利用金屬結合蛋白制備金屬納米顆粒的方法
【專利說明】
[0001] 本申請是2007年4月17日遞交的中國發明專利申請200780019089. 4的分案申 請。
技術領域
[0002] 本發明涉及一種利用重金屬結合蛋白來制備重金屬納米顆粒的方法，特別涉及一 種制備重金屬結構體的方法，該方法包括在含重金屬離子的培養基中對轉化有重金屬結合 蛋白編碼基因的微生物進行培養，從而在微生物中產生重金屬結構，并收集所產生的重金 屬結構體以及根據所述方法產生的重金屬結構體的納米顆粒。
【背景技術】
[0003] 量子點是納米級的半導體顆粒，當它們被諸如光線等能量激發時會發光，并且所 發出光的顏色取決于顆粒的尺寸。也就是說，如果顆粒尺寸減小從而減小了顆粒維數時，電 子云密度及其能量發生改變，由此該顆粒的特征會基于其維數而發生改變。例如，在二維系 統中發現量子霍爾效應，但該效應并不出現在三維系統中。在本文中，術語"減小的維數"嚴 格意義上意指電子被束縛在比德布羅意波長還小的區域中。零尺寸的量子點不是沒有面積 的點，而是指具有小于德布羅意波長的三維尺寸。在量子力學中，所有具備動量的物質顆粒 的波即德布羅意波長會基于物質的不同而有所不同，并且對半導體材料而言大約為l〇nm。
[0004] 如圖1所示，量子點總體上是由核和殼所構成的球形，除圖1所示的Zn、S及Cd之 外還包括其它各種重金屬。
[0005] 量子點的制備方法大體上能夠分為兩種：利用諸如激光等光源的平版法；以及 化學合成法。通過化學方法合成量子點的優點在它能夠利用比平版相對簡單的系統來生 產量子點，但是該方法仍有許多技術問題有待解決以便以高成本效益方式生產大量的量 子點。同樣地，與利用現有的批量方法所制備的量子點相比，利用分子化學技術所制備的 量子點具有優良的光學穩定性，并且它們的光學特性能夠被控制從而基于納米材料的尺 寸大小、形狀及成分發出各種不同波長的光線。有鑒于此，把基于量子點的納米材料應用 于生物領域成為可能。這表明基于量子點的納米材料不僅能夠廣泛地用于生物傳感器還 能夠用于體外光學成像的造影劑，這些可能性近來已經為多項研究所證實（Jovin，Nat. Biotechnol.，21:32, 2003 ;Wu et al.，Nat. Biotechnol.，21:41，2003 ;Alivisatos，Nat. Biotechno22 :47,2004 ;Gao et al.，Nat.Biotechno.，22:969, 2004 ;Lidke et al. Nat. Biotechnol，22:198, 2004)〇
[0006] 作為該可能性的典型例子，開發了一種能夠體外示蹤活細胞信號傳導的技術， 該技術的一個例子是ffiR2/neu途徑的方法。這克服了已有的有機熒光團的缺陷，因 為熒光團容易失去其光學活性從而無法對連續的細胞變化進行示蹤（Wu et al.，Nat. Biotechnol.，21:41，2003 ;Lidke et al.，Nat. Biotechnol.，22:198, 2004)。同樣地，為了 對活細胞體內由erbB/HER受體介導的信號傳導進行示蹤，將上皮細胞生長因子（EGF)結合 量子點并通過將它結合到上皮細胞生長因子受體上（EGFR)使其激活。然后對量子點耦合的 EGFR耦合物結合入細胞的過程進行示蹤（Lidke et al.，Nat. Biotechnol.，22:198, 2004)。 該方法使得對活細胞內的生物過程進行實時觀測成為可能。
[0007] 進一步地，為了克服體內穿透性不足這一缺陷，開發了能夠利用近紅外 范圍內波長的半導體納米晶體，從而使體內圖像收集成為可能（Gao et al.，Nat. Biotechnol.，22:969, 2004)。在該方法中，為了有效地使量子點溶解并且同時有效地將量 子點傳遞到體內，為量子點（ZnS-包覆CdSe)包被多嵌段共聚物，并把單克隆抗體結合到包 被共聚物的反應基團上。
[0008] 此外，為了克服光學成像體內穿透性低這一缺陷，具有近紅外波長的 量子點被用于對大鼠腋窩下的前哨淋巴結進行光學成像（Kim et al.，Nat. Biotechnol.，22:93, 2004)。該納米材料表現出不同于通過已有方法獲得量子點所表現出 的物理性質，并且由此具備應用于核磁共振成像的前景。
[0009] 同時，處理環境中重金屬的方法大體上包括化學、物理和生物處理方法。生物處理 方法利用了微生物自身的生物機制以及由微生物引起的機制，包括生物吸附和生物聚集、 氧化和還原、金屬有機復合物和不溶性復合物的形成，為恢復被重金屬污染的環境奠定了 重要技術基礎（Vails and de Lorenzo, FEMS Microbiol. Rev.，26:327, 2002)。此外，隨著 分子生物學的發展，近期在開發具備改善的結合重金屬性質方面的嘗試表明對現有生物處 理方法進行改善是可能的。微生物合成重金屬結合蛋白以通過生物聚集來去除體內外的重 金屬，并且這些蛋白質涉及到胞外金屬離子的儲存或濃度的調節。
[0010] 近來，發現名為植物螯合肽的肽可以通過將真菌和植物暴露在重金屬中的方法 來產生，所述肽天然就能結合諸如鉛、汞及鎘等有害元素從而除去這些元素。植物螯合 肽具有（y-Glu-Cys)n-Gly(n = 2-7)結構并通過形成肽-金屬的結合來聚集金屬離子 (Cobbett, Curr. Opin. Plant Biol. 3:211，2000)。此外，作為其它種類的重金屬結合蛋 白，名為金屬硫蛋白的低分子量蛋白質已經得到了很多研究，并且這些蛋白質具有豐富的 半月光氨酸并能結合錦、鋅、銀、銅等等（Hamer, Annu. Rev. Biochem.，55:913, 1986 ;Wu and Lin,Biosens. Bioelectron. , 20:864, 2004) 〇
[0011] 同時，涉及量子點制備的專利文獻包括：韓國專利號10-0540801，名為"Method of preparing quantum dots using metal powder"；韓國專利號 10-0526828,名為 "Method of preparing quantum dots having uniform distribution by irradiating magnetic membrane or semiconductor membrane with laser'，;卓?國專利 10-0541516,名為"method for forming quantum dots of semiconductor material"；以及韓國專利 10-0279739,名 為"Method for forming nanometer-size silicon dots"。然而，這些方法都是通過金屬 材料的物理結合來制備量子點的方法。
[0012] 本發明人已經注意到量子點成分是通過鎘（Cd)、硒（Se)、鋅（Zn)以及碲（Te)的 常規組合來合成，在此利用生物工程方法對重金屬結合蛋白進行了表達。結果，本發明人發 現在體內經濟地合成量子點是可能的，并且也利用了上述生物系統來制備光學性能穩定的 量子點，由此完成了本發明。

【發明內容】

[0013] 本發明的目的在于提供一種具有生產重金屬結構體能力的重組微生物，以及制備 重金屬結構體納米顆粒的方法，該方法包括在含培養基的重金屬環境中培養重組微生物。
[0014] 本發明的另一目的在于提供改善納米顆粒的方法，該方法包括把該納米顆粒結合 至選自下列物質中的至少一種：化學物質、配體、金屬、DNA以及蛋白質。
[0015] 為了實現上述目的，本發明提供了制備重金屬結構體納米顆粒的方法，該方法包 括步驟：在含重金屬離子的培養基中培養微生物，該微生物轉化有一個編碼一個或多個重 金屬結合蛋白的基因，從而在微生物中產生重金屬結構體；以及收集所產生的重金屬結構 體。
[0016] 本發明也提供了重金屬結構體的納米顆粒，其通過所述的方法制得，直徑 5_120nm，且呈球形。
[0017] 本發明也提供了具有生產重金屬結構體能力的重組微生物，該微生物中轉化有含 重金屬結合蛋白編碼基因或其一部分的表達載體。
[0018] 本發明也提供了一種改善納米顆粒的方法，該方法包括將納米顆粒結合選自下列 物質中的至少一種：化學材料、配體、金屬、DNA以及蛋白質。
[0019] 本發明也提供了改善納米顆粒的方法，該方法包括將蛋白質結合納米顆粒，并用 可識別標記結合蛋白的材料的蛋白質、結合目標蛋白的經標記配體或者特異性