGCAATCAAAGG(SEQ ID NO. 17)
[0083] 探針序列：AACCTGACTGAGTTAGATATGCGCTTT(SEQ ID NO. 18)
[0084] 所述人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性檢測劑盒還包括含Mg2+的PCR反應緩沖 液、dNTP混合物、Taq酶和CldH 2O。
[0085] 所述人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性檢測劑盒還包括6個陽性對照品和1個陰 性對照品，所述陽性對照品為包含有VK0RC1基因 -1639G、VK0RC1基因 1639A、CYP2C9基因 430C、CYP2C9基因 430T、CYP2C9基因 1075A或CYP2C9基因 1075C的重組質粒和包含有內 標基因的重組質粒的混合物，所述陰性對照品為不包含內標基因和目的基因位點的重組質 粒。
[0086] 所述的3條探針為Taqman探針，該探針5'端的熒光基團為FAM，3'端的淬滅基團 為 BHQl。
[0087] 所述的內標探針為Taqman探針，該探針5'端的突光基團為R0X，3'端的洋滅基團 為 BHQl。
[0088] 實施例1探針，引物和PNA合成
[0089] 本發明所述探針、引物和PNA均在上海生工工程股份有限公司合成。
[0090] 實施例2試劑盒組成
[0091] 試劑盒的配置采用PCR8聯管形式配置，使用時僅需加入樣本/對照品和CldH2O即 可完成實驗配置，此種配置更為方便快捷，為優選配置。
[0092] 本實施例中試劑盒采用PCR8聯管形式配置，試劑盒配置及PCR8聯管的組成如下 表1、表2所不。
[0093] 表1試劑盒組成
[0094]

【權利要求】
1. 一種用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒，其特征在于，包括 3對引物、3條探針、6條PNA序列，1對β -Actin內標引物及1條內標探針，所述3對引物 的序列如SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 6所示，所述3條探針的序列如SEQ ID NO. 7?SEQ ID NO. 9所示，所述6條PNA序列如SEQ ID NO. 1(Γ?5所示，所述1對β-Actin內標引物的序 列如SEQ ID NO. 16?SEQ ID NO. 17所示，所述1條內標探針的序列如SEQ ID NO. 18所示。
2. 根據權利要求1所述的用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒， 其特征在于，還包括Mg2+的PCR反應緩沖液、dNTP混合物、Taq酶和ddH20。
3. 根據權利要求1所述的用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒， 其特征在于，還包括6個不同的陽性對照品和1個陰性對照品，所述陽性對照品為包含有 VK0RC1 基因-1639G、VK0RC1 基因 1639A、CYP2C9 基因 430C、CYP2C9 基因 430T、CYP2C9 基因 1075A或CYP2C9基因1075C的重組質粒和包含有內標基因的重組質粒的混合物，所述陰性 對照品為不包含內標基因、VK0RC1和CYP2C9基因多態性位點的重組質粒。
4. 根據權利要求1所述的用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒， 其特征在于，所述3條探針為Taqman探針，探針5'端的突光基團為FAM，3'端的洋滅基團 為 BHQ1。
5. 根據權利要求1所述的用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒， 其特征在于，所述1條內標探針為Taqman探針，探針5'端的熒光基團為R0X，3'端的淬滅 基團為BHQ1。
6. 權利要求1所述的用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒的使用 方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 提取待測人的基因組DNA作為檢測樣品； (2) 取1個PCR8聯管，在其中A~F 6個管中分別加入檢測樣品，另取一個PCR8聯管， 在A~F 6個管中分別加入6個不同的陽性對照品，再取一個PCR8聯管，在A~F 6個管中分 別加入陰性對照品； (3) 將PCR8聯管置于熒光PCR儀器中進行熒光PCR擴增反應，采集FAM和R0X熒光信 號； (4) 結果判斷：a.當陽性對照品均有FAM和R0X熒光信號起線，陰性對照品均無 FAM和 R0X熒光信號起線，檢測樣品均有R0X熒光信號起線時，判斷試驗成功；b.根據檢測樣品A 管和B管的FAM熒光信號是否起線判斷VK0RC1基因-1639的分型，根據檢測樣品C管和D 管的FAM熒光信號是否起線判斷CYP2C9基因430的分型，根據檢測樣品E管和F管的FAM 熒光信號是否起線判斷CYP2C9基因1075的分型。
7. 根據權利要求6所述的用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒的 使用方法，其特征在于，所述PCR 8聯管中A管和B管內含有與檢測人類VK0RC1基因-1639 分型相關的PCR反應液，所述C管和D管內含有與檢測人類CYP2C9基因430分型相關的 PCR反應液，所述E管和F管中含有與檢測人類CYP2C9基因1075分型相關的PCR反應液， 所述PCR反應液包含與檢測基因位點相對應的引物、探針、PNA序列、內標引物及內部探針、 Taq酶、dNTP混合液、Mg2+的PCR反應緩沖液和ddH20。
8. 根據權利要求6所述的用于快速檢測人類VK0RC1和CYP2C9基因多態性的試劑盒的 使用方法，其特征在于，所述陽性對照品為包含有VK0RC1基因-1639G、VK0RC1基因1639A、 CYP2C9 基因 430C、CYP2C9 基因 430T、CYP2C9 基因 1075A 或 CYP2C9 基因 1075C 的重組質 粒和包含有內標基因的重組質粒的混合物，所述陰性對照品為不包含內標基因、VK0RC1和 CYP2C9基因多態性位點的重組質粒。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293920SQ201410474967
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】葉倫, 王寧, 劉金水, 李雪梅, 李倩, 陳剛 申請人:武漢康錄生物技術有限公司