一種a型和b型沃爾巴克氏體的熒光檢測引物及其檢測方法和檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種伊蚊沃爾巴克氏體的熒光檢測引物及 其檢測方法和檢測試劑盒。
【背景技術】：
[0002] 沃爾巴克氏體（Wolbachia)是廣泛分布于節肢動物體內的共生微生物，它可能是 昆蟲共生微生物中最為豐富的類群。它分布于鞘翅目、雙翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗 翅目等昆蟲種類中。它以垂直傳播作為其在宿主世代間傳遞的基本模式。它穩定地存在于 宿主的生殖細胞內，通過卵細胞傳遞給宿主子代，并可通過多種方式如細胞質不親和、雌性 化和殺雄性等調控宿主的生殖活動。通過這些調控作用促進其在宿主種群內廣泛傳播。
[0003] 在沃爾巴克氏體（Wolbachia)引起的宿主生殖行為改變中，細胞質不親和 (Cytoplasmic Incompatibility，Cl)是最常見的一種類型。它表現為當被沃爾巴克氏 體（Wolbachia)感染的雄蚊與未感染雌蚊或感染不同種類Wolbachia的雌雄蚊交配時，精 子和卵子結合后胚胎無法發育。沃爾巴克氏體（Wolbachia)的胞質不親和的特性可導致 Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同種Wolbachia的蚊群進行種群壓制和種群替 代。它的應用對蚊媒病防治具有巨大的價值。近期研宄發現，沃爾巴克氏體（Wolbachia) 不僅具有上述的特性外，同時它還能在蚊子體內與蚊子攜帶的一些重要的病原生物（如 登革病毒，瘧原蟲等）相互作用，抑制它們在蚊子體內的增值和擴散從而在阻斷這些病原 生物傳播于人類。沃爾巴克氏體（Wolbachia)的這種抑制作用與它在蚊子體內組織的分 布相關，所以，了解沃爾巴克氏體（Wolbachia)在蚊子體內組織分布有助于快速篩選出傳 播阻斷效果最好的沃爾巴克氏體（Wolbachia)感染的蚊子，也有助于監測沃爾巴克氏體 (Wolbachia)在蚊群中的垂直傳播，同時也有利于高效率地監測大規模大地域范圍的沃爾 巴克氏體（Wolbachia)在蚊子組織中的感染情況。
[0004] 在自然界中，蚊子的種類有很多，常見的有伊蚊和庫蚊兩種。伊蚊分為白紋伊蚊和 埃及伊蚊，其中埃及伊蚊不攜帶沃爾巴克氏體。由于沃爾巴克氏菌只能存活于宿主體內，不 能在體外自由生活，因而如何有效特異地檢測沃爾巴克氏菌是對該細菌研宄的必備工具。 比較常用的檢測手段有聚合酶鏈反應法（PCR法）和免疫染色法。免疫染色法耗時耗力，而 且特異性不好。隨著PCR方法的普及，針對沃爾巴克氏體的檢測有了很大的進步。不同蚊 種攜帶不同的沃爾巴克氏體，通過PCR結果能夠直觀的看出蚊子攜帶的不同沃爾巴克氏體 類型，這樣為我們的日常檢測提供了很大的便利。目前針對不同沃爾巴克氏體PCR檢測的 方法還不完善。

【發明內容】
：
[0005] 本發明的目的是提供一種專一性強、特異性高和靈敏度高的A型和B型沃爾巴克 氏體的熒光檢測引物。
[0006] 本發明的A型和B型沃爾巴克氏體的熒光檢測引物，其特征在于，包括
[0007] (1)針對A型沃爾巴克氏體：
[0008] wAlbAF :5' -CCAGATACTATTGCAGACAGTTTAA-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所 示）；
[0009] wAlbAR :5'-CAACACCAATATATGGAGTGATA-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示）；
[0010] 探針 A :5' -CCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATC-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 所 示）；
[0011] 探針的兩端分別結合有熒光發生基團FAM和熒光淬滅基團BHQl ;
[0012] (2)針對B型沃爾巴克氏體：
[0013] wAlbBF :5' -CGATATCAGGGTTGATGTTGA-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4 所示）；
[0014] wAlbBR :5'-CAATCGCTATATCGTAATAAACG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示）；
[0015] 探針 B :5' -CCAACAACTGTTGCAAACAGTGTGG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 6 所 示）；
[0016] 探針的兩端分別結合有熒光發生基團HEX和熒光淬滅基團BHQl。
[0017] 本發明的第二個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的A型和B型沃爾巴克 氏體的檢測方法，其特征在于，提取樣品DNA，以該樣品DNA為模板，使用上述A型和B型沃 爾巴克氏體的熒光檢測引物wAlbAF、wAlbAR、探針A、wAlbBF、wAlbBR和探針B，進行熒光定 量PCR擴增，擴增反應完成后，根據探針標記的熒光發生基團的熒光信號，讀取并記錄樣品 的PCR循環次數Ct，根據樣品的Ct值，按照建立的判斷標準，判斷樣品是否含有A型和B型 沃爾巴克氏體的。
[0018] 所述的進行熒光定量PCR擴增，其反應條件優選為：預變性50°C 5分鐘，95°C 15 分鐘；擴增94°C 15秒、55°C 45秒，40個循環；55°C的時候收集焚光信號。
[0019] 本發明的第三個目的是提供一種A型和B型沃爾巴克氏體的檢測試劑盒，包括熒 光檢測引物和PCR試劑，其特征在于，所述的熒光檢測引物為：
[0020] (1)針對A型沃爾巴克氏體：
[0021] wAlbAF :5' -CCAGATACTATTGCAGACAGTTTAA-3' ；
[0022] wAlbAR :5' -CAACACCAATATATGGAGTGATA-3' ；
[0023] 探針 A :5' -CCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATC-3' ；
[0024] 探針的兩端分別結合有熒光發生基團FAM和熒光淬滅基團BHQl ;
[0025] (2)針對B型沃爾巴克氏體：
[0026] wAlbBF :5' -CGATATCAGGGTTGATGTTGA-3' ；
[0027] wAlbBR :5' -CAATCGCTATATCGTAATAAACG-3' ；
[0028] 探針 B :5' -CCAACAACTGTTGCAAACAGTGTGG-3' ；
[0029] 探針的兩端分別結合有熒光發生基團HEX和熒光淬滅基團BHQl。
[0030] 利用本發明的熒光檢測引物組按照本發明的檢測方法能夠快速高效專一的檢測 出A型和B型沃爾巴克氏體，具有專一性強，特異性高（只檢測出伊蚊沃爾巴克氏體，而且 能分別出是A型還是B型還是A、B混合型沃爾巴克氏體，而庫蚊沃爾巴克氏體不發生擴 增），靈敏度高，其最低檢測限為l〇〇copies/ml。
[0031] 因此，本發明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡便等優點。
【附圖說明】：
[0032] 圖1是伊蚊A型沃爾巴克氏體的靈敏度的實驗結果圖，其中I、II、III、IV分別代表 DNA抽提液，10、100、1000倍稀釋的DNA抽提液；
[0033] 圖2是伊蚊B型沃爾巴克氏體的靈敏度的實驗結果圖，其中I、II、III、IV分別代表 DNA抽提液，10、100、1000倍稀釋的DNA抽提液；
[0034] 圖3是伊蚊沃爾巴克氏體的重復性的實驗結果圖，其中I、11分別代表不同的蚊 子的擴增曲線；
[0035] 圖4是FAM檢測通道對A型沃爾巴克氏體的特異性的實驗結果圖；
[0036] 圖5是FAM檢測通道對B型和wPip型沃爾巴克氏體（庫蚊沃爾巴克氏體）的特 異性的實驗結果圖；
[0037] 圖6是HEX檢測通道對B型沃爾巴克氏體的特異性的實驗結果圖；
[0038] 圖7是HEX檢測通道對A型和wPip型沃爾巴克氏體（庫蚊沃爾巴克氏體）的特 異性的實驗結果圖。
【具體實施方式】：
[0039] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0040] 實施例1 :靈敏度
[0041] 一、A型沃爾巴克氏體的靈敏度
[0042] 1、一只廣州白紋伊蚊（攜帶伊蚊A型沃爾巴克氏體）經二氧化碳熏暈后，解剖腹 部置于0. 2ul EP管中；
[0043] 2、加入 20ul DNA 提取液（DNA 提取液的配方為：30mM Na0H、0. 25mM EDTA、 15mMTris-HCl，溶劑為水，使用前需振蕩，將白色片狀物一同加入）；
[0044] 3、充分混勻；
[0045] 4、瞬時離心后，99°C溫浴10分鐘；
[0046] 5、得到DNA抽提液，_20°C保存，即獲得伊蚊A型沃爾巴克氏體的基因組DNA
[0047] 6、將上述含有伊蚊A型沃爾巴克氏體的基因組DNA的DNA抽提液進行10、100、 1000倍梯度稀釋作為模板DNA，每個梯度有兩個平行，共8個樣本；
[0048] 7、PCR擴增體系：
[0049] 模板 DNA 2 μ I、PCR A 液 18 μ 1 和 PCR B 液 2 μ 1。
[0050] 所述的 PCR A 液，每 18 μ 1 含有 IOpmol 熒光檢測引物 wAlbAF(5'-CCAGATACTATTG CAGACAGITTAA-3'）、IOpmol 熒光檢測引物 wAlbAR(5,-CAACACCAATATATGGAGTGA TA-3'）、5pmol 探針 A (5' -CCTTTGAAAGACGCTGTGAATGATC-3'，探針的兩端分別結合有熒 光發生基團FAM和熒光淬滅基團BHQl)，IOpmol熒光檢測引物wAlbBF (5' -CGATATCA GGGTTGATGTTGA-3'）、IOpmol 熒光檢測引物 wAlbBR(5, -CAATCGCTATATCGTAATAAAC G-3'）、 5pmol探針B(5' -CCAACAACTGTTGCAAACAGTGTGG-3'，探針的兩端分別結合有熒光發生基團 HEX和熒光淬滅基團BHQl)，其余為pH值為8. 0的緩沖液。所述的緩沖液成份為50mmol/L Tris-HCl、8mmol/L MgC12、250mmol/L KC1，溶劑為水。
[0051] 所述的PCR B液由熱啟動Taq酶、逆轉錄酶、dNTPs組成，每2 μ I PCR B液中含有 熱啟動Taq酶5U、逆轉錄酶2. 5U和dNTPs lOmmol，其余為水。
[0052] 8、混勻后進行PCR擴增；
[0053] 9、PCR反應條件：
[0054] 預變性 50°C 2min
[0055] 95 °C 15min
[0056] 擴增 94 °C 15s
[0057] 55°C 45s 40個循環，55°C時收集熒光
[0058] 10.擴增結束后觀察擴增曲線。
[0059] 具體結果如圖1所示，結果判斷標準：如果出現待測基因的擴增反應曲線，且Ct值 小于38,則判斷為陽性，如果38〈Ct〈40,判斷為可疑，可疑加大模板量，重復擴增，如果得到 相同的實驗結果，則判斷為陽性，否則為陰性，如果Ct值為0或40,則判斷為陰性。
[0060] 從圖1可以看出，DNA抽提液、10、100、1000倍稀釋的DNA抽提液都能擴增出反應 曲線，其Ct都小于38,判斷為陽性，1000倍稀釋的溶液中的DNA濃度為lOOcopies/ml。由 此，本發明的焚光檢測引物的檢測下限為l〇〇copies/ml。
[0061] 二、B型沃爾巴克氏體的靈敏度
[0062] B型沃爾巴克氏體的靈敏度的實驗流程同A型沃爾巴克氏體的靈敏度試驗，只是 模板DNA換成B型沃爾巴克氏體的基因組DNA。
[0063] 具體結果如圖2所示，結果判斷標準：如果出現待測基因的擴增反應曲線，且Ct值 小于38,則