一種表達hiv抗原的重組載體疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗病毒免疫學領域，具體地，本發明涉及一種表達HIV抗原的重組載 體疫苗及其構建方法和用途。
【背景技術】
[0002] 獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人免 疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV)侵入人體后借細胞表面的⑶4分子及 某些趨化因子受體侵犯宿主細胞，破壞機體免疫功能，進而引起嚴重的機會性感染所致的 以惡性疾病為特征的繼發性免疫缺陷綜合征。據統計數據顯示，截止2012年全球艾滋病總 感染人數已超過3500萬，超過法國總人口的一半，其中2012年新增感染人數230萬，因艾 滋病死亡人數約為160萬。中國艾滋病的感染與發病人數也已由低速增長期進入高速增長 期。HIV流行給人類帶來了巨大的疾病負擔，因此迫切需要高度有效而又安全的疫苗來應對 這一難以對付疾病的挑戰。
[0003] 有效的HIV疫苗能誘導持久的免疫，并能阻止感染發生、減少病毒復制、延緩病情 進展和降低病毒傳播。然而至今尚無理想的HIV疫苗。預防性HIV疫苗進展緩慢：已有3種 預防性疫苗完成了 III期臨床，但臨床結果顯示這三種疫苗均不具有廣泛的預防作用。針 對目前HIV有效預防性疫苗的缺失及嚴峻的發病形勢，治療性疫苗應運而生。
[0004] 治療性疫苗屬于基因治療的范疇，同時它在體內發生作用的機制與免疫應答相 關，因此又屬于疫苗范疇。因此，治療性疫苗具有基因治療藥物和疫苗的雙重屬性。治療性 疫苗的作用機制主要是激發機體免疫系統，使患者免疫功能恢復正常或接近正常水平，主 要應用于已感染HIV的人群。
[0005] 目前進行臨床研究的HIV治療性疫苗類型包括亞單位疫苗、DNA疫苗以及重組載 體疫苗。重組載體疫苗是將HIV病毒蛋白的編碼基因插入到一個無害或弱的病毒或細菌 中，其進入機體后會產生相應抗原，誘發機體產生細胞免疫或體液免疫反應。目前，使用的 載體系統主要是病毒載體系統，約占總量的70%，已批準的臨床方案及已上市的藥物絕大 部分使用的是腺病毒和腺相關病毒，也使用過逆轉錄病毒和其它非病毒載體系統。
[0006] 腺病毒載體是一種應用最為廣泛，研究也較為深入的載體系統，可以感染包括分 裂期和非分裂期的宿主細胞，病毒基因組不整合到細胞染色體上，因此不會發生由于病毒 基因組整合而導致的細胞癌變，。該病毒可以較容易地制備出高滴度的病毒樣品，有利于產 品的生產和臨床使用，生產成本相對也較低。但是，由于該類載體表達持續時間相對較短， 因此，實際使用時所需的劑量較大，對細胞和機體的損害也比較明顯，容易引起機體的免疫 反應，重復給藥時療效較差；腺相關病毒沒有致病性，雖然可以整合到染色體上，但整合概 率很低，至今沒有發現其整合可以引起細胞轉化的證據，被公認為是一種安全的病毒載體 系統，該系統在基因治療領域的應用逐年增多。但是，腺相關病毒存在外源基因容量小、制 造工藝相對復雜和對外源基因的表達量低等缺點。逆轉錄病毒載體是最早使用的載體系統 之一，人類第一例基因治療臨床試驗就是使用的該類載體，它具有感染和整合效率高、可持 續表達目的基因等優點，但也有一個致命的缺點，那就是安全性欠佳，其在核染色體上的高 整合率有可能引起癌基因的活化或抑癌基因的失活，由此引起癌變。
[0007] 仙臺病毒載體是新近開發出來的載體系統，具有獨特的優勢，其安全、高效和廣泛 的宿主范圍使其具有很好的應用前景。
[0008] 仙臺病毒基因組是一條負鏈RNA，長度為15384個核苷酸，共包括6個基因。核蛋 白 NP(nucleoprotein)、憐酸化蛋白 P(phosphoprotein)、聚合酶大亞基 L (large protein) 和RNA共同構成核蛋白復合物RNP。基質蛋白M(matrix protein)用于病毒顆粒的組裝。 血凝素神經氨酸酶HN(hemagglutinin-neuraminidase)和融合蛋白 F(fusion protein)是 位于病毒胞膜上的糖蛋白，主要參與病毒粒子與宿主細胞的吸附和侵入等過程。
[0009] Leader(ld)和trailer(tr)分別是仙臺病毒基因組中特有的前導序列和末端 序列。六個基因頭尾相連排列在基因組中，每一個基因作為一個表達單元（開放式閱讀 框），其中又可以分為幾個獨立的區域，分別是基因起始區域GS (Gene Start)、不轉錄區域 UTR (Untranslate region)和基因結束區域 GE (Gene End), I(intergenic motif)是重復 的3bp片段排列在基因和基因的連接處。
[0010] 仙臺病毒的包裝過程：pSeV質粒進入細胞后，在輔助病毒vTF7-3(Fuerst，T. R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8122-8126, 1986) T7 聚合酶的作用下開始復制正鏈 RNA， 在輔助質粒pTM-N、pTM-P和pTM-L合成的N、P和L蛋白的作用下復制成負鏈RNA，也就是 仙臺病毒基因組，然后開始表達Μ蛋白，HN蛋白，F蛋白，并最終包裝成完整的病毒顆粒，以 出芽形式形成具有感染能力的仙臺病毒。
[0011] 隨著反向遺傳學技術的發展，仙臺病毒被開發為胞質表達傳播缺陷性的病毒載 體，臨床前研究已證實其攜帶外源基因對某些疾病，如呼吸道疾病、缺血性損傷和腫瘤等具 有很好的治療作用。
[0012] 由于仙臺病毒屬于負單鏈RNA病毒，病毒的復制和組裝等全部生活周期均在細胞 質中完成，復制時也沒有DNA鏈合成過程，而僅以其本身為模板進行正、負鏈RNA的合成和 轉錄翻譯，尚沒有發現其具有整合進入細胞核DNA中的機制和跡象，因此使用起來有較大 的安全保障，解決了長期以來基因治療中產生的安全性問題；其次，由于該病毒外膜含有仙 臺病毒所特有的F蛋白，因此可以高效地將其RNP轉入細胞，復制轉錄后產生足夠的目的蛋 白產物，來達到治療的目的；另外，由于其感染效率高，使用劑量小，因此治療過程中由病毒 本身引起的副作用要比其它載體系統小得多，安全性更高；目前已經發現，仙臺病毒可以感 染包括肌細胞、神經細胞和上皮細胞在內的幾乎所有類型的細胞，這一特點使其應用面進 一步拓寬，可被廣泛用于基因治療和基因免疫等各個領域。
[0013] 實際應用過程中，將野生型病毒的F基因去除，使其成為F基因缺陷型病毒，并將 目的基因插入到病毒基因組中，得到重組病毒。用于治療時，載體將目的基因帶入細胞，進 行復制和表達，但不能形成有感染活性的子代病毒顆粒，不能進一步感染周圍其他的細胞， 由此來限制病毒的擴散，達到控制藥物劑量，提高生物安全性的目的。病毒載體的生產則使 用可表達F蛋白的包裝細胞來進行，通過反式互補來生產有感染活性的病毒顆粒。該病毒 基因組中仍然缺乏F基因，用于治療時，在正常細胞中不能形成有感染活性的顆粒，因此沒 有傳播危險。
[0014] 目前，進行仙臺病毒載體生產大多采用表達F蛋白的包裝細胞系LLC-MK2/F。 LLC-MK2/F細胞為LLC-MK2細胞改造而來，通過在LLC-MK2細胞基因組中插入F基因獲得。 F基因缺陷型仙臺病毒載體轉染LLC-MK2/F細胞后，該細胞可穩定表達F蛋白，從而通過反 式互補來生產有感染活性的仙臺病毒顆粒。
[0015] gag基因是HIV的結構基因，其編碼蛋白在病毒組裝過程中必不可少。在細胞質 中，gag基因產生的mRNA翻譯形成55kD的多蛋白復合體。多蛋白復合體形成后迅速移至 細胞膜區域，幫助形成病毒粒子。gag基因常作為HIV疫苗的抗原基因。進入III期臨床的 RV144疫苗項目和MRKAd5 HIV-1 (B亞型）gag/pol/nef三價疫苗均采用gag基因作為抗原 基因。另一種普遍采用的抗原基因為env基因，第一個進入III期臨床的AIDSVAX gpl20 亞單位疫苗即采用env基因編碼蛋白gpl20亞單位作為抗原。病毒表面的gpl20蛋白為糖 蛋白，表面被密集的多糖覆蓋，他與宿主細胞受體（CD4)的結合位點通常被隱蔽，而避免與 中和抗體的結合。此外，gpl20分子量較大，發生突變性幾率高，很容易出現免疫逃逸。
[0016] 與env抗原基因相比較，以gag為抗原基因具有一定的優勢，其編碼產物相對保 守，變異頻率較gpl20低；具有多個抗原表位，能誘導機體的細胞免疫反應。
[0017] 目前，國外用于臨床前研究的HIV疫苗大多是以歐美及非洲的流行株為基礎構建 的，不適合在我國應用，因而有必要研制以我國流行株為基礎的HIV疫苗。

【發明內容】

[0018] 本發明的目的在于提供一種表達HIV抗原的重組仙臺載體疫苗及其構建方法和 應用，所述HIV抗原是以我國HIV流行株為基礎獲得。
[0019] 為實現上述發明目的，本發明提供