一種快速檢測色素蘇丹紅的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種快速檢測色素蘇丹紅的方法，本發明還涉及一種包被蛋白G的蘇 丹紅的ELISA檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 蘇丹紅是一種人工合成的偶氮類、油溶性的化工染色劑，被大量地用在生物、化學 等領域。
[0003] 蘇丹紅為親脂性偶氮化合物，外觀呈暗紅色或深黃色片狀晶體，難溶于水，主要包 括I、II、III和IV等4種類型。其中II、111和IV均為I的化學衍生物。由于國際癌癥研究機 構（IARC)將蘇丹紅歸為第3類可致癌物質，研究快速檢測蘇丹紅的方法，很有必要。
[0004] 目前，對蘇丹紅的檢測一般采用高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法及液 譜-質譜聯用法等，但上述方法操作復雜，價格較高。
[0005] 簡單快速有效的檢測方法是治理蘇丹紅濫用問題的關鍵。酶聯免疫吸附測定 法（ELISA)具有高效、靈敏、便于基層推廣等優點，而且可以直接采樣進行檢測，與HPLC、 GC-MS檢測有較高的一致性，目前已有應用于蘇丹紅快速檢測的報道，但常規的蘇丹紅 ELISA快速檢測試劑盒方法具有以下缺點：需要較高純度的抗體，且抗體利用率低、同一板 之內孔間變異較大。
[0006] -是抗體利用率低。現有技術方法是抗體直接與酶標板反應，由于抗體排列不規 貝1J，不能夠保證與抗原有效相結合（見圖1)。而且因為抗體利用率低，用量大，還需要較高 純度，造成檢測成本較高；
[0007] 二是，同一酶標板中的各孔間變異較大，影響檢測結果的準確性。如圖1所示。此 外，現有ELISA檢測方法是先包被抗原，然后加抗體，再加酶標二抗，然后再加顯色劑。步驟 較多，操作比較繁瑣。
[0008] 因此，如果能使得抗體Y排列較為整齊，保證抗體Y與抗原有效相結合，將能有效 利用抗體。既提高抗體利用率，降低檢測成本，又能提高檢測結果的準確性。
[0009] 蛋白G(Protein G)是從鏈球菌A、C和G群很多菌株的細胞壁及培養上清中提取 的能與IgG Fc片段特異性結合的蛋白。利用了蛋白G的功能，蛋白G是一種G型鏈球菌細 胞壁上的蛋白，能特異性的與多種動物抗體的Fc部位相結合，并且具有很高的親和力。通 過克隆了蛋白G的基因序列，在大腸桿菌中表達出了與抗體有高親和力的基因重組蛋白G。 將基因重組的蛋白G偶聯到酶標板上后，再進行抗體包被。將基因重組的蛋白G偶聯到酶 標板上后，降低了空間位阻，增加了重組蛋白G與蘇丹紅抗體IgG的結合能力，從而使抗體 的Fab端朝向外側，空間位阻不對抗原結合區域構成干擾，對酶標板先經蛋白G處理后，再 進行抗體包被，不僅可提高同一板內及不同板間的酶標孔的均一性，而且能提高抗體的利 用率。試驗表明，在不影響檢測性能的條件下，先經蛋白G預處理的ELISA試劑盒蘇丹紅抗 體的需用量僅為通常制備方法下抗體的需用量的十分之一。

【發明內容】

[0010] 本發明的目的是提供一種快速檢測色素蘇丹紅的方法。具體目的是提供一種提高 抗體利用率，降低檢測成本，又能提高檢測結果準確性的ELISA檢測方法和試劑盒。
[0011] 本發明利用了蛋白G的功能。檢測時，在酶標孔中先加蛋白G，蛋白G具有跟抗體 上Fc部分特異結合的特點，所以將蛋白G偶聯到酶標板上后，使抗體的Fab端朝向外側，從 而降低了空間位阻，不對抗原結合區域構成干擾，使抗體Y排列更加的整齊，增加了重組蛋 白G與蘇丹紅抗體IgG的結合能力，能夠保證Y有效的跟抗原相結合，提高抗體的利用率 (見圖2)。試驗表明，在不影響檢測性能的條件下，先經蛋白G預處理的ELISA試劑盒蘇丹 紅抗體的需用量僅為通常制備方法下抗體的需用量的十分之一。
[0012] 不僅如此，對酶標板先經蛋白G處理再進行抗體包被，還可提高同一酶標板內或 不同酶標板中各孔間的均一性，提高檢測的準確性。
[0013] 所述蛋白G(Protein G)是一種G型鏈球菌細胞壁上的蛋白，從鏈球菌A、C和G群 很多菌株的細胞壁及培養上清中提取得到。蛋白G能特異性的與多種動物抗體的Fc部位 相結合，并且具有很高的親和力。
[0014] 在實際應用中，所用的蛋白G也可以選用基因重組蛋白G，通過克隆蛋白G的基因 序列，在大腸桿菌中表達出與抗體有高親和力的基因重組蛋白G而獲得。蛋白G可以通過 市售方式，方便獲得。
[0015] 本發明的實施例1比較了傳統的方法和采用本專利的方法檢測蘇丹紅I，由試驗 結果可以看出可以只用原來的抗體濃度的十分之一，即可達到傳統方法的檢測效果；
[0016] 實施例1是采用和未采用蛋白G處理的試驗比較，其中：
[0017] 實驗1采用蛋白G處理，抗體用量為100微升，抗體濃度為1 :1000000 ;
[0018] 實驗2未采用蛋白G處理，抗體濃度稀釋比為1 :100000,為實驗1的10倍。抗體 用量未變，仍為100微升，
[0019] 從結果可看出：采用蛋白G處理后，不僅節約了 90 %的抗體用量，而且每個批次的 結果更加均勻，結果更一致。
[0020] 傳統ELISA檢測方法的步驟為：空白酶標板--包被抗體--加入標準物質或樣 品與酶標化合物競爭反應；
[0021] 本專利的步驟為：空白酶標板--包被一層protein G--包被抗體--加入標 準物質或樣品與酶標化合物競爭反應；
[0022] 本發明與傳統方法相比，最大的特點就是：通過這一技術處理，可以節省抗體用 量，減小板間板內的差異；同時通過優化抗體濃度以及酶標化合物可增加檢測的靈敏度。
[0023] 本發明建立的EL1SA檢測方法的具體步驟如下：
[0024] 1)制備包被有蛋白G的酶標板
[0025] 第一步：包被蛋白G
[0026] 用包被緩沖液將蛋白G稀釋到10~100 μ g/ml，按100 μ 1/孔加到空白酶標板的 微孔內，37°C孵育2h ;
[0027] 第二步：洗板
[0028] 取出酶標板甩掉板內液體之后，洗滌酶標板孔，洗滌2次；
[0029] 第三步：包被抗體
[0030] 用ΙΟηΜ ρΗ7· 4PBS緩沖液將抗蘇丹紅特異性單克隆抗體稀釋到10~100 μ g/ml， 按100 μ 1/孔加到酶標板的孔內，37°C孵育0. 5h ;
[0031] 第四步：洗板
[0032] 取出酶標板，甩掉板內液體之后，洗滌酶標板孔，洗滌2次；
[0033] 第五步，封閉
[0034] 用1 %魚皮明膠的封閉液，100~200 μ 1/孔，37°C孵育2h ;
[0035] 第六步，干燥
[0036] 取出酶標板甩掉板內液體，排干，37°C烘干3h ;得到包被蛋白G的酶標板；
[0037] 2)反應
[0038] 操作步驟如下：在步驟1)制備的酶標板的各微孔中，或加入50 μ 1系列濃度的蘇 丹紅標準品，或加入50 μ 1待測樣品提取液；之后，每孔中再加入50 μ 1酶標記蘇丹紅抗原， 此時每微孔內含100 μ 1溶液，25°C放置15min~60min ;
[0039] 3)洗板：取出酶標板甩掉板內液體，洗滌酶標板孔，洗1~5次，每次間隔20s，甩 掉板內液體并拍干板孔；
[0040] 4)加底物：加入底物顯色液放置10~20min，底物顯色液為含0. 8mmol/L過氧化 氫脲和0. 4mmol/L四甲基聯苯胺的pH7. 9的磷酸緩沖液溶液；
[0041] 5)終止：加入 2mol/L H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0042] 6)讀數：用酶標儀在主波長450nm，次波長630nm下檢測，測定每孔0D值。
[0043] 以上所述洗滌酶標板孔，是用PBST洗滌液洗滌酶標板孔，使用洗滌液200~ 400 μ 1/ 孔；
[0044] 所述系列濃度的蘇丹紅標準品，濃度為0~4. 05ng/ml，用0.0 lmol/L PBS緩沖液 配制；
[0045] 所述酶標記蘇丹紅抗原的濃度是1:5000~25000。
[0046] 為與傳統EL1SA檢測方法進行比較，本發明人按如下步驟進行了傳統的EL1SA檢 測：
[0047] 1)包被 ELISA 板：
[0048] 第一步：用10nM pH7. 4PBS緩沖液將抗蘇丹紅特異性單克隆抗體稀釋到0. 1~ 1 μ 1/ml，100 μ 1/孔；包被到ELISA微孔板內，37°C孵育0. 5h ;
[0049] 其余步驟與前述相同。
[0050] 結果表明，與傳統EL1SA檢測方法相比，本方法不僅特異性強、靈敏度高、精確性 和準確性高、操作簡便等優點，還可提高抗體的利用率，節省包被抗體的用量。
[0051] 本發明提供了一種蘇丹紅的ELISA檢測試劑盒，包括有常規蘇丹紅ELISA檢測試 劑和酶標板，其特征是，還含有蛋白G。
[0052] 所述常規蘇丹紅ELISA檢測試劑包括蘇丹紅I標準品、標記辣根過氧化物酶的蘇 丹紅I、樣本稀釋液、洗滌液、底物顯色液和終止液。
[0053] 所述樣本稀釋液為pH為7. 4的10mM PBS溶液。
[0054] 洗滌液為含 0· 2% Tween20pH 為 7. 4 的 0· 6M PBS 溶液。
[0055] 底物顯色液為含0. 8mmol/L過氧化氫脲和0. 4mmol/L四甲基聯苯胺的pH7. 9的磷 酸緩沖液溶液；
[0056] 終止液為含 2mol/L H2S04。
[0057] 本發明試劑盒使用方法：
[0058] 1.樣本前處理
[0059] 稱取2g樣本于離心管中，加入10mL乙腈，劇烈震蕩lOmin，室溫3000r/min以上離 心lOmin。移取5mL上清液于50°C環境下氮氣吹干。加入正己燒4mL禍動30S溶解干燥的 殘留物，加入lmLIMNaOH渦動15S，室溫3000r/min離心10min，移取lmL上清液于50°C環境 下氮氣吹干，加入〇. 5mLDMF充分溶解干燥的殘留物