用于制備糖和糖漿的方法
【專利說明】用于制備糖和糖漿的方法
[0001] 對序列表的引用
[0002] 本申請包括一個計算機可讀形式的序列表，將其通過引用結合在此。 發明領域
[0003] 本發明涉及一種用于產生糖和糖漿（特別是高果糖玉米糖漿（HFCS))的方法。
[0004] 發明背景
[0005] 已經描述了大量用于將淀粉轉化為淀粉水解物（例如麥芽糖、葡萄糖或特制糖 漿）的方法，這些淀粉水解物用作甜味劑或者用作其他糖（例如果糖）的前體。還可以將 葡萄糖發酵為乙醇或其他發酵產品。
[0006] 淀粉是一種由葡萄糖單位鏈組成的高分子量聚合物。它通常由約80%支鏈淀粉和 20%直鏈淀粉組成。支鏈淀粉是一種分支多糖，其中α -1，4D-葡萄糖殘基的直鏈由α -1，6 糖苷鍵連接。
[0007] 直鏈淀粉是一種由D-吡喃葡萄糖單位構成的線性多糖，這些單位通過α -1，4糖 苷鍵連接在一起。在將淀粉轉化為可溶性淀粉水解物的情況下，將淀粉解聚。常規的解聚 方法由一個糊化步驟和兩個連續的工藝步驟（即液化過程和糖化過程）組成。顆粒狀淀粉 由在室溫下不溶于水的微觀顆粒組成。加熱一種水性淀粉漿液時，顆粒膨脹并且最后破裂， 將淀粉分子分散至溶液中。在此"糊化"過程中，粘度有顯著的增加。由于典型工業方法中 的固體水平為30% -40%，因此不得不稀釋或"液化"淀粉以使其能夠被操作。如今主要是 通過酶降解而獲得粘度的降低。
[0008] HFCS制造自高DX糖漿，術語DX意指按根據糖漿的干物質（DS)計算的右旋糖 (D-葡萄糖）的重量計的百分比。通常用于將淀粉轉化為高DX糖漿的整體酶工藝是一個兩 階段過程。第一步是液化，其中長鏈淀粉被α-淀粉酶降解為較小的分支單位和線性單位 (麥芽糊精）。液化過程典型地是在約105°C -IKTC下進行約5至10分鐘，隨后在約95°C 下進行約1-2小時。然后將溫度降至60°C，添加葡糖淀粉酶或β-淀粉酶和任選地脫支酶 (例如異淀粉酶或普魯蘭酶），并且將糖化過程進行約24至72小時。
[0009] WO 2013/057141和WO 2013/057143描述了 α -淀粉酶變體及其在例如淀粉加工、 發酵產品產生、用于由包含未糊化淀粉的材料產生發酵產品的方法以及用于由包含糊化淀 粉的材料產生發酵產品的方法中的用途。這些變體被描述為當在低PH下和/或高溫下，特 別是在低鈣濃度下，并且特別是在至少〇. 1%淀粉的存在下（例如，在〇. 9%或1%淀粉的存 在下）孵育時具有例如增加的穩定性。
[0010] 仍需要對用于產生糖和糖漿的方法進行改進。
[0011] 發明概述
[0012] 在一方面，本發明提供了一種用于產生糖漿的方法：
[0013] a)用α -淀粉酶變體液化水性顆粒狀淀粉漿液，該變體在對應于SEQ ID NO: 1的 以下任何位置的一個或多個位置處包括改變：1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、 185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437 以及 450,以提供包含液化淀粉的材料；
[0014] b)在葡糖淀粉酶和來源于脫支芽孢桿菌（Bacillus deramificans)、枯草芽孢桿 菌、淀粉脫支芽孢桿菌（Bacillus amyloderamificans)或嗜酸性普魯蘭芽孢桿菌的普魯蘭 酶的存在下糖化該包含液化淀粉的材料，以提供右旋糖糖漿，并且任選地
[0015] c)進行異構化以提供果糖糖漿。
[0016] 在一些方面，α -淀粉酶變體、葡糖淀粉酶和來源于脫支芽孢桿菌的普魯蘭酶的組 合對觀察的最終糖漿產生增強效果，特別是與沒有組合酶情況下獲得的DX百分比相比，DX 有所增加。
[0017] 附圖簡要說明
[0018] 圖1示出具有以下氨基酸序列的α -淀粉酶的比對：
[0019] SEQ ID NO: 1是地衣芽孢桿菌α -淀粉酶。
[0020] SEQ ID NO: 2是嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶。
[0021] SEQ ID Ν0:3 是在應用微生物學雜志（J. Appl. Microbiology)，1997， 82:325-334 (SWALL:q59222)中描述的芽孢桿菌屬α-淀粉酶TS-23。
[0022] SEQ ID Ν0:4是在TO 2005/001064中描述的黃熱芽孢桿菌（Bacillus flavothermus) α -淀粉酶 AMY1048。
[0023] SEQ ID NO: 5是在TO 04/113511中描述為SEQ ID NO: 21的芽孢桿菌屬α-淀粉 酶 TS-22〇
[0024] SEQ ID NO:6是解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶。
[0025] SEQ ID NO: 7是在WO 95/26397中描述為SEQ ID NO 1的芽孢桿菌堿性屬SP690 淀粉酶。
[0026] SEQ ID NO:8是在TO 95/26397 中描述為 SEQ ID NO 2 的鹽敏芽孢桿菌（Bacillus halmapalus) α -淀粉酶。
[0027] SEQ ID NO:9是在WO 00/60060中描述為SEQ ID NO 4的芽孢桿菌堿性屬ΑΑ560 淀粉酶。
[0028] SEQ ID NO: 10是在WO 200210356中描述為SEQ ID NO 2的芽孢桿菌堿性屬A 7-7 淀粉酶。
[0029] SEQ ID NO: 11是在冢本（Tsukamoto)等人（1988,生物化學與生物物理研究通訊 (Biochem. Biophys. Res. Commun. ) 151:25-33)中描述的芽抱桿菌喊性屬 SP707 淀粉酶。
[0030] SEQ ID NO: 12是在EP 1022334中描述為SEQ ID NO 2的芽孢桿菌堿性屬K-38淀 粉酶。
[0031] SEQ ID NO: 13 是在李（Lee)等人，2006，生物化學雜志（J. Biochem)， 139:997-1005中描述的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶。
[0032] SEQ ID NO: 14是以前在例如WO 2002/010355中披露的變體α -淀粉酶LE399。
[0033] 發明詳細說明
[0034] 定義
[0035] 術語"顆粒狀淀粉"被理解為生的未煮過的淀粉，即尚未經歷糊化的淀粉。淀粉是 在植物體內作為不溶于水的微小顆粒而形成。這些顆粒在低于初始糊化溫度的溫度下被保 存為淀粉。當放入冷水中時，這些顆粒可以吸收少量的液體。高達50°C至70°C，膨脹是可 逆的，可逆性程度取決于具體的淀粉。在更高溫度下，開始不可逆膨脹，稱為"糊化"。
[0036] 術語"特制糖漿"是本領域公認的術語并且根據"右旋糖當量"（DE)和碳水化 合物譜進行表征（參見由G. G.伯奇（G. G. Birch)和L. F.格林（L. F. Green)編輯的教科 書"食品碳水化合物的分子結構與功能（Molecular Structure and Function of Food Carbohydrate)"中的第50+頁的文章"新特制葡萄糖糖衆（New Speciality Glucose Syrups)"，應用科學出版社有限公司（Applied Science Publishers LTD.)，倫敦）。典型 地，特制糖漿的DE范圍是從35至45。
[0037] α -淀粉酶：α -淀粉酶（E. C. 3. 2. I. 1)是催化淀粉以及其他線性和分支1，4糖苷 寡糖和多糖的水解的一組酶。本領域技術人員將知道如何確定α-淀粉酶活性。它可根據 在實例中描述的程序例如通過PNP-G7測定來確定。在一方面，本發明的變體具有SEQ ID NO: 1的成熟多肽的α -淀粉酶活性的至少20 %，例如至少40 %、至少50 %、至少60 %、至 少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%。在另一方面，本申請的變體具有其 親本的α -淀粉酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%、至少95%或至少100%。
[0038] 葡糖淀粉酶：葡糖淀粉酶是催化D-葡萄糖從淀粉或相關寡糖和多糖分子的非還 原端釋放的l，4-a_D-葡聚糖葡糖水解酶（EC 3.2. 1.3)。出于本發明的目的，根據下文的 "材料與方法"部分所述的程序來確定葡糖淀粉酶活性。Novo葡糖淀粉酶單位（AGU)定義為 在以下標準條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量：37°C，pH 4. 3,底物：麥芽糖23. 2mM， 緩沖液：乙酸鹽0. 1M，反應時間5分鐘。
[0039] 片段：術語"片段"意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個（例 如，若干個）氨基酸的多肽；其中該片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，一個片段含有至 少300個氨基酸殘基、至少350個氨基酸殘基、至少400個氨基酸殘基、至少450個氨基酸 殘基、至少470個氨基酸殘基或至少480個氨基酸殘基。
[0040] 分離的：術語"分離的"意指處于自然界中不存在的形式或環境中的物質。分離的 物質的非限制性實例包括（1)任何非天然發生的物質，（2)包括但不限于任何酶、變體、核 酸、蛋白質、肽或輔因子的任何物質，該物質至少部分地從與其本質上相關的一種或多種或 所有天然存在的成分中去除；（3)相對于天然發現的物質通過人工修飾的任何物質；或（4) 通過增加該物質相對于與其本質相關的其他組分的量而修飾的任何物質（例如，編碼該物 質的基因的多拷貝；使用比編碼該物質的基因本質上相關的啟動子強的啟動子）。一種分 離的物質可以存在于發酵液樣品中。
[0041] 成熟多肽：術語"成熟多肽"意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。本領域已知宿主細胞可以 產生由相同的多核苷酸表達的兩種或更多種不同成熟多肽（即，具有不同的C-末端和/或 N-末端氨基酸）的混合物。成熟形式的一些α -淀粉酶（例如，一些細菌α -淀粉酶）包 括含有用于底物水解的活性位點的催化結構域以及用于結合碳水化合物底物（淀粉）的一 個或多個碳水化合物結合模塊（CBM)以及任選地將一個或多個CBM與催化結構域連接的多 肽，后一類型的區域通常稱為"接頭"。
[0042] 親本或親本α-淀粉酶：術語"親本"或"親本α-淀粉酶"意指進行變化以產生 本發明的酶變體的α-淀粉酶。親本可以是天然存在的（野生型）多肽或其變體或片段。
[0043] 普魯蘭酶：普魯蘭酶（EC 3.2. 1.41)水解普魯蘭（α-1,6-連接的麥芽三糖單 位的線性聚合物）中和支鏈淀粉和糖原以及支鏈淀粉和糖原的α-和β-極限糊精中 的a-l，6_D-糖苷鍵。普魯蘭酶（pullulanase)的一個或多個其他名稱是例如淀粉普魯 蘭酶（amylopullulanase)，支鏈淀粉6-葡聚糖水解酶；細菌脫支酶；脫支酶；α -糊精內 切-1，6-α -葡糖苷酶；R-酶。系統名稱是"普魯蘭α -1，6-葡聚糖水解酶"。屬于此類別 的酶可以包括碳水化合物結合模塊（CBM)。
[0044] 碳水化合物結合模塊：碳水化合物結合模塊或碳水化合物結合結構域是能夠通 常以非共價結合而結合碳水化合物的蛋白質結構。碳水化合物結合結構域包括結合多糖 (例如纖維素、木聚糖或淀粉）的結構域。若干碳水化合物結合結構域已經被描述于文獻 中，并且已經被分組為多個家族，綜述參見布拉司頓（Boraston)等人（2004)生物化學雜志 (Biochem. J.) 382:769-781 和 http: //afmb. cnrs-mrs. fr/CAZY/index. html 中對 CBM 家族 的分組。"淀粉結合結構域"是對淀粉（特別是生淀粉）具有特異性的碳水化合物結合結 構域。淀粉結合結構域至少被發現于碳水化合物結合結構域家族CBM-20、CBM-21、CBM-25、 CBM-26、CBM-34、CBM-41 以及 CBM-45 中。
[0045] 序列一致性：兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的關聯度通過參數"序 列一致性"來描述。
[0046] 出于本發明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學開放軟件 套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯（Rice)等人， 2000,遺傳學趨勢（Trends Genet.) 16:276-277)(優選5.0.0版或更新版本）的尼德爾 (Needle)程序中所實施的尼德爾曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德爾 曼）和Wunsch (翁施），1970,分子生物學雜志（J. Mol. Biol.) 48:443-453)來確定兩個氨 基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數是空位開放罰分10,空位延伸罰分〇. 5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標注的"最長的一致性"的輸出 (使用-非簡化選項獲得）被用作百分比一致性，并且如下計算：
[0047] (一致的殘基XIOOV (比對長度-比對中的空位總數）
[0048] 變體：術語"變體"意指在一個或多個（例如，若干個）位置處包括改變（即，取代、 插入和/或缺失）的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指用一個不同氨基酸置換占用一 個位置的氨基酸；缺失意指去除占據一個位置的氨基酸；并且插入意指鄰近于占據一個位 置的氨基酸添加一個或多個（例如，若干個）氨基酸（例如，1-5個氨基酸）。在一方面，本 發明的變體具有SEQ ID NO: 1的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20%，例如至少40%、 至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%。在另一方 面，本申請的變體具有其親本的α -淀粉酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至 少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少100 %。α -淀粉酶活性可通過 在實例中描述的PNP-G7測定來確定。
[0049] 野生型α -淀粉酶：術語"野生型" α -淀粉酶意指由天然存在的微生物，如在自然 界中發現的細菌、酵母或絲狀真菌來表達的α-淀粉酶。
[0050] 變體命名慣例：出于本發明的目的，將SEQ ID NO: 1中披露的成熟多肽用來確定另 一種α-淀粉酶中的對應的氨基酸殘基。將另一種α-淀粉酶的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1 中披露的成熟多肽進行比對，并且基于該比對，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物 學開放軟件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯（Rice) 等人，2000,遺傳學趨勢（Trends Genet. ) 16:276-277)(優選5. 0.0版或更新版本）的尼德 爾（Needle)程序中所實施的尼德爾曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman (尼德 爾曼）和Wunsch (翁施），1970,分子生物學雜志（J. Mol. Biol. )48:443-453)來確定對應 于SEQ ID NO: 1中披露的成熟多肽中的任何氨基酸殘基的氨基酸位置編號。所使用的參數 是空位開放罰分10,空位延伸罰分0. 5,以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩 陣。
[0051] 可以通過使用若干計算機程序，使用其對應默認參數比對多個多肽序列來確定在 另一種α -淀粉酶中的對應氨基酸殘基的鑒定，所述計算機程序包括但不限于MUSCLE (通 過對數預期的多種序列比較；版本3. 5或更新版本；埃德加（Edgar)，2004，核酸研究 (Nucleic Acids Research) 32:1792-I797)、MAFFT (版本 6· 857 或更新版本；加藤（Katoh) 和庫馬（Kuma)，2002,核酸研究30:3059-3066 ;加藤等人，2005,核酸研究33:511-518 ; 加藤和都（Toh)，2007,生物信息學（Bioinformatics) 23:372-374 ;加藤等人，2009,分子 生物學方法（Methods in Molecular Biology)537:39-64;加藤和都，2010,生物信息學 26:1899-1900)以及采用Clustaiwa 83或更新版本；湯姆斯（Thompson)等人，1994,核酸 研究 22:4673-4680)的 EMBOSS EMMA。
[0052] 當其他酶與SEQ ID N0:1的成熟多肽相背離使得傳統的基于序列的比較方法 不能檢測其相互關系時（林達爾（Lindahl)和埃洛弗松（Elofsson)，2000,分子生物學 雜志（J. Mol. Biol.) 295:613-615)，可應用其他成對序列比較算法。在基于序列的搜索 中的更大靈敏度可以使用搜索程序來獲得，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示（譜 (profile))來搜索數據庫。例如，PSI-BLAST程序通過迭代數據庫搜索過程來產生多個 譜，并且能夠檢測遠距離同源物（阿特休爾（Atschul)等人，1997,核酸研究（Nucleic Acids Res. )25:33