一種檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種應用重組酶聚合酶擴增技術 (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并結合側流層析技術（Lateral Flow Assay)檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒所用的引物和探針組合及其試劑盒。
【背景技術】
[0002] 牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引 起的牛傳染性鼻氣管炎，是牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，臨床上呈多種表現類型，特 別是該病能引起免疫抑制，繼發性的細菌感染能導致更嚴重的呼吸道疾病。目前此病在世 界范圍內廣泛流行，且該病嚴重影響著國際牛業生產貿易，已被世界動物衛生組織（OIE) 列為B類傳播性疾病。我國于20世紀70年代末從新西蘭進口的奶牛中檢測到IBRV，由于 沒有很好的免疫防護措施，隨后我國多數省份的牛群中均有此病毒感染，對牛群的肥育、產 奶和繁殖影響極大，給牛場造成巨大的經濟損失。目前對該病的診斷方法主要有病原分離、 PCR方法、ELISA試驗和血清中和試驗等，由于這些方法需要精密的儀器以及繁瑣的試驗程 序，難以滿足非實驗室環境下現場檢測的要求。因而亟需建立一套快速、準確、簡便的診斷 方法，為臨床現場檢測及疫情監測等提供新一代的檢測技術與手段。
[0003] 重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplif ication，RPA)，是一種不同 于PCR的核酸檢測技術，主要有結合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結合蛋白和鏈置換DNA聚 合酶三種酶參與。其原理是利用重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA 中尋找同源序列。在單鏈DNA結合蛋白的幫助下，使模板DNA解鏈，引物與模板DNA開始配 對形成復制所需的3'羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進行復制延伸，形成新的DNA互補 鏈，對模板上的目標區域進行指數式擴增。引物序列的設計與選擇對RPA的結果至關重要。 在RPA擴增體系中加入一個生物素標記的反向引物和5'熒光標記的探針，探針標記的熒光 基團30個堿基處有一個脫堿基位點（dSpacer)，該位點是DNA修復酶作用的底物，可被核酶 nfo識別切割，產生新的3'羥基末端，在DNA聚合酶的作用下進行復制延伸，從而使雙標信 號與擴增產物的累積同步，檢測結果可在抗FAM金標結合和抗生物素捕獲抗體的側流層析 試紙條上顯示。
[0004] 目前對于RPA技術的研宄尚處于起步階段，國內外還沒有將RPA技術應用于IBRV 檢測的報道。本發明系首次采用RPA技術建立快速檢測IBRV的方法，并通過特異性和靈敏 度評價，可用于臨床現場檢測，為IBRV的現場檢測提供一種靈敏、可靠的新方法。

【發明內容】

[0005] 針對RPA技術應用于IBRV檢測領域的空白，本發明提供了一種準確、快速、簡便檢 測IBRV的RPA檢測方法。僅需通過對臨床樣品進行病毒DNA粗提取并進行RPA等溫擴增， 結果可在側流層析試紙條上清晰顯示，不需要熱循環反應，不必在PCR儀中進行擴增，具有 靈敏度高、特異性強、反應程序簡單、檢測時間短等優點，適用于非實驗室環境下臨床現場 檢測，具有廣泛的應用前景。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：
[0007] -種用于通過RPA技術檢測IBRV的引物和探針組合，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探針序列如SEQ ID No. 3所示。
[0008] 正向引物：5' -TTCCGACCAGCGCCGAATCTTGGATGCAGTACT-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0009] 反向引物：5' -GGCCAAAACCGCTTTCAGAAGCAGAGCAAGGTGA-3'（5' -端用 Biotin 標 記）；（SEQ ID No. 2)
[0010] 探針序列：5' -CCGCAAAGTGCCGAGGGATGTCCTTGTAGT【dSpacer】 CAGGTCCACCTTCCGCT-3'（探針5' -端用FAM標記，距離5' -端30個堿基左右的位置處用 dSpacer替代一個堿基，3'端用C3_spacer阻斷）。
[0011] 需要說明的是：與常規PCR反應不同，RPA反應所需引物的長度通常為30-35bp， 探針序列的長度為46-52bp，引物設計時為了避免形成引物內部及之間的二級結構，其長度 的增加也使引物設計及選擇難度的增加，因此，引物的設計和選擇對RPA的結果至關重要。 RPA技術正處于起步研宄階段，尚無專門的引物、探針設計軟件，也沒有大量的數據為其引 物設計原則提供依據。因此，本發明的引物和探針組合是需要從靶標序列兩端設計多對引 物進行優化、篩選才能得到。
[0012] 本發明還提供了一種檢測IBRV的試劑盒，該試劑盒中包含有用于通過RPA技術檢 測IBRV的引物和探針組合。
[0013] 進一步的，該試劑盒中還包括有：IBRV陽性對照模板、RPA擴增試劑、去離子水和 側流層析檢測試劑。IBRV陽性對照模板、RPA擴增試劑、去離子水與引物和探針組合一起構 成擴增體系。
[0014] 所述RPA擴增試劑包括Rehydration緩沖液、大腸桿菌來源的recA重組酶、鏈置 換DNA聚合酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB)、280mM醋酸鎂（MgAc)溶液。
[0015] 所述RPA側流層析檢測試劑包括側流層析試紙條，雜交檢測緩沖液 (1XPBS+0. 1% Tween20)。
[0016] 所述IBRV陽性對照模板的制備方法為：分別在SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的引物對的上游和下游設計引物：
[0017] 上游引物：5' -GCCAAGCGCAGCAGGCAGGTGAAT-3'（SEQ ID No. 4);
[0018] 下游引物：5' -CGACTGGGCGTACATCTCGGAGAA-3'（SEQ ID No. 5);
[0019] 以IBRV的DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為50 μ L:10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 5yL、2. 5mM dNTP Mixture 8yL、LA Taq 0.5yL(5U/yL)、模板 2yL， 10 μ mol/L的上下游引物各2 μ L，滅菌超純水加至50 μ L。反應程序為94°C預變性3min，然 后進入94°C 30s，55°C 30s，72°C 40s，共進行31個循環；72°C延伸10min，最后停止于4°C。 PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片斷后克隆至pEAST-T3載體，（為常規的載體， 商業化購買到）藍白斑篩選重組質粒，送華大基因進行測序，將測序結果進行比對，正確的 重組質粒為IBRV陽性對照模板。
[0020] 具體的，一種檢測IBRV的試劑盒，每50 μ L擴增體系中含有正向引物、反向引物各 2. 1 μ L (10 μ mol/L)，探針 0· 6 μ L (10 μ mol/L)，IBRV 陽性對照模板 2 μ L，Rehydration 緩沖 液29. 5 μ L，去離子水11. 2 μ L和醋酸鎂溶液（280mM) 2. 5 μ L。
[0021] 本發明還提供一種應用RPA技術并結合側流層析技術檢測IBRV的方法，步驟如 下：
[0022] (1)應用快速提取病毒基因組DNA試劑盒提取細胞培養病毒上清液的IBRV DNA ;
[0023] (2)根據IBRV保守區域設計RPA特異性引物和探針，向RPA擴增試劑盒推 薦反應的50 yL擴增體系中加入正向引物、反向引物各2. I yL(10 μ mol/L)，探針 0· 6 yL(10 ymol/L)，模板 DNA 2 yL，29. 5 yLRehydration 緩沖液，11. 2 yL 去離子水和 2. 5 μ L醋酸鎂溶液（280mM)，于含有凍干酶粉的0. 2mL TwistAmp nfo反應管中，恒溫水浴 鍋內38 °C反應25分鐘；
[0024] (3)取I UL擴增產物，應用側流層析試紙條進行檢測，若側流層析試紙條上顯現 出檢測帶和對照帶，則檢測結果為陽性，若試紙條僅顯示對照帶，則結果為陰性。
[0025] 應用上述方法可以篩選出一套可快速有效檢測出IBRV成分的引物及探針組合。
[0026] 以已知病毒滴度為8. OX IO7TCID5cZmL的IBRV用去離子水進行10倍系列稀釋后， 提取DNA后進行同步檢測，結果顯示可以檢測到0. STCID5tl的靶標分子，證明該方法具有較 高的靈敏度。
[0027] 以8. OX Io3TCID5qIBRV樣品的DNA作為模板，利用上述優化的引物