微囊泡及其制造方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微囊泡及其制造方法。
[0002] 背景領域
[0003] 已知多種細胞在體內分泌或釋放微囊泡（小型膜囊泡），例如，外來體。人們已經 認為微囊泡的作用之一是在細胞外釋放不必要的細胞內組分。然而近年來，示出了微囊泡 作為信號傳遞載體在分泌細胞和其靶細胞之間傳遞諸如蛋白質或脂類的物質并且在細胞 間相互作用中起作用的可能性。
[0004] 至今已經提出了微囊泡尤其是外來體的多種臨床應用。例如，專利文獻1公開了 從包含瘧原蟲屬（Plasmodium sp.)抗原的網狀細胞中分離的外來體在防御瘧疾中的用途。 專利文獻2公開了使用來自B細胞的外來體治療癌癥。專利文獻3公開了干細胞衍生的微 囊泡在內皮再生或上皮再生中的用途。
[0005] 慢病毒，例如，人類免疫缺陷病毒（HIV)感染細胞并且具有被整合到分裂細胞和 非分裂細胞兩者的基因組內的性質。因此，基于慢病毒基因組序列的慢病毒載體作為基因 轉導工具被廣泛應用。
[0006] 引用列表
[0007] 專利文獻
[0008] 專利文獻1 :國際公布TO2011/080271
[0009] 專利文獻2 :國際公布W02011/000551
[0010] 專利文獻3 :國際公布W02009/057165
[0011] 發明概述
[0012] 技術問題
[0013] 本發明的目的是提供微囊泡及其制造方法。
[0014] 問題的解決方案
[0015] 本發明人已經進行了勤勉的研究以達到目的并且因此發現，使用包含處在端粒酶 逆轉錄酶（TERT)基因啟動子控制下的轉基因的慢病毒載體將轉基因導入細胞可以激活轉 基因到宿主基因組的整合和其表達并且可以提高由細胞產生的具有轉基因產物的微囊泡 等等的細胞外釋放。基于這些發現，本發明已經完成。
[0016] 具體地，本發明涵蓋以下方面：
[0017] [1]用于制造微囊泡的方法，所述微囊泡包含：轉基因產物和/或包含轉基因的慢 病毒RNA，所述方法包括以下步驟：
[0018] 培養已在體外使用慢病毒載體導入轉基因的細胞以胞外釋放包含所述轉基因產 物和/或所述包含轉基因的慢病毒RNA的所述微囊泡，其中所述慢病毒載體是至少一種結 構蛋白基因缺陷的并且在慢病毒基因組序列中包含處于端粒酶逆轉錄酶（TERT)基因啟動 子控制下的轉基因；以及
[0019] 收集所釋放的微囊泡。
[0020] [2]根據[1]所述的方法，其中所述細胞不具有所述至少一種結構蛋白基因。
[0021] [3]根據[1]或[2]所述的方法，其中所述慢病毒載體是env基因缺陷的。
[0022] [4]根據[1]至[3]的任一項所述的方法，其中所述端粒酶逆轉錄酶（TERT)基因 啟動子是人類TERT基因啟動子。
[0023] [5]根據[4]所述的方法，其中所述人類TERT基因啟動子包含SEQ ID NO: 1的核 苷酸序列或與SEQ ID NO: 1的核苷酸序列具有90%或更高的序列同一性的核苷酸序列。
[0024] [6]根據[5]所述的方法，其中所述人類TERT基因啟動子包含與SEQ ID NO: 1的 核苷酸序列具有95%或更高的序列同一性的核苷酸序列。
[0025] [7]根據[1]至[6]的任一項所述的方法，其中所述慢病毒RNA包含轉基因上游的 TERT基因啟動子序列。
[0026] [8]根據[1]至[7]的任一項所述的方法，其中所述慢病毒載體是：
[0027] (i)包含慢病毒基因組序列的RNA載體，
[0028] (ii)編碼包含慢病毒基因組序列的RNA的DNA載體，或
[0029] (iii)攜帶包含慢病毒基因組序列的RNA的病毒顆粒。
[0030] [9]根據[1]至[8]的任一項所述的方法，其中所述慢病毒基因組序列包含TERT 基因啟動子和轉基因之間的TERT的轉錄區域的至少一部分。
[0031] [10]根據[9]所述的方法，其中所述TERT轉錄區域的至少一部分包含SEQ ID N0:2的核苷酸序列或與SEQ ID NO :2的核苷酸序列具有90%或更高的序列同一性的核苷 酸序列。
[0032] [11]根據[1]至[10]的任一項所述的方法，其中所述慢病毒基因組序列是HIV基 因組序列。
[0033] [12]根據[11]所述的方法，其中所述HIV基因組序列是HIV-I基因組序列。
[0034] [13]根據[12]所述的方法，其中所述HIV-I基因組序列包含5'LTR ;包裝信號Φ ; gag基因；pol基因；vif基因；vpr基因；tat基因；rev基因；vpu基因和3' LTR。
[0035] [14]根據[1]至[13]的任一項所述的方法，其中所述轉基因編碼蛋白質或RNA。
[0036] [15]根據[1]至[14]的任一項所述的方法，其中所述慢病毒載體包含為腫瘤抑制 基因的所述轉基因。
[0037] [16]根據[15]所述的方法，其中所述腫瘤抑制基因是PTEN基因或pl6基因。
[0038] [17]根據[1]至[14]的任一項所述的方法，其中所述慢病毒載體包含編碼ShRNA 的所述轉基因。
[0039] [18]根據[17]所述的方法，其中所述shRNA靶向編碼細胞增殖調控因子的基因。
[0040] [19]根據[18]所述的方法，其中所述細胞增殖調控因子是CDC6。
[0041] [20]根據[1]至[19]的任一項所述的方法，其中所述細胞是人類細胞。
[0042] [21]根據[1]至[20]的任一項所述的方法，其中所述細胞是腎衍生的細胞。
[0043] [22]根據[1]至[21]的任一項所述的方法，其中所述細胞是人胚腎293T細胞。
[0044] [23] -種微囊泡，包含：轉基因產物和/或包含轉基因的慢病毒RNA，其中所述微 囊泡是根據[1]至[22]的任一項所述的方法產生的。
[0045] [24]基因轉導的方法，所述方法包括使靶細胞與根據[23]所述的包含轉基因產 物和/或包含轉基因的慢病毒RNA的微囊泡接觸以融合它們，從而將轉基因引入細胞內。
[0046] [25]根據[24]所述的方法，其中使所述靶細胞與微囊泡在體外接觸。
[0047] [26] -種組合物，包含根據[23]所述的微囊泡。
[0048] [27] -種藥物組合物，包含根據[23]所述的微囊泡。
[0049] [28]根據[27]所述的所述藥物組合物，所述藥物組合物用于治療癌癥。
[0050] [29]根據[28]所述的藥物組合物，其中所述癌癥選自由以下組成的組：結腸癌、 胰腺癌、腎癌、肺癌、成神經細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、甲狀腺癌和惡性淋巴 瘤。
[0051] [30]根據[28]或[29]所述的藥物組合物，其中所述癌癥涉及⑶C6的表達升高。
[0052] [31]根據[27]至[30]的任一項所述的藥物組合物，還包含藥學上可接受的載體。
[0053] [32] -種治療患者的方法，包括將根據[23]所述的微囊泡施用于需要導入所述 轉基因或所述轉基因產物的所述患者。
[0054] [33]根據[32]所述的方法，其中所述患者患有癌癥。
[0055] [34]根據[33]所述的方法，其中所述癌癥選自由以下組成的組：結腸癌、胰腺癌、 腎癌、肺癌、成神經細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、甲狀腺癌和惡性淋巴瘤。
[0056] [35]根據[33]或[34]所述的方法，其中所述癌癥涉及⑶C6的表達升高。
[0057] 本說明書包括在美國臨時申請號US 61/779, 556和US 61/894, 563中的公開內 容，本申請要求其的優先權。
[0058] 發明效果
[0059] 本發明提供微囊泡及其制造方法。
[0060] 附圖簡述
[0061] 圖1是具有HIV-I骨架的質粒的HIV-I基因組區域的示意圖。圖IA是pNL4-3的 HIV-I基因組區域的示意圖。圖IB是pTHTK的HIV-I基因組區域的示意圖。
[0062] 圖2示出重組的慢病毒質粒載體pRBL0213T和pTHTN。圖2A是顯示pRBL0213T 和pTHTN的質粒DNA映射的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道I :pRBL0213T，EcoR I ;泳道2 : pRBL0213T，Mlu I+Xho I ;泳道 3 :pRBL0213T，Nhe I ;泳道 4 :pTHTN，EcoR I ;泳道 5 :pTHTN， Mlu I+Xho I;泳道M:lkb梯。圖2Β是pRBL0213T的HIV-I基因組區域的示意圖。圖2C是 pTHTN的HIV-I基因組區域的示意圖。
[0063] 圖3顯示重組的慢病毒質粒載體pRBLOOl。圖3A是顯示pRBLOOl的質粒DNA映射 的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道I :pRBL001，EcoR I ;泳道2 :pRBL001，EcoR I+Nhe I ;泳道3 : pRBL001，Mlu I+Xho I;泳道 4:pRBL001，Sal I;泳道 5:pRBL0213T，Nhe I;泳道 M:lkb 梯。 圖3B是pRBLOOl的HIV-I基因組區域的示意圖。限制性內切酶位點RI代表EcoR I、Sal 代表 Sal I、Mlu 代表 Mlu I、Nhe 代表 Nhe I 且 Xho 代表 Xho I。
[0064] 圖4是重組慢病毒質粒載體的HIV-I基因組區域的示意圖。圖4A是pNL4-3 (野 生型HIV-1)的HIV-I基因組區域的示意圖。圖4B是在HIV-I整合酶中具有突變并且缺乏 將HIV-I病毒基因組的DNA整合入宿主基因組的pD64V的HIV-I基因組區域的示意圖。圖 4C是pTHTK的HIV-I基因組區域的示意圖。圖4D是pTHTN的HIV-I基因組區域的示意圖。 圖4E是缺乏hTERT啟動子的5'部分的pTHTH的HIV-I基因組區域的示意圖。圖4F是具 有來自人巨細胞病毒（CMV)的啟動子序列的pTHTC的HIV-I基因組區域的示意圖。
[0065] 圖5是顯示制備用于檢測LTR-標簽的Bpm I位點的示意圖。圖5A是顯示于pTHTK 的HIV-I基因組區域的5' LTR中制備的新的Bpm I位點的示意圖。圖5B是顯示Bpm I限 制性內切酶在毗鄰于復制到HIV-I 3'LTR的Bpm I位點的整合位點（14個核苷酸）切割宿 主染色體DNA的示意圖。圖5C是慢病毒基因組的末端結構的示意圖。
[0066] 圖6是顯示通過連接介導的PCR(LM-PCR)來形成LTR-標簽的示意圖。
[0067] 圖7是用于檢測LTR-標簽的LM-PCR的凝膠電泳圖。
[0068] 圖8顯示了檢查病毒RNA剪接的結果。圖8A和8B是顯示使用2. 2 %瓊脂糖凝膠 在lx TAE中使RT-PCR反應產物電泳的結果的照片。圖8A是顯示使用引物5'LTRU5和 3' NL8960獲得的PCR產物的凝膠電泳圖。圖8B是顯示使用引物5' LTRU5和3' NL5850獲 得的PCR產物的凝膠電泳圖。剪接的RNA片段a(El+Al/3' NL5850)、b (E1+A2/3' NL5850)、 cl(El+E2+E3+A3/3'NL5850)、c2(El+E2+A3/3'NL5850)和 c3(El+E3+A3/3'NL5850)的條帶 的位置被示于圖8B的右側。圖8C是顯示未剪接的轉錄子的示意圖。圖8D是顯示剪接的 RNA的示意圖。在圖8D中，Al至A3表示3'剪接受體且El至E3表示外顯子。
[0069] 圖9是顯示p24測定結果的圖表。
[0070] 圖10是顯示用于PTEN測定中的質粒載體的構成的圖解。圖IOA顯示在PTEN基 因轉導中作為陰性對照的PGL3-1375 (Empt.;質粒大小：約7kb)。圖IOB顯示在PTEN基因 轉導中作為陽性對照的pcDNA3. l/CMV-hPTEN(Regul.;質粒大小：約7. 5kb)。圖IOC顯示用 于PTEN基因轉導的逆轉錄載體pRBL016Bn(Retro.;質粒大小：約7. 9kb)。.圖IOD顯示用 于PTEN基因轉導的重組的慢病毒載體pRBL0213T(Lenti.;質粒大小：約15kb)。載體中限 制性內切酶位點BamH代表BamH I ;Bgl代表Bgl II ;RI代表EcoR I ;RV代表EcoR V ;Hd3 代表 Hind III ;Mlu 代表 Mlu I ;Nco 代表 Nco I ;Nde 代表 Nde I ;Sal 代表 Sal I ;Stu 代表 Stu I;且 Xho 代表 Xho I。
[0071] 圖11是顯示對利用質粒載體的瞬時轉染的PTEN測定的結果的圖表。
[0072] 圖12是顯示在mv裂解物中的PTEN活性與在圖11中所示的細胞裂解物中的PTEN 活性的比率的圖表。
[0073] 圖13是顯示重組慢病毒顆粒RBL0213T感染的PTEN測定的結果的圖表。
[0074] 圖14是顯示mv裂解物中PTEN活性與由重組慢病毒質粒載體pRBL0213T轉染的 細胞或由重組的慢病毒顆粒RBL0213T感染的細胞的細胞裂解物中PTEN活性的比率。
[0075] 圖15是顯示在mv中或在與mv孵育的細胞中病毒蛋白或內源蛋白或外源蛋白的 蛋白質印記的結果的照片。圖15A顯示使用抗-Vpu抗體獲取的結果。圖15B顯示使用 抗-RT抗體獲取的結果。圖15C顯示使用抗-FEN-I抗體獲取的結果。
[0076] 圖16是一組顯微鏡照片，顯示被其中包封c-myc-FEN-1的mv遞送內含物到細胞。 圖16A顯示被抗-c-myc抗體染色的圖像。圖16B顯示被DAPI染色的圖像。圖16C顯示圖 16A和16B的重疊圖像。圖16D顯不由Photoshop(R) (Adobe Systems Inc.)的圖像"調整" 方法中的顏色曲線程序從重疊的圖像制備的圖像。
[0077] 圖17是顯示Lenti_mv2010/CDC6shRNA的癌細胞增殖抑制效果的圖表。
[0078] 圖18顯示指示細胞蛋白提取物和mv裂解物中的蛋白質印記分析的結果的照片。
[0079] 圖19顯示表現出通過病理檢查對來自各測試組的腫瘤觀察的典型的形態的照 片。A，陰性對照組；B，干擾素（IFN) a -2b注射組；C，Cytomox PTEN注射組以及D，Cytomox P53注射組。
[0080] 圖20顯示表現出通過病理測試對來自各測試組的腫瘤觀察的典型的形態的照 片。A，低劑量Cytomox Ex注射組；B，高劑量Cytomox Ex注射組；C，低劑量Cytomox HD注 射組以及D，高劑量Cytomox HD注射組。
[0081] 實施方案的描述
[0082] 在下文中，將詳細描述本發明。
[0083] 1.制造微囊泡的方法
[0084] 本發明涉及制造微囊泡的方法。本發明的方法包括以下步驟：
[0085] 培養已在體外使用慢病毒載體導入轉基因的細胞以胞外釋放微囊泡，所述微囊泡 包含：轉基因產物和/或包含轉基因的慢病毒RNA，其中所述慢病毒載體是至少一種結構蛋 白基因缺陷的并且在慢病毒基因組序列中包含處于端粒酶逆轉錄酶（TERT)基因啟動子控 制下的轉基因，以及
[0086] 收集所釋放的微囊泡。
[0087] 通過本發明的方法制造的微囊泡包含：轉基因產物和/或包含轉基因的慢病毒 RNA。本發明的方法可以有效地制造包含轉基因產物和/或包含轉基因的慢病毒RNA的微 囊泡。
[0088] 根據本發明的慢病毒載體指的是用于基因轉導的具有慢病毒基因組序列作為基 本骨架的載體。慢病毒是具有逆轉錄酶的RNA病毒。慢病毒可以將病毒基因組DNA(前病 毒DNA)整合入宿主的分裂和非分裂細胞的染色體中從而使病毒衍生的基因可以被宿主細 胞表達。慢病毒載體是基于慢病毒的這樣的性質。
[0089] 根據本發明的慢病毒載體可以是：
[0090] (i)包含慢病毒基因組序列的RNA載體，
[0091] (ii)編碼包含慢病毒基因組序列的RNA的DNA載體，或
[0092] (iii)攜帶包含慢病毒基因組序列的RNA的病毒顆粒。
[0093] ⑴的RNA載體可以，例如，通過體外轉錄從包含慢病毒基因組序列的表達載體或 表達盒來制備。（ii)的DNA載體可以包括質粒載體。質粒載體通常包含編碼包含慢病毒基 因組序列的RNA的DNA序列、和用于帶來DNA序列的轉錄的啟動子以及終止子、復制起點以 及用于篩選重組體的標記基因等。這樣的DNA載體可以使用基因重組技術等由本領域已知 的方法來制備。（iii)的病毒顆粒可以是由不同的病毒的包膜蛋白假病毒化的病毒顆粒，所 述不同的病毒的包膜蛋白例如，水皰性口炎病毒（VSV)的包膜糖蛋白G(VSV-G)。假病毒化 的病毒顆粒可以通過例如以下來制備：以編碼包含慢病毒基因組序列的RNA的DNA載體和 編碼不同的病毒的包膜蛋白（例如，VSV-G)的質粒共轉染培養的細胞；收集釋放入培養基 的病毒顆粒；以及純化該顆粒。
[0094] 在本發明中使用的慢病毒載體在其慢病毒基因組序列中是至少一種病毒結構蛋 白基因缺陷的。這樣的慢病毒基因組序列可以是，其中在全長慢病毒基因組序列中至少一 種病毒結構蛋白基因被破壞（例如，通過缺失一部分或全部區域或者通過插入核酸分子） 的慢病毒基因組序列。在本發明中，基因中的術語"缺陷"意指完整基因被缺失或者基因被 破壞或突變使得功能性蛋白不能表達。慢病毒載體中有缺陷的病毒結構蛋白基因可以是選 自由gag基因、pol基因和env基因組成的組中的至少一種。gag基因編碼參與病毒顆粒形 成的蛋白。pol基因編碼諸如逆轉錄酶（RT)的酶。env基因編碼參與吸附在宿主細胞上和 穿透宿主細胞的外殼（包膜）蛋白。例如，慢病毒載體可以是env基因缺陷的。例如，可以 從慢病毒載體中缺失對應于SEQ ID N0:4的位置6344至位置7611的區域以導致HIV-I的 env基因的缺陷。在一個實施方案中，細胞在基因組中或染色體外不具有在慢病毒載體中有 缺陷的至少一種病毒結構蛋白基因。已經使用慢病毒載體將轉基因導入其中的這樣的細胞 不產生傳染性的慢病毒顆粒。因此，產生的微囊泡是高度安全的。
[0095] 根據本發明在慢病毒載體中作為基本骨架使用的慢病毒基因組序列的實例包括， 但不局限于，來自人免疫缺陷病毒（HIV)、猿猴免疫缺陷病毒（SIV)、貓免疫缺陷病毒（FIV) 和犬免疫缺陷病毒（CIV)的基因組的序列。根據本發明的慢病毒基因組序列優選地是HIV 基因組序列。更具體地，HIV基因組序列可以是HIV-I或HIV-2基因組序列。優選地，HIV 基因組序列可以是HIV-I基因組序列。HIV可以是屬于HIV-I組Μ、Ν、0或P的毒株。更具 體地，HIV 可以是包括 HIV-lIIIb、HIV-lSF2、HIV-lSF162、HIV-lBRU、HIV-lNY5、HIV-lL AI、 HIV-1NL4-3等等的HIV-I毒株的任一種。示范性的HIV基因組序列可以從Genbank登錄號 EU541617、K03455以及K02013等等獲得。慢病毒基因組序列可以是RNA或者可以是DNA。
[0096] 慢病毒載體中的慢病毒基因組序列可以包含5' LTR和3' LTR，和任選地選自由以 下組成的組的至少一個：包裝信號Φ、gag基因、pol基因、vif基因、vpr基因、tat基因、 rev基因、vpu基因或vpx基因、nef基因和env基因。在優選的實施方案中，慢病毒載體中 的HIV-I的慢病毒基因組序列可以包含5'LTR、包裝信號Φ、gag基因、pol基因、vif基因、 vpr基因、tat基因、rev基因、vpu基因和3' LTR。在另一個優選的實施方案中，慢病毒載 體中的HIV-2的慢病毒基因組序列可以包含5' LTR、包裝信號Φ、gag基因、pol基因 、vif 基因、vpr基因、tat基因、rev基因、vpx基因和3' LTR。這樣的慢病毒基因組序列典型地 包含至少一個剪接供體（SD)和剪接受體（SA)。在一個實施方案中，慢病毒載體中的慢病毒 基因組序列可以包含vpu基因、tat基因和rev基因。慢病毒載體中的慢病毒基因組序列 可以是nef基因缺陷的。
[0097] 根據本發明的慢病毒載體在慢病毒基因組序列中包含處于端粒酶逆轉錄酶 (TERT)基因啟動子控制下的轉基因。TERT是在DNA復制期間合成端粒重復段的酶。在本發 明中使用的端粒酶逆轉錄酶（TERT)基因啟動子可以是，但不限于人TERT基因啟動子。優 選地，人TERT基因啟動子可以包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列或者與SEQ ID NO: 1的核苷 酸序列具有90%或更高的序列同一性的核苷酸序列。更優選地，人TERT基因啟動子可以包 含與SEQ ID N0:1的核苷酸序列具有95%、97%、99%、99.5%或99.9%或更高的序列同一 性的核苷酸序列。
[0098] 在一個實施方案中，還優選地，根據本發明的慢病毒載體包含SEQ ID NO: 5的核苷 酸序列或與其具有90%或更高、優選地95%或更高、更優選地99%或更高，例如，99. 8%或 更高的序列同一性的序列作為慢病毒基因組序列；以及包含TERT基因啟動子和已經被進 一步插入至慢病毒基因組序列（優選地在nef基因中）的處于TERT基因啟動子控制下的 轉基因的序列。
[0099] 在本發明中，短語"處于TERT基因啟動子控制下的轉基因"意指轉基因的轉錄由 TERT基因啟動子的活性起始。優選地，轉基因位于TERT基因啟動子的下游。
[0100] TERT轉錄區域的至少一部分可存在于TERT基因啟動子與插入到慢病毒基因組序 列中的轉基因之間。TERT轉錄區域的該至少一部分可至少包括TERT基因的第一外顯子。 TERT轉錄區域的該至少一部分可以包括SEQ ID N0:2的核苷酸序列或者與SEQ ID N0:2的 核苷酸序列具有90 %、95 %、97 %、99 %、99. 5 %或更高的序列同一性的核苷酸序列。
[0101] 本發明使用的轉基因可以編碼任何蛋白質或者RNA諸如微RNA (miRNA)、小干擾 RNA(SiRNA)或者短發夾RNA(shRNA)。在一個實施方案中，轉基因可以是腫瘤抑制基因。 腫瘤抑制基因的實例包括，但不局限于，本領域技術人員已知的腫瘤抑制基因，諸如P53、 BRCAl、Rb、PTEN以及pl6基因。優選地，腫瘤抑制基因可以是PTEN或pl6基因。PTEN蛋白 是催化磷脂酰肌醇3, 4, 5-三磷酸（Ptdlns(3, 4, 5)P3