多效唑半抗原、抗原、抗體及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及半抗原、抗原、抗體及其制備方法，特別設及一種多效挫半抗原、抗原、 抗體及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 植物生長調節劑（PlantGrowthRegulator)是一類具有植物激素活性的人工合 成農藥，可用于調節果蔬的生長和膽藏，在農業生產過程中提高農產品產量和質量發揮著 重要作用。多效挫是20世紀70年代末英國化學公司研制開發的植物生長調節劑，是一種 高效低毒的生長延緩劑，它能夠降低赤霉素和嗎I噪乙酸的含量，增加乙締的釋放量，提高抗 倒伏、抗旱等抗逆性，增加產量，改善作物品質。然而隨著科學技術的進步，有關植物生長調 節劑安全性的報道越來越引起世界各國普遍關注。研究發現，多效挫在±壤中殘留半衰期 較長，可能對非目標物產生危害，因此很多國家對多效挫在農產品中的殘留量有嚴格的限 量標準。
[0003] 目前，歐盟、澳大利亞、日本、韓國、新加坡等國均已制定果蔬中多種植物生長調節 劑的限量。其中，歐盟規定蔬菜、水果（除葡萄）、葡萄中多效挫的限量分別為〇.〇2mg/kg、 0. 5mg/kg、0. 05mg/kg;澳大利亞規定各類熱帶和亞熱帶水果（除鱷梨和芒果）、鱷梨、芒果、 大麥和小麥中多效挫的限量分別為0.01mg/kg、0.lmg/kg、lmg/kg、0.Img/kg;日本規定桃、 蘋果、香蕉中多效挫的限量分別為0. 2mg/kg、0. 5mg/kg、0.Olmg/kg;韓國規定桃、杏、李子 和樓桃中多效挫的限量為0. 〇5mg/kg，蘋果中多效挫限量為0. 5mg/kg;新加坡規定鱷梨和 核果中多效挫的限量為0.Olmg/kg。我國食品安全國家標準GB2763-2014(食品中農藥最 大殘留限量）對多效挫殘留量的規定如下：稻谷、小麥、花生仁、菜巧油、蘋果、慕枝中多效 挫的限量為0. 5mg/kg，油菜巧中多效挫的限量為0. 2mg/kg。
[0004] 傳統的多效挫殘留分析方法，主要是依靠液相色譜法、氣相色譜法或質譜法等儀 器分析方法，檢測儀器昂貴，運些檢測方法雖然能夠滿足限量檢測的需要，但存在操作過程 繁瑣復雜、成本較高、分析速度慢等問題，不適用于大批量樣品的篩選檢測。免疫分析，由于 在抗原抗體的定性定量方面獨特的優勢和操作簡便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量 大的優點彌補了理化分析的不足，在化合物殘留檢測中起著越來越重要的作用。 陽〇化]影響免疫化學分析質量的根本因素是抗體的特異性與親和性，運些性質又決定于 免疫半抗原分子的結構，因此免疫半抗原的分子設計與合成就是產生特異性抗體和建立小 分子化合物殘留快速檢測技術最基礎和最關鍵的步驟。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種高免疫原性的多效挫人工半抗原、抗原并獲得抗體。 同時達到制備方法重復性好、易于標準化及可保證無限量供應的目標。
[0007] 為達到上述目的，本發明提供了一種多效挫半抗原，其特征在于，所述多效挫半抗 原具有如下結構式：
[0008]
[0009] 本發明還提供了所述多效挫半抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0010] S1、按1:1的摩爾比稱取多效挫和4-(漠甲基）苯甲酸，(TC溶于四氨巧喃中；向所 得四氨巧喃溶液中加入氨化鋼，冰浴下攬拌30~60min后，室溫下攬拌30~60min;加入 艦化鐘反應，加熱回流10~1她；所述多效挫與四氨巧喃的質量體積比為1:20g/ml，所述多 效挫與氨化鋼的質量比為10:3,所述多效挫與艦化鐘的質量比為（15~20) :1 ;
[0011] S2、將步驟S1得到的反應液冷卻至室溫，加水后，加入2mol/L的鹽酸調節抑至5 ; 60~70°C旋蒸除四氨巧喃；所述水的加入量為步驟S1所述多效挫質量的10倍；
[0012] S3、用乙酸乙醋萃取步驟S2得到的有機相3~5次；將得到的萃取相通過無水硫 酸鋼干燥，直至溶劑完全揮干；
[0013] S4、將步驟S3得到的殘留物用沸程為60~90°C的石油酸與乙酸乙醋按體積比 4:1配制成的淋洗液淋洗過硅膠柱；而后，將淋洗液濃縮至多效挫加入量的0. 5~0. 7倍， 所得濃縮液即為多效挫半抗原；所述硅膠柱規格為30g，25cm。
[0014] 本發明所制得的多效挫半抗原為將多效挫進行結構改造得到的簇基化多效挫化 合物，在多效挫的徑基上引入活性官能團結構，既最大程度保留了多效挫的特征結構，又具 有可W與載體蛋白發生偶聯的活性基團。
[0015] 本發明提供了一種多效挫抗原，其特征在于，所述多效挫抗原具有如下結構式：
[0016]
[0017] 式中：Protein為載體蛋白。
[0018] 本發明還提供了所述多效挫抗原的制備方法，其特征在于，多效挫半抗原與載體 蛋白通過氨基與簇基的縮合反應偶聯，即得到多效挫抗原；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、 卵清白蛋白或鑰孔血藍蛋白。
[0019] 優選方式下，所述多效挫抗原的制備方法包括如下步驟：
[0020] T1、稱取所述多效挫半抗原，溶解于無水二氧六環試劑中，加入1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC·肥1)、N-^基班巧酷亞胺（N服），室溫下攬拌反應6個小 時，得到溶液A，備用；所述多效挫半抗原、無水二氧六環試劑、1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙 基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC·肥1)與N-徑基班巧酷亞胺（N服）的質量體積比為5~20mg: 1~ 2. 5ml:60 ~120mg:40 ~60mg;
[0021] 稱取載體蛋白溶于碳酸鹽緩沖液中，得到溶液B，備用；所述載體蛋白與碳酸鹽緩 沖液的質量體積比為20~lOOmg:3~15ml;
[0022] T2、將步驟T1得到的溶液A按所述多效挫半抗原與載體蛋白質量比5~20:20~ 100的比例加入到溶液B中，室溫攬拌10~1她，裝入透析袋，在PBS緩沖液中4°C透析72 小時，中間置換所述緩沖液6次；SOOOrmp離屯、30min，得到的上清液即為多效挫抗原溶液；
[0023] 步驟T1所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清白蛋白或鑰孔血藍蛋白。
[0024] 本發明制得的多效挫抗原中，多效挫半抗原與載體蛋白的偶聯比為8~11:1，所 述偶聯比為摩爾比。
[00巧]本發明所述多效挫人工抗原可W作為免疫原也可W作為檢測用包被原。
[00%] 本發明還提供了多效挫抗原制備的抗體，其特征在于，所述抗體通過將所述多效 挫抗原刺激動物機體免疫應答獲得。
[0027] 優選方式下，所述抗體為多效挫多克隆抗體。
[0028] 優選方式下，所述抗體為多效挫單克隆抗體。
[0029] 本發明的優點在于：
[0030] 通過化學合成多效挫免疫抗原，對小鼠進行免疫，制備得到高度均質、純度高、專 一性強的抗多效挫單克隆抗體，制備方法具有重復性好、易于標準化及可保證無限量供應 等優勢。
【附圖說明】 陽03U 圖1為多效挫人工抗原的SDS-PAGE圖。
[0032] 圖2為單克隆抗體的標準曲線。
【具體實施方式】
[0033]W下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設置Ξ次重復實驗，結果取平 均值。
[0034] 實施例中所用的PBS緩沖液均為抑7.4、0.Olmol/L的PBS緩沖液。實施例中所用 的碳酸鹽緩沖液均為pH9. 6、0.05mol/L的碳酸鋼緩沖液。牛血清白蛋白簡稱BSA，卵清蛋白 簡稱OVA，鑰孔血藍蛋白簡稱KLH。
[0035] 多效挫，如式（1)所不，購自Sigma-Al化ich公司，分子量為293. 79。
[0036]
陽037]式（1)
[0038] 4-(漠甲基）苯甲酸，式似所示，購自Sigma-Al化ich公司，分子量為214. 0366。
[0039]
W40] 式似
[00川實驗用Ba化/c小鼠和新西蘭白兔由大連醫科大學實驗動物中屯、提供。
[0042] 實施例1、制備多效挫半抗原
[0043] 稱取1.Og多效挫和0.73g4-(漠甲基）苯甲酸，在0°C下，溶解于20血四氨巧喃 中，向溶液中加入0. 3g氨化鋼，冰浴下攬拌30min。然后室溫下繼續攬拌30min后，加入 〇.〇56g艦化鐘后，加熱回流1她。上述反應液冷卻到室溫并緩慢加入lOmL蒸饋水，2M肥！ 調抑到5,旋轉蒸發除去大部分四氨巧喃，用乙酸乙醋萃取有機相Ξ次，乙酸乙醋提取 物經無水硫酸鋼干燥后，溶劑被完全揮干。殘留物用石油酸化0-90°C)-乙酸乙醋（4:1，V/ V)淋洗過硅膠柱（30g，25cm)。淋洗液濃縮至0.7g，即為多效挫半抗原。 W44] 實施例2、制備多效挫人工抗原
[0045] 1、多效挫免疫原的制備
[0046] 取8mg實施例1制備得到的多效挫半抗原所示化合物，溶解于1. 0ml無水二氧 六環試劑中，分別加入90mg1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC.肥1)， 53. 5mgN-徑基班巧酷亞胺（N服），室溫下攬拌反應6個小時，得到多效挫的活化液；稱取載 體蛋白BSA20mg溶于3mL碳酸鹽緩沖液中；向BSA溶液中緩慢加入多效挫活化液，室溫下 磁力攬拌1她，裝入透析袋，在PBS緩沖液中4°C透析72小時（中間置換緩沖液6次），然后 于SOOOrmp離屯、30min，取上清即為多效挫抗原溶液（多效挫免疫原溶液）；將得到多效挫 抗原溶液分裝于安培瓶中，-20°C保存。偶聯BSA的多效挫免疫原簡稱PBZ-BSA，其溶液簡 稱PBZ-BSA溶液。
[0047] 用同樣的方法可W制備多效挫的偶聯物PBZ-KLH，或PBZ-0VA。
[0048] 上述方法制備的多效挫偶聯物同樣可W作為多效挫的包被原。
[0049] 將PBZ-BSA溶液用PBS緩沖液稀釋后，測定280nm和260nm的分光光度值，按公式 計算稀釋液中的蛋白的濃度，乘W稀釋倍數后即為PBZ-BSA溶液中的PBZ-BSA濃度。蛋白 質濃度（mg/ml) = 1.45X0D280-0. 74X0D260。
[0050] 2、多效挫免疫原的表征
[0051] 將PBZ-BSA溶液用PBS緩沖液稀釋（使PBZ-BSA的濃度為5mg/mL)，作為溶液甲； 將含5mg/mL多效挫的PBS緩沖液作為溶液乙；將含5mg/mLBSA的PBS緩沖液作為溶液丙。 分別將溶液甲、溶液乙和溶液丙進行紫外（200-380nm)光譜掃描，分別采用溶液乙和溶液 丙的最大吸收波長值對溶液甲進行紫外光譜掃描，并根據已經計算出的該化合物的消光系 數反向計算該化合物在溶液甲中的濃度，用濃度值除W分子量得到該化合物的摩爾濃度， 計算偶聯比，簇基化的多效挫半抗原和BSA的偶聯比為10:1，即10個多效挫半抗原所示化 合物結合1個BSA。
[0052]SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，濃縮膠濃度為5 %，分離膠濃度為12 %，濃縮膠電壓60V， 分離膠電壓80V，上樣量為2μg，考馬斯亮藍染色3~地后，置脫色液中過夜脫色。根據條 帶分子量的大小變化判斷偶聯效果。
[0053] SDS-PAGE電泳結果表明，如圖1所示，BSA的泳動速度大于PBZ-BSA，即PBZ-BSA的 分子量大于