檢測腫瘤乏氧的化合物及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于熒光探針領域。具體而言，本發明涉及以1，8-萘酰亞胺偶氮苯為母體 用于腫瘤乏氧檢測的熒光探針及其制備和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 熒光分子成像是光學成像中最具有發展前景、研究最熱、最主要的一個方向之一。 它主要是利用熒光分子探針對活體內靶細胞或靶標分子進行特異性標記，在外界光源的激 發下被標記的靶標部位發出熒光信號，通過系列圖像后處理技術，將活體組織在分子和細 胞水平上的生物學過程動態、實時示蹤。而將分子之間的相互作用通過熒光信號傳導出來 的分子(包括小分子、聚合物和納米顆粒）被稱為熒光分子探針或熒光分子傳感器。作為一 種靈敏度高、選擇性好、檢測方便、檢出限低的微量分析技術，近幾十年來，熒光分子探針技 術得以迅速發展，并廣泛應用于各個領域。
[0003] 乏氧是所有實體瘤的內在特征，絕大多數的實體瘤氧分壓低于其他正常組織。當 腫瘤較小時，乏氧現象不是很明顯，但是當腫瘤細胞不斷擴散時，乏氧和局部缺血就成為導 致一些重大疾病的重要因素。乏氧癌細胞具有侵犯性和轉移性，預測起來較為困難，并且對 傳統的放療、化療和傳統的免疫療法都有抵制性，因此普及對乏氧腫瘤的理解及研究合理 實用的檢測方法變得尤為重要。同時對乏氧的檢測為疾病的早期診斷(特別是實體腫瘤)提 供了條件。已報道的乏氧探針可以大致分為兩類：一是針對乏氧特殊化學環境的，如較低的 PH值、較低的氧分壓和較強的還原性
[0004] (Bioconjugate Chem. , 2012, 23:324-329;Bioorg. Med. Chem.，2008, 16:3255-3260 );二是通過檢測乏氧條件下過表達的酶來間接檢測細 胞乏氧，如硝基還原酶和碳酐酶等（〇1^311；[01^1^618,2011，13:928-931;016111. Commun.，2011，47:8301-8303)。這些熒光探針都可以一定程度的區分乏氧細胞和正常細 胞，但同時存在乏氧/有氧熒光變化倍數不大、探針合成較復雜等問題。2010年，Nagano 等人報道了一種新型的乏氧探針（J. Am. Chem. Soc. ,2010, 132(45) :15846-15848),他們將 Cy5. 5與BHQ3通過Linker連接在一起，在乏氧條件下，BHQ3的偶氮鍵被還原斷裂，使淬滅 基結構破壞，熒光釋放出來。
[0005] 在本發明中，我們基于偶氮鍵在乏氧條件下可以被還原機理，設計合成了一系列 以萘酰亞胺偶氮苯為母體的熒光探針，之后又以該熒光探針作為淬滅基通過FRET作用淬 滅其他熒光團。該方法合成簡便，可以實現熒光〇ff-〇n檢測，對腫瘤乏氧有較好的檢測效 果。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于合成一系列新型的乏氧探針，可以通過熒光變化實現對腫瘤乏 氧的檢測，其設計理念如圖1所示。
[0007] 本發明中探針的母體結構為1，8-萘酰亞胺，4位通過共價鍵與偶氮苯或其衍生物 相連。反應機理為偶氮鍵在乏氧條件下被還原成氨基，熒光釋放出來。
[0008] 本發明中的探針可以包含一種熒光團，也可以包含雙熒光團，通過FRET (fluorescenceresonanceenergytransfer,突光共振能量轉移）作用實現突光的增強。
[0009] 本發明中的熒光探針結構如下式I所示：
[0010]
[0011] 式中，
[0012] R1 選自-NR3R4;
[0013] R3 選自 _ (CH2)mR6 或-(CH2)nR5 ;
[0014]R4 選自-(CH2)mR6 ;
[0015] R5 和R6 各自獨立選自-CH3、-OH、-Br、-Cl、-CECH、-N3 ;
[0016] R2 選自-(CH2)pCH3、- (CH2)PCH2-、- (CH2O)qCH3、- (CH2O)qCH2-、- (CH2O)rH、- (CH2O) r-、-CH2 (CH2OCH2)sCH20H、-CH2 (CH2OCH2)sCH2〇-、-CH2 (CH2OCH2)tCH3 和-CH2 (CH2OCH2)tCH2-;
[0017] 其中n、m、p、q、r、s、t=0_18 的整數；
[0018] A不存在，或為苯環；
[0019]B不存在，或為熒光團。
[0020] 在一【具體實施方式】中，B為選自羅丹明B或氟硼吡咯的熒光團。
[0021] 在一個【具體實施方式】中，B選自：
[0022]
[0023] 在一【具體實施方式】中，B不存在。
[0024] 在一【具體實施方式】中，所述R3或R4各自為C1-C4烷基。
[0025] 在一【具體實施方式】中，所述R3和R4各自為甲基或乙基。
[0026] 在一【具體實施方式】中，所述R5和R6各自為-CH3。
[0027] 在一【具體實施方式】中，所述R2 選自 _(CH2)pCH 3、_(CH20)占、或-CH2 (CH20CH2)sCH 20H。
[0028] 在一【具體實施方式】中，所述11、111、口、9、1'、8、七各自為0、1、2、3、4或5。
[0029] 在一【具體實施方式】中，所述A不存在。
[0030] 在一【具體實施方式】中，所述A為苯環。
[0031] 在一具體實施例中，所述化合物選自：
[0032]
[0033] 本發明提供本發明熒光探針的制備方法，包括：
[0034] ( 1)在溶劑和催化劑的存在下，由4-硝基萘酐制備4-氨基萘酐；
[0035] (2)在溶劑的存在下，由4-氨基萘酐及R2-NH2制備得到下式II的化合物：
[0036]
[0037] (3)使式II化合物在鹽酸和亞硝酸鈉的存在下在冰浴中反應；
[0038] (4)在步驟（3)的反應溶液中加入下式III的化合物在冰浴中進行反應：
[0039]
[0040] (5)撤去步驟（4)的冰浴，以將pH調節至6左右，繼續反應，從而制備得到本發明 式I的不含有B的化合物。
[0041] 在一個【具體實施方式】中，所述方法還包括：
[0042] (6)在二氯甲烷、三乙胺和HBTU (苯并三氮唑_N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸鹽） 的存在下，使步驟（5)所得產物先在冰浴中、然后在室溫下與B反應，從而制備得到含B的 式I化合物。
[0043] 在一個【具體實施方式】中，步驟（1)在無水乙醇、氯化亞錫和濃鹽酸的存在下進行。
[0044] 在一個【具體實施方式】中，步驟（2)所用的溶劑為二甲基甲酰胺（DMF)和正丁胺。
[0045] 在一個【具體實施方式】中，步驟（3)中，先將式II化合物加到去離子水和濃鹽酸中， 冰浴下攪拌大約30分鐘；然后將溶于去離子水的亞硝酸鈉加入上述溶液中，冰浴下繼續反 應約30分鐘。
[0046] 在一個【具體實施方式】中，步驟（4)中，加入式III化合物反應大約30分鐘。
[0047] 在一個【具體實施方式】中，步驟（4)結束后撤去冰浴，然后將溶液pH調節到大約6， 繼續反應大約60分鐘。
[0048] 在一個【具體實施方式】中，通過加入飽和乙酸鈉溶液而將pH調節到6左右。
[0049] 在一個【具體實施方式】，步驟（6)中，使步驟（5)所得產物先在冰浴中與B反應大約 60分鐘，然后在室溫下與B反應大約10小時。
[0050] 在一【具體實施方式】中，用于上述步驟的反應溶劑選自冰醋酸，二甲基甲酰胺，二氯 甲烷，甲苯，乙醇，鹽酸，水或其混合溶液。
[0051] 本發明還包括本發明所述的探針分子在腫瘤乏氧檢測中的用途。
[0052] 本發明還包括本發明所述的探針分子在制備用于腫瘤乏氧檢測的試劑盒中的用 途。
[0053] 本發明還包括一種檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有權利要求1一5中任一項所 述的化合物，作為熒光探針分子，用于檢測腫瘤乏氧狀態。
[0054] 在一個具體實施例中，本發明的檢測試劑盒還含有使用說明書以及其它的適于檢 測腫瘤乏氧狀態所需的試劑。
[0055] 本發明還提供一種檢測腫瘤乏氧的方法，所述方法包括使本發明所述的探針分子 與細胞接觸以使所述探針分子透過細胞膜進入細胞內，比較接觸前、后熒光的變化，其中， 熒光增強指示腫瘤乏氧。
【附圖說明】
[0056] 圖1顯示探針分子設計思想。
[0057] 圖2顯示探針分子Pl的吸收（)和發射光譜（一）（Ex:340nm)。
[0058] 圖3顯示探針分子Pl的熒光發射光譜（一）及使用鹽酸、氯化亞錫還原后的熒光 發射光譜（)(Ex:440nm)〇
[0059] 圖