一種固相化細胞的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種固相化的細胞，及在生物工程領域的應用。
【背景技術】
[0002] 固相化細胞技術（ImmobilizedCells)是20世紀60年代發展起來的一口新興 技術，在化工、能源、環保和醫藥等領域得到廣泛的應用，它是指利用各種理化方法將游離 細胞定位于特定的空間區域內，提高細胞或酶的濃度，并保持生物活性和反復利用的技術。 與傳統的懸浮生物處理法相比，固相化細胞有提高單位體積的細菌密度、菌體易回收、環境 耐受力增強等優點，而且將菌體固相化可增加底物或產品對細胞膜的滲透性和酶的熱穩定 性。固相化細胞保持了胞內酶系的原始狀態和天然環境，有效地利用游離細胞的完整酶系 和細胞膜的選擇通透性，其優點體現于：1.不需要將酶從微生物細胞中提取出來并加W純 化，酶活力損失小，成本低；2.酶處于天然細胞環境中中穩定性高；3.細胞生長停滯期時間 短，細胞多，反應快，抗污染能力強，可W連續發酵，反復使用，應用成本低。
[0003] 目前的細胞固相化技術最多采用的方法中，W海藻酸鋼、角叉菜聚糖等為載體，水 溶解后通過和待固相化的細胞種子液混合，在含巧的溶液中形成凝膠，從而將細胞包埋或 者結合其中，形成包含有細胞的固相化顆粒。能夠形成凝膠的材料分子還包括聚乙締醇。
[0004] 海藻酸鋼是從褐藻中提取的多糖，主要成分是Beta-D甘露糖醒酸和A1地aA-古 洛糖醒酸構成的多糖。k古洛糖只在海洋植物中存在，動物體內不存在k古洛糖及其衍 生物，因此采用海藻酸鋼包埋的細胞在動物體內生物相容性差，會引起免疫反應。而且海 藻酸可W吸附銅、鋒和儘等二價金屬離子，運些金屬離子是動物細胞培養過程中需要添加 的微量元素，對于維持細胞的正常代謝和提高重組蛋白的表達水平有重要的作用。角叉菜 聚糖是從鹿角菜等海洋植物中提取的聚糖，又名卡拉膠。角叉菜聚糖需要在較高的溫度下 (80°C)才能溶于水，低溫下容易沉淀，而哺乳動物細胞一般不能耐受高溫。聚乙二醇也可 W用于細胞的包埋，但是易引起細胞脫水，在機體內有一定的毒性。
[0005] 果膠是食品的天然成分之一，天然果膠類物質W原果膠、果膠、果膠酸的形態廣泛 存在于植物的果實、根、莖、葉中，是細胞壁的一種組成成分，它們伴隨纖維素而存在，構成 相鄰細胞中間層粘結物，使植物組織細胞緊緊黏結在一起。原果膠是不溶于水的物質，但可 在酸、堿、鹽等化學試劑及酶的作用下，加水分解轉變成水溶性果膠。果膠本質上是一種線 形的多糖聚合物，含有數百至約1000個脫水半乳糖醒酸殘基，其相應的平均相對分子質量 為50000~150000。半乳糖及其衍生物是動物體內常見的糖分子，因此果膠在動物體內有 較好的生物相容性，安全性高，不會引起免疫反應。在細胞培養工程中也不會吸附微量元素 及其它的營養成分，對于維持哺乳動物細胞的正常代謝和高的重組蛋白表達水平具有重要 的意義。
[0006] 殼聚糖（化itosan)又稱脫乙酷甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾下質（化itin) 經過脫乙酷作用得到的，化學名稱為聚葡萄糖胺（1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。自1859年， 法國人Rouget首先得到殼聚糖后，運種天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、 安全性、微生物降解性等優良性能被各行各業廣泛關注，在醫藥、食品、化工、化妝品、生化 和生物醫學工程等諸多領域的有了廣泛的應用。同時，果膠和殼聚糖是聯合國糧農組織和 世界衛生組織認定的食品添加劑，沒有添加限制。
[0007] 由于果膠可W被人結腸中菌群分泌的果膠酶所降解，因此W果膠作為陰離子組 分、殼聚糖和巧離子作為陽離子組分，采用液中固相法制備骨架型微丸來制備藥物結腸定 位釋放制劑已經有廣泛報道，但是沒有報道用于活細胞的固相化。鑒于現有技術在細胞固 相化存在的上述技術問題，本發明意欲提供一種使用果膠對工程細胞進行固相化的方法， 從而有利于工程細胞的產物生成和應用。

【發明內容】

[0008] 基于上述發明目的，本發明首先提供了一種固相化細胞的制備方法，所述方法包 括W下步驟：
[000引 （1)在含欲被固相化細胞的懸液中加入果膠溶液，加入后的細胞懸液中，細胞濃度 為l04-l0Vml;果膠濃度為1-10%;
[0010] (2)在步驟（1)獲得的細胞懸液中加入含有氯化巧和殼聚糖的溶液，攬拌5-15分 鐘，其中氯化巧的濃度為0.5-10%，殼聚糖的濃度為0. 1-5% ;
[0011] 做過濾步驟似獲得的溶液，并重新懸浮獲得的細胞。
[0012] 在一個優選的技術方案中，所述步驟（1)中細胞濃度為5Xl〇5/ml，果膠濃度為 5%。
[0013] 在另一個優選的技術方案中，所述步驟（2)中氯化巧的濃度為3%，殼聚糖的濃度 為 0. 5%。
[0014] 在一個更為優選的技術方案中，所述細胞為可W表達并分泌抗人化r-2抗原人源 化單克隆抗體的工程細胞CH0。
[0015] 另一方面，本發明還提供了一種應用上述固相化細胞的制備方法表達并分泌抗人 Her-2抗原的人源化單克隆抗體的方法。
[0016] 在一個優選的技術方案中，所述方法包括：
[0017] (1)將上述步驟（3)制備好的CH0細胞微球懸浮于CD-Forti-CHO無血清培養基 中，振蕩培養3-5天；
[0018] (2)回收培養基中的雙特異性人源化單克隆抗體。
[0019] 在一個更為優選的技術方案中，所述細胞微球與所述培養基的體積比為1 :2，
[0020] 在一個最為優選的技術方案中，所述細胞的培養環境為37°C，5%的0)2,及15化pm 振蕩培養。
[0021] 第=方面，本發明還提供了根據上述固相化細胞的制備方法獲得的細胞在制備乳 腺癌治療藥物中的應用。
[0022] 在一個優選的技術方案中，所述細胞被制備為皮膚植入劑。
[0023] 發明人設計了采用果膠、殼聚糖和巧離子液相固化微丸的方法對工程細胞進行固 相化，從而可W保持細胞的活性。而果膠巧形成的骨架允許細胞的營養成分進入微丸，維持 細胞的正常生長和分裂，細胞的代謝產物可W分泌出微丸，進而從培養基中分離純化相關 的重組蛋白；采用果膠巧包埋的能夠表達并分泌雙特異性人源化單克隆抗體的CK)工程細 胞，可w連續培養進行抗體的生產；包埋后的細胞抗體分泌量在第一次培養階段，抗體的表 達量略低于常規培養的CK)細胞，在第二和第=批次3-5天的抗體表達量，可W達到常規培 養14天的表達量。抗體的生產時間可W縮短到3-5天，與常規的培養20-30天的時間相 比，大大提高了生產效率；而且，細胞微球的培養基中CK)細胞殘留蛋白的濃度顯著低于正 常培養的CHO細胞，第一批次HCP的濃度為37. 5yg/ml，第二批次的HCP濃度為43. 4yg/ ml,第S批次的HCP濃度為52. 7yg/ml，而常規培養的CHO細胞培養基中HCP的濃度達到 162. 6yg/ml，說明包埋后細胞的存活率較高，HCP的濃度較低，在后續的抗體純化中，可W 顯著降低HCP的殘留。而死亡細胞的DNA與果膠巧結合，不全部釋放到培養基中，測定的 CH0DNA濃度只有常規培養細胞的1/10,因此可W顯著提高后續純化過程抗體的純度，降低 雜質的含量。
[0024] 固相化的細胞可W作為植入劑植入病人皮下，分泌的治療性蛋白，如抗體類藥物、 EP0等可W直接進入人體，起到治療疾病的作用。在一定時間，可W將微丸通過手術的方法 取出并放置新的微丸，避免了長期注射的問題。而且，果膠巧微丸具有良好的生物相容性， 未在移植部位產生明顯的排斥反應，穩定性也較好，17天未見微丸明顯的降解和破壞，因此 運一方法也可W用于疾病的治療。
【附圖說明】
[00巧]圖1.常規培養細胞與被包埋后的細胞分泌抗體濃度的柱狀圖；
[0026] 圖2.培養基中CH0細胞蛋白殘留濃度的柱狀圖；
[0027] 圖3.被包埋細胞微丸的小鼠觀察圖；
[002引圖4.被包埋小鼠血清中雙特異性抗體的濃度隨時間變化的曲線圖。
【具體實施方式】
[0029] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但運些實施例僅是范例性的，并不對本發明的保護范圍構成任何限制。
[0030] 實施例1.固相化細胞微丸的制備
[0031] 細胞的培養：可W表達抗人化r-2抗原的人源化單克隆抗體化rc巧tin的 C冊細胞（構建方法見中國專利申請CN201510368641. 7)接種于CD-Forti-C冊培養基 (Invitrogen，貨號：A11483-〇l)，37°C，5%C〇2,ISO巧m振蕩培養至細胞密度達到 5X1〇6/ ml, 100化pm室溫離屯、5分鐘，棄上清，用新鮮的培養基垂懸細胞，調整細胞密度到lOVml， 備用。
[0032] 氯化巧交聯溶液的配制：氯化巧3 % (g/v，濃度范圍：0. 5-10 % )，0. 5 % (0. 1-5% )殼聚糖，溶解于80mlCD-Forti-C冊培養基中，采用1%的憐酸調節抑值到 5. 5 (2. 5-7. 0)，至溶液完全變清，補充體積到100ml，0. 22um濾器過濾除菌。
[0033] 果膠巧微丸的制備步驟：
[0034] (1)含果膠細胞懸液的配制：
[00對 果膠5g溶解于90mlCD-Forti-C冊培養基（Invitrogen)，4°C攬拌過夜，0. 22um 過濾除菌，溫度恢復到室溫后，加5ml細胞懸液，補充體積到100ml，此時細胞密度5X10^ ml(范圍：l04-l0Vml)，果膠濃度為5%(濃度范圍：0. 5-10%)。
[003引似交聯
[0037] 在生物安全柜中采用注射器巧血，7#針頭）將果膠細胞懸液邊緩慢攬拌邊滴加 到抑5. 5氯化巧交聯溶液中，針頭離液面高度約為5cm左右，用磁力攬拌器攬拌，滴速大約 2血/min,交聯時間lOmin。交聯完成后，篩網過濾，PBS清洗S次，重懸于CD-Forti-C冊培 養基中進行培養。
[003引所制備的微丸均為圓球形，用光學顯微鏡進行目測法測定微丸的直徑。具體操作 為：取少許濕微丸，加蒸饋水分散，蓋上蓋玻片（注意除盡氣泡），用有刻度標尺（刻度已校 正其每格的ym數）的接目鏡的顯微鏡，測量100個微囊，微丸粒徑分布在0.8-1. 1mm間， 微丸外膜的厚度大約為0. 05-0. 07mm。
[0039] 實施例2.固相化細胞的流