專利名稱：檢測ibr病毒抗體的金標免疫滲濾試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測IBR病毒抗體的金標免疫滲濾試劑盒及檢測方法。
背景技術：
牛傳染性鼻氣管炎(Infectiousbovine rhinotracheitis, IBR),是由牛皰疫病毒I型引起的牛的一種接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、上呼吸道及氣管粘膜發炎以及生殖道感染、結膜炎等為主要特征。一般牛群臨床發病率約20%-30%，但血清反應陽性率要高得多，由于本病有潛伏感染和機體長期排毒的性質，抗體陽性牛實際上就是隱性帶毒者。IBRV具有典型的泛嗜性，能侵襲多種器官和組織，引起多種臨床癥狀，給養牛業造成較大的經濟損失，是國際動物貿易中進口種牛、牛精液時的重點檢疫對象和進口國應高度關注的 動物疫病之一，我國農業部將其列為二類動物疫病。牛傳染性鼻氣管炎幾乎遍布世界各地，我國主要奶牛進口國澳大利亞、新西蘭等國均有發生。該病于1955年在美國科羅拉多州的育肥菜牛被首次報道，我國于1980年從新西蘭進口的奶牛體內首次分離到IBRV，隨后的血清學調查證實我國多個省市的牛群中均有一定比例的IBR抗體陽性牛存在。近幾年從國外進口奶牛中也不同程度的檢出抗體陽性牛和分離出該病毒。因此清除IBR抗體陽性牛，排除潛伏感染動物是控制IBR最好最簡單的方法，但關鍵問題是要率先建立一種檢測IBR陽性牛的方法。目前，國內已有的針對牛傳染性鼻氣管炎檢測的國家標準和行業標準，包括經細胞培養分離病毒，病毒核酸的PCR檢測、病毒抗體的血清中和試驗和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。檢驗過程繁瑣，病毒檢測需要5d-6d才能報告陽性結果，血清抗體檢測方法中最快速的ELISA方法也需要2h-4h。而且現行檢測IBR抗體的試劑多為從國外進口的ELISA診斷試劑盒，價格昂貴推高了檢測成本，同時還需要酶標儀等特定儀器、操作者的實驗技能和一定的試驗環境條件，難以在基層臨床中推廣。

發明內容
為了解決上述實際問題，本發明的目的在于提供一種檢測IBR病毒抗體的金標免疫滲濾試劑盒及檢測方法，本發明具有特異、敏感、快速可靠、效果直觀、結果容易判斷等優點，且不需要特殊儀器設備，檢測樣品的檢測結果可以保存備查。為達到上述目的，本發明采用以下技術方案
本發明首先提供了一種檢測IBR病毒抗體的金標免疫滲濾試劑盒，所述試劑盒的組成包括
a)牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原；
b)金標記羊抗牛抗體；
c)洗滌液；
d)封閉液。所述牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原的制備方法如下采用無血清培養方法在牛腎傳代細胞上培養牛傳染性鼻氣管炎病毒，將牛傳染性鼻氣管炎病毒的培養液反復凍融3次，5000 r/min離心30 min,取上清液裝入透析袋中，置于0. 01 mol/L pH7. 4 PBS緩沖液中透
析，直至培養液透明清亮為止，然后將透析液濃縮。所述無血清培養方法采用不添加血清的基礎培養基DMEM/F12 (1:1)，培養條件為37°C>5% C02。所述封閉液為含10g/L 酪蛋白、O. 5mL/L 吐溫-20 (Tween-20)的 O. 01 mol/LρΗ7· 2 的 PBS 溶液或含 5g/L 酪蛋白、O. 5mL/L Tween-20 的 O. 01 mol/L ρΗ7· 2 的 PBS 溶液；所述洗滌液為含O. 5ml/L Tween-20的O. 01mol/L ρΗ7· 2的PBS緩沖液。本發明還提供了一種利用所述金標免疫滲濾試劑盒檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的方法，先將牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原點樣于硝酸纖維素膜上，用封閉液封閉后加待測血清樣品，洗滌液洗滌，然后加金標記羊抗牛抗體，洗滌液洗滌，觀察結果，若點樣處出現紅色斑點即為陽性，若不出現紅色斑點即為陰性。
在試劑盒內硝酸纖維素膜上對稱位置點樣如下一點為牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原I μ L作為檢測點，另一點為葡萄球菌A蛋白IyL作為質控點；室溫干燥后加入IOOyL封閉液；待封閉液干燥后，加入待檢血清50-100 μ L ;滲入后加入洗滌液洗滌；加金標記羊抗牛抗體100 μ L ;滲入后加入洗漆液洗漆,洗去未結合的金標記羊抗牛抗體；5 min-10min內若在硝酸纖維素膜上點樣處出現紅色斑點即為陽性，若不出現紅色斑點即為陰性，作為試驗有效的標志，質控點應出現紅色斑點，否則該膜無效，應重新點制膜。所述點樣時牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原濃度為0. 95 mg/mL 一 I. 81mg/mL，葡萄球菌A蛋白濃度為I g/ L0所述的金標記羊抗牛抗體，其制備方法如下采用檸檬酸三鈉還原法制備納米膠體金溶液，然后在納米膠體金溶液中加入羊抗牛抗體；納米膠體金溶液采用常規制備將IOOml 0. lml/L氯金酸溶液加熱至沸騰，在磁力加熱攪拌條件下迅速加入10g/L檸檬酸鈉溶液，在攪拌下恒溫回流反應制得。取納米膠體金溶膠，用0.1 mol/L K2COdM pH值至7. 6。然后在每mL膠體金溶液中加入2. 5 μ g羊抗牛抗體，磁力攪拌狀態下逐滴加入，30 min后加Λ 50g/L聚乙二醇20 000 (PEG 20 000)至終濃度lg/L，再繼續攪拌15 min，最后置4°C冰箱過夜，以此液標記為原體積。次日將此液以5 000 r/min離心lOmin，取上清液15 000r/min離心Ih,棄上清。在沉淀用重懸緩沖液恢復至原體積。15 000 r/min離心30min,棄上清。沉淀用膠體金稀釋液恢復至原體積的1/40-1/5，置4°C冰箱保存。其中制備的納米膠體金顆粒的直徑為20nm-30nm。所采用的重懸緩沖液為含10g/L牛血清白蛋白(BSA)、0.5g/L PEG 20 000、
O.5mL/L Tween-20,0. Olmol/L PH7. 2的PBS緩沖液；所采用的膠體金稀釋液為含10g/LBSA、0.5g/L PEG 20 000、50g/L 蔗糖、0. 5mL/L Tween-20,0. Olmol/L PH7. 2 的 PBS 緩沖液。所述試劑盒為塑料正方形小盒，體積為4. 8cmX 3. OcmXO. 7cm,分底和蓋兩部分，蓋面有直徑0.5cm圓孔。盒內有兩層，朝蓋的為硝酸纖維素膜(NC膜)，NC膜下緊貼特制的吸水紙墊。本發明的有益效果是本發明是以無血清培養的牛傳染性鼻氣管炎病毒作為抗原，采用納米膠體金免疫標記技術，研究建立檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的納米膠體金免疫滲濾檢測試劑盒。采用硝酸纖維素膜(NC膜)為載體，先將抗原點制于NC膜上，經封閉液封閉后加入待測樣品，待樣品滲入后洗滌，再加入納米膠體金標記的抗體，應用納米膠體金顯色的特點將抗原抗體反應信號放大，使反應結果能夠在固相載體——NC膜上得以顯示。該方法具有特異、敏感、快速可靠、效果直觀、結果容易判斷等優點，且不需要特殊儀器設備，檢測樣品的檢測結果可以保存用于回顧性檢查。通過應用本發明納米膠體金免疫滲濾檢測法和ELISA方法同時對300份臨床奶牛血清樣品進行檢測，用納米膠體金免疫滲濾檢測法檢測結果陽性血清為17份，陰性血清為283份；ELISA法的檢測結果陽性血清為18份，陰性血清為182份。納米膠體金免疫滲濾檢測法和ELISA方法的陽性率分別為5. 7%和
6.0%,兩者對目標陽性樣品檢測符合率達94. 4%。本發明建立的方法用于牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體檢測，具有特異、敏感、易于操作、結果便于判斷，而且與藍舌病、牛赤羽病、牛白血病、牛病毒性腹瀉粘膜病、豬瘟病、豬偽狂犬病和豬細小病毒病陽性血清均無交叉反應。該方法的成功建立，能夠相對快速簡單地對臨床牛只是否感染IBR的情況做出判斷，將為有效控制牛傳染性鼻氣管炎的傳播發揮重 要而積極的作用。目前未見國內外利用納米膠體金免疫標記技術檢測牛傳染性鼻氣管炎的報道，該技術有望為出入境(特別是入境種牛)的牛傳染性鼻氣管炎檢測提供一種快速靈敏、簡便可靠的方法，從而在進境種牛隔離檢疫工作中得到應用，同時也為國內牛群中該病的流行病學調查、臨床診斷提供依據。


圖I為本發明最佳點樣抗原濃度及納米膠體金標記羊抗牛抗體濃度的交叉試驗結果圖；其中A D-金標羊抗牛IgG，分別為原體積的1/40，1/20，1/10，1/5. ;1 5 -包被 IBR抗原 1μ L，濃度分別為 O. 1131mg/mL，0. 2263 mg/mL,O. 4525 mg/mL, O. 95 mg/mL, I. 81mg/mL ;C，質控點-包被葡萄球菌A蛋白I μ L，濃度為I g/L。圖2為本發明NC膜上用于抗原包被的封閉液的選擇結果圖；其中1.含10g/LBSA、5mL/L Tween-20 的 O. 01 mol/L ρΗ7·2 的 PBS封閉；2.含 5g/L BSA、5mL/L Tween-20 的
0.Olmol/L pH7. 2 的 PBS 封閉；3.含 lOg/L 酪蛋白、5mL/L Tween-20 的 0. 01 mol/L pH7. 2的 PBS 封閉；4.含 5g/L 酪蛋白、5mL/L Tween-20 的 0. 01 mol/L pH7. 2 的 PBS 封閉；5.含lOg/L 酪蛋白、0. 5mL/L Tween-20 的 0. 01 mol/L PH7. 2 的 PBS 封閉；6.含 5g/L 酪蛋白、
0.5mL/L Tween-20 的 O. 01 mol/L pH7. 2 的 PBS 封閉· S —血清樣品；C —質控點。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明作進一步詳細的說明，但不應理解為是對本發明進行的限定。I、本實施例首先制備和濃縮牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原
在牛腎傳代細胞(BK細胞)上，采用不添加血清的基礎培養基DMEM/F12 (1:1)(購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司)，37°C、5% CO2條件下培養牛傳染性鼻氣管炎病毒，將無血清培養液培養的IBR病毒培養液反復凍融3次，5 000 r/min離心30 min，取上清液裝入透析袋中，置于0.01 mo I / L pH7.4 PBS緩沖液中透析過夜，其間換液數次，直到細胞培養液透明清亮為止。然后用真空離心濃縮儀離心濃縮。用紫外分光光度計測其在260nm和280 nm處光密度值。根據經驗公式計算病毒蛋白液的蛋白含量。分裝后于_20°C凍存備用。
2、羊抗牛抗體膠體金的制備
I)納米膠體金的制備采用檸檬酸還原法制備納米膠體金溶膠。取10mL/L氯金酸(購自上海市試劑總廠化學試劑一廠)I mL加入到100 mL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸溶液的濃度為O. lmL/L，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下快速加入10g/L檸檬酸三鈉(購自國藥集團化學試劑有限公司)水溶液2 mL,繼續加熱煮沸直到溶液呈葡萄酒色為止。得到的膠體金顆粒直徑為(20-30) nm。冷卻后置棕色瓶于4°C冰箱保存。2)羊抗牛抗體納米膠體金標記物的制備取需制備量的納米膠體金溶液，用O. Imol/L K2CO3(購自國藥集團化學試劑有限公司)調pH值至7. 6。然后在每mL膠體金溶液加入2. 5 μ g羊抗牛抗體(購于德國Santa Cruz Biotechnology公司),磁力攪拌狀態下逐滴 加入，30 min后加入50g/L PEG 20 000至終濃度lg/L，再繼續攪拌15 min，最后置4°C冰箱過夜。第二天將此液以5 000 r/min離心IOmin,取上清液15 000 r/min離心Ih,棄上清。沉淀用重懸緩沖液(含 10g/L BSA、0.5g/L PEG 20 000、0· 5mL/L Tween-20,0. Olmol/LPH7. 2的PBS緩沖液)恢復至原體積(指膠體金標記后、離心前的體積)。15 000 r/min離心30min，棄上清。沉淀用膠體金稀釋液(含10g/L BSA、0. 5g/L PEG20 000、50g/L蔗糖、0. 5mL/L Tween-20,0. Olmol/L PH7. 2的PBS緩沖液)恢復至原體積的1/40，置4°C冰箱保存。3、反應盒的制作反應試劑盒為塑料正方形小盒，體積為4. 8cmX3. OcmXO. 7cm,分底和蓋兩部分，蓋面有直徑0.5cm圓孔。盒內有兩層，朝蓋的為硝酸纖維素膜(NC膜)(購于Schleicher & Schuell公司)，NC膜下緊貼特制的吸水紙墊(購于Schleicher &Schuell 公司)ο4、應用反應試劑盒作為載體，先將步驟a)中制備的牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原點樣于硝酸纖維素膜上，封閉后加待測血清樣品，洗滌后用步驟b)中制備的羊抗牛抗體納米膠體金檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體。實施例I
在上述3中制備的反應盒圓孔內NC膜上對稱位置點如下兩點一點是IBR抗原((0.95 I. 81) mg/mL) I μ L作為檢測點，另一點是葡萄球菌A蛋白(購于衛生部上海生物制品研究所)(lg/L) IyL作為質控點；室溫干燥后加入100 μ L封閉液；待封閉液干燥后，加入待檢血清(50-100) μ L ;滲入后加入洗滌液100 μ L洗滌，重復2_3遍；加羊抗牛抗體膠體金標記物100 μ L ;滲入后加入洗滌液100 μ L洗滌，重復2_3遍，洗去未結合的羊抗牛抗體膠體金標記物。5 min內若在膜上點樣處出現紅色斑點即為陽性，若不出現紅色斑點即為陰性。作為試驗有效的標志，質控點應出現紅色斑點，否則該試驗無效，應重新點制膜。實施例2
最佳抗原濃度和最佳羊抗牛抗體膠體金標記物濃度的選擇，分別以I. 81 mg/mL、0. 95mg/mL、0. 4525 mg/mL、0. 2263 mg/mL 和 0. 1131mg/mL 5 種濃度的純化 IBR 抗原 IyL 點樣，重復4份，加入臨床上經ELISA方法確認的臨界IBR陽性血清100 μ L，洗滌后分別加入不同濃度的金標羊抗牛抗體(分別為原體積的1/40，1/20，1/10，1/5)，進行交叉反應。篩選最佳抗原濃度和最佳羊抗牛抗體膠體金標記物濃度。如圖I所示，本實施例所做的實驗為Α D反應盒內圓孔上，平行對稱點制和包被IBR抗原I μ L，I 5濃度分別為0. 1131mg/mL,
0.2263 mg/mL,0.4525 mg/mL,O. 95 mg/mL, I. 81 mg/mL ;圓孔內 C 為質控點，包被葡萄球菌A蛋白lyL，濃度為I g/L ;A D反應盒分別代表圓孔上加入不同濃度的羊抗牛IgG膠體金標記物，A D依次為原體積的1/40，1/20，1/10，1/5。由圖I結果顯示可見IBR抗原以(O. 95 I. 81)mg/mL點樣包被，羊抗牛IgG膠體金標記物使用量為原體積1/10時，符合斑點顏色清晰而且是能檢出臨界陽性血清的最低點樣抗原濃度和最低金標羊抗牛抗體濃度的要求。因此，選擇點樣抗原濃度為(O. 95 — I. 81) mg/mL，金標羊抗牛抗體濃度為原體積的 1/10。實施例3
封閉液的配方選擇，如圖2所示，本實施例所做的試驗為經IBR抗原點樣制備的NC膜分別用以下6種封閉液進行封閉(I)含10g/L BSA、5mL/L Tween-20的O. 01 mo l/L ρΗ7· 2的 PBS ;⑵含 5g/L BSA、5mL/L Tween-20 的 0. Olmol/L pH7. 2 的 PBS ; (3)含 lOg/L 酪蛋白、5mL/L Tween-20 的 0. 01 mol/L pH7. 2 的 PBS ； (4)含 5g/L 酪蛋白、5mL/L Tween-20 的0. 01 mol/L pH7. 2 的 PBS ；(5)含 lOg/L 酪蛋白、0. 5mL/L Tween-20 的 0. 01 mol/L PH7. 2的 PBS ； (6)含 5g/L 酪蛋白、0. 5mL/L Tween-20 的 0. 01 mol/L pH7. 2 的 PBS。經過反復實驗測試，結果為采用第5種或第6種封閉液，即以含10g/L酪蛋白、0. 5mL/L Tween-20的
0.01 mol/L PH7.2 的 PBS 或含 5g/L 酪蛋白、0.5mL/L Tween-20 的 0. 01 mol/L ρΗ7· 2 的PBS作為封閉液，封閉效果最好，符合斑點顯色清楚且背景較淺的最適封閉液選擇要求。可以理解，很多細節的變化是可能的，但這并不因此違背本發明的范圍和精神，任何所屬技術領域的普通技術人員對其所做的適當變化，皆應視為不脫離本發明專利的范疇。
權利要求
1.一種檢測IBR病毒抗體的金標免疫滲濾試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的組成包括 a.牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原； b.金標記羊抗牛抗體； c.洗滌液； d.封閉液。
2.根據權利要求I所述的檢測IBR病毒抗體的金標免疫滲濾試劑盒，其特征在于，所述牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原的制備方法如下采用無血清培養方法在牛腎傳代細胞上培養牛傳染性鼻氣管炎病毒，將牛傳染性鼻氣管炎病毒的培養液反復凍融3次，5000 r/min離心30 min，取上清液裝入透析袋中，置于O. 01 mo I/L pH7. 4 PBS緩沖液中透析，直至培養液透明清亮為止，然后將透析液濃縮。
3.根據權利要求I所述的檢測IBR病毒抗體的金標免疫滲濾試劑盒，其特征在于，所述封閉液為含10g/L酪蛋白、O. 5mL/L吐溫-20的O. 01 mo I/L pH7. 2的PBS溶液或含5g/L酪蛋白、O. 5mL/L吐溫-20的O. 01 mo I/L pH7. 2的PBS溶液；所述洗滌液為含O. 5ml/L吐溫-20 的 O. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS 緩沖液。
4.一種利用權利要求1-3中任一種所述金標免疫滲濾試劑盒檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的方法，其特征在于先將牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原點樣于硝酸纖維素膜上，用封閉液封閉后加待測血清樣品，洗滌液洗滌，然后加金標記羊抗牛抗體，洗滌液洗滌，觀察結果，若點樣處出現紅色斑點即為陽性，若不出現紅色斑點即為陰性。
5.根據權利要求4所述的利用金標免疫滲濾試劑盒檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的方法，其特征在于在試劑盒內硝酸纖維素膜上對稱位置點樣如下一點為牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原IyL作為檢測點，另一點為葡萄球菌A蛋白IyL作為質控點；室溫干燥后加入100 μ L封閉液；待封閉液干燥后，加入待檢血清50 μ L — 100 μ L ;滲入后加入洗漆液洗滌；加金標記羊抗牛抗體100 μ L ;滲入后加入洗滌液洗滌，洗去未結合的金標記羊抗牛抗體；5 min-10min內若在硝酸纖維素膜上點樣處出現紅色斑點即為陽性，若不出現紅色斑點即為陰性，作為試驗有效的標志，質控點應出現紅色斑點，否則該膜無效，應重新點制膜。
6.根據權利要求4所述的一種利用金標免疫滲濾試劑盒檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述金標記羊抗牛抗體采用檸檬酸三鈉還原法制備納米膠體金溶液，然后在納米膠體金溶液中加入羊抗牛抗體；其中所采用的重懸緩沖液為含10g/L牛血清白蛋白、0. 5g/L 聚乙二醇 20 000、0.5mL/L 吐溫 _20、0. 01mol/L PH7. 2 的 PBS 緩沖液；所采用的膠體金稀釋液為含10g/L牛血清白蛋白、0. 5g/L聚乙二醇20 000、50g/L蔗糖、0.5mL/L 吐溫-20,0. 01mol/L PH7. 2 的 PBS 緩沖液。
7.根據權利要求5所述的一種利用金標免疫滲濾試劑盒檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述點樣時牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原濃度為0. 95 mg/mL 一1.81mg/mL,葡萄球菌A蛋白濃度為I g/ L。
全文摘要
本發明公開一種檢測IBR病毒抗體的金標免疫滲濾試劑盒及檢測方法，具體包括以下步驟所述試劑盒的組成包括a)牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原；b)金標記羊抗牛抗體；c)洗滌液；d)封閉液。先將牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原點樣于硝酸纖維素膜上，封閉后加待測血清樣品，洗滌后用金標記羊抗牛抗體作為膠體金標記蛋白檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體。采用本發明的試劑盒用于牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的檢測,具有特異、敏感、快速可靠、效果直觀、結果容易判斷等優點，且不需要特殊儀器設備，檢測結果可以保存備查。
文檔編號G01N33/531GK102692499SQ20121020487
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者劉正才, 唐泰山, 孔繁德, 張體銀, 徐淑菲, 王武軍, 白泉陽, 鄭騰, 高麗欽, 黃一帆 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心