沙丁胺醇半抗原和抗原的制備方法及其在量子點免疫熒光試劑盒中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種半抗原、抗原及其制備方法和應用，具體涉及一種沙丁胺醇半抗 原和抗原的制備方法及其在量子點免疫熒光試劑盒中的應用，用于檢測動物組織和尿液中 的沙丁胺醇殘留量，屬于免疫學檢測領域。
【背景技術】
[0002] 沙丁胺醇（SAL)為選擇性β2受體激動劑，臨床醫學上主要用于治療喘息型支氣 管炎、支氣管哮喘、肺氣腫所致的支氣管痙攣。同時，沙丁胺醇還有促進動物骨骼肌生長，減 少脂肪蓄積、提高飼料轉化率等作用，常被不法商家用作飼料添加劑。人食用了含沙丁胺醇 殘留的動物性食品，會出現肌肉震顫、心悸、過敏、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、呼吸困難等癥狀。 現在歐美各國均禁止其在畜牧生產上的應用，美國規定只能把它用于科研，我國農業部235 公告也明確規定沙丁胺醇及其鹽、酯為禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出。
[0003]目前檢測沙丁胺醇的方法主要有高效液相色譜法（HPLC)、氣相色譜-質譜法 (GC-MS)、液相色譜-質譜法（LC-MS)等，但這些方法都不同程度地存在著樣品前處理繁瑣， 對儀器設備以及操作過程的要求較高等缺點，不適于生產、基層單位及現場檢測。
[0004] 量子點免疫熒光檢測方法具有特異性強、穩定快速、操作簡單、自動化程度高等優 點，其檢測限比ELISA和理化檢測方法高幾個數量級。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種沙丁胺醇半抗原和抗原的制備方法及其在量子點免疫 熒光試劑盒中的應用。
[0006] 本發明提供的沙丁胺醇半抗原，為式（I)所示的化合物；
本發明還公開了式I所示化合物的制備方法，包括如下步驟： A:中間體sal-Ι合成：250ml三口瓶中加入2-溴-l-[4-羥基-3-(羥甲基）苯基] 乙-1-酮lOOOmg，二氯甲烷200ml，對甲苯磺酸3. 8mg，冰浴降溫至0-5度，滴加2, 2甲氧基丙 烷2208ul，室溫反應過夜，TLC檢測反應完全后處理，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌有機相，無 水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮得類白色固體1211mg(sal-l) ;B:中間體sal-2合成：100ml 三口瓶中加入中間體sal-1, 1140mg，無水甲醇40ml，冰浴降溫至0度，加入硼氫化鈉227mg， 0-5度反應2小時，TLC檢測反應完全后處理，反應液傾倒入冰水中，二氯甲烷萃取，飽和氯 化鈉水溶液洗滌有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮得類白色固體l〇18mg(sal-2); C:中間體sal-3合成：100ml三口瓶中加入中間體sal-2,lOOOmg，無水甲醇40ml，冰浴降溫 至〇度，加無水碳酸鉀1396mg，室溫反應2小時，TLC檢測反應完全后處理，過濾，5ml甲醇洗 滌濾餅，濾液減壓濃縮得油狀物體700mg(sal-3);D:中間體sal-4合成：100ml三口瓶中加 入中間體sal-3, 700mg，無水甲醇40ml，加三乙胺686mg，6_氨基-6-甲基-1-庚酸540mg， 回流反應12小時，TLC檢測反應完全后處理，減壓蒸除甲醇，二氯甲烷溶解殘留物，水洗，飽 和氯化鈉水溶液洗滌有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮得油狀物1008mg(sal-4); E:半抗原sal-5合成：100ml三口瓶中加入中間體sal-4,lOOOmg，無水甲醇40ml，冰浴降溫 至0-5度，滴加1M硫酸10ml室溫反應2小時，TLC檢測反應完全后處理，減壓蒸除甲醇，降 溫至10度析出白色固體，過濾，少量水洗滌濾餅，干燥后得白色固體600mg(sal-5)。
[0007] 本發明提供的沙丁胺醇抗原，是將式I所示化合物和載體蛋白偶聯得到的偶聯 物。
[0008] 常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（0VA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍蛋白（KLH)等。
[0009] 所述式I所示化合物與BSA偶聯得到的沙丁胺醇抗原的結構見式II:
本發明還公開了所述沙丁胺醇抗原的制備方法，包括如下步驟： ① 稱取7. 3mg半抗原溶于2mlDMF，加入EDC4. 3mg，NHS5. 2mg，室溫攪拌反應2h; ② 取50mgBSA溶于5ml0· 1M碳酸鈉緩沖液； ③ 將步驟1得到的半抗原溶液逐滴加入到步驟2得到的蛋白溶液中，室溫攪拌反應 24h，PBS4度透析72小時，期間換透析液6次；將透析液在無菌條件下過0. 22μm孔徑的 濾膜，分裝于安培瓶中，-20度保存。
[0010] 所述沙丁胺醇抗原可以作為免疫原制備沙丁胺醇特異性抗體，也可以作為包被原 制備微孔板。
[0011] 應用沙丁胺醇抗原制備得到的特異性抗體具體可為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0012] 所述沙丁胺醇抗原、所述特異性抗體均可應用于檢測沙丁胺醇。
[0013] 本發明還保護一種用于檢測沙丁胺醇的量子點免疫熒光試劑盒，包括量子點標記 的所述抗體。
[0014]"量子點標記的所述抗體"的制備方法具體如下： ① 取2. 5mg量子點，用pH4. 7、0. 1M的MES緩沖液洗滌，然后用lmlpH4. 7、0. 1M的MES 緩沖液重懸，加入〇· 96mgEDC和1. 15mgNHS，37°C反應30分鐘，20000rpm離心5min，收集 沉淀，即為活化后的量子點； ② 取步驟①得到的活化后的量子點，用pH8. 5、50mM的硼砂緩沖液洗滌，然后將2. 5mg 活化后量子點、所述抗體(蛋白質含量為〇. 15mg)和pH8. 5、50mM的硼砂緩沖液混勻（總體積 為0· 8ml)，25°C反應3. 5小時； ③ 取完成步驟②的液相，加入BSA并使其質量百分含量為5 %，3 7 °C反應3 0分鐘， 20000rpm離心5min，收集沉淀，用pH7. 4、0. 02M的PBS緩沖液洗滌，用lmlpH7. 4、0. 02M的 PBS緩沖液重懸； ④取步驟③得到的液相，用pH7. 4、0. 02M的PBS緩沖液稀釋至150000倍體積。
[0015] 所述量子點熒光免疫試劑盒，包括：包被有沙丁胺醇抗原的微孔板、抗體工作液、 沙丁胺醇標準溶液、稀釋液、濃縮洗滌液等。
[0016]本發明還保護以上所述試劑盒在檢測待測樣本中是否含有沙丁胺醇中的應用。
[0017]本發明依靠免疫學、免疫化學基本原理和殘留分析技術手段，設計、合成小分子目 標分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯，制備有效人工抗原，免疫動物制備針對小分子分析物 的特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學反應，定量的檢測樣品中微量小分子目標分 析物。本發明制備方法簡便可行、成本較低，半抗原產率較高。本發明克服了現有檢測技術 中對沙丁胺醇樣品預處理復雜、耗時、且需要大量有機溶劑萃取，以及在檢測過程中要用到 精密昂貴的檢測儀器而不適于推廣使用等缺點。本發明的沙丁胺醇抗原，通過免疫動物可 產生了針對沙丁胺醇的特異性抗體，用于快速檢測食品中的沙丁胺醇殘留，具有操作簡單、 快速，處理樣品量大，靈敏度高，特異性強等諸多優點。
[0018]
【附圖說明】
[0019] 圖1為量子點的掃描圖。
[0020] 圖2為沙丁胺醇量子點免疫熒光試劑盒標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0021] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果 取平均值。實施例1中的攪拌都是采用磁力攪拌器進行的，所用的試驗材料，如無特殊說 明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。
[0022] 沙丁胺醇的結構式如下：
[0023] 實施例1、免疫原和包被原的制備 一、半抗原的制備 1、中間體sal-Ι合成：250ml三口瓶中加入2-溴-l-[4-羥基-3-(羥甲基）苯基] 乙-1-酮lOOOmg，二氯甲烷200ml，對甲苯磺酸3. 8mg，冰浴降溫至0-5度，滴加2, 2甲氧基 丙烷2208ul，室溫反應過夜，TLC檢測反應完全后處理，飽和碳酸氫