專利名稱：用于治療或預防皰疹病毒感染癥的醫藥組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于治療或預防皰疹病毒感染癥的醫藥組合物等。
背景技術：
皰疫病毒(Herpesvirus)是將線狀雙鏈DNA作為基因組而具有的DNA病毒,具有正二十面體的核衣殼被囊膜覆蓋的結構。分類為α、β、Y三種亞科，但是病毒學上重要的病毒屬于α皰疫病毒亞科。
α皰疹病毒亞科分類有單純皰疹病毒、水痘病毒、馬立克病病毒以及傳染性喉氣管炎病毒。
作為單純皰疫病毒(Herpes simplex virus,HSV)的重要的例子,可以舉出將人作為宿主的單純皰疹病毒I (HSV-I)以及單純皰疹病毒2 (HSV-2)。如果HSV通過皮膚或者粘膜而感染人，則會成為皮膚粘膜疾病的病因，還會引起致死性腦炎。
并且，初次感染后，即使病情治愈仍潛伏感染于體內，頻繁地再激活而引起復發性感染。
并且，屬于水痘病毒且作為重要的例子，可以舉出豬水皰疹病毒I。 豬水皰疹病毒 I還被稱為偽狂犬病病毒，成為豬奧捷士奇病的病因。
皰疹病毒的向宿主細胞的感染，是通過由病毒側以及細胞側的多種因子參與的復雜的過程(process)進行的。
皰疹病毒具有囊膜，從囊膜突出有糖蛋白B以及糖蛋白D(以下，有時分別稱為 “gB”以及“gD”。)的兩種糖蛋白。向宿主細胞感染時，需要這些糖蛋白與細胞表面的受體結合，在病毒顆粒與細胞之間產生膜融合。
迄今為止，已知曉gD將細胞表面的皰疫病毒侵入介體(Herpes Virus Entry Mediator,HVEM)以及結合素(nectin)作為受體的事實(例如，參照非專利文獻I以及2)。
并且，本發明的發明者們發現II型成對免疫球蛋白樣受體(Paired Immunoglobulin-like type 2Receptor, PILR)與 gB 特異性結合，并確認出 HSV 感染 PILR 表達細胞、對于PILR表達細胞的HSV感染被抗PILR抗體抑制、以及gB與PILR的締合 (associate)會誘導HSV與細胞的細胞融合(例如，參照專利文獻I)。PILR是在HK細胞、 樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞等的免疫細胞中表達的蛋白。
并且，屬于水痘病毒的水痘帶狀皰疹病毒(VZV)也具有作為囊膜蛋白的gB。本發明的發明者們發現VZV的gB與稱為髓鞘相關糖蛋白(Myelin Associated Glycoprotein, MAG)的神經組織特異性分子結合，并確認出VZV感染MAG表達細胞、對于MAG表達細胞的 VZV感染被抗MAG抗體抑制、以及gB與MAG的締合會誘導VZV與MAG表達細胞的膜融合。 MAG是特異性地分布在腦、脊髓、末梢神經組織的細胞表面分子，已知其控制神經細胞中的軸索的延伸。
并且，進一步研究的結果，發現HSV也通過gB與MAG的結合而與宿主細胞膜融合 (以上例如參照非專利文獻3)。
然而，PILR、MAG均只有在極其有限的種類的培養細胞中表達。在體內試驗(in vivo),這些gB受體的表達一般也只限于骨髓細胞和神經膠質細胞(glia cell)。
另一方面，皰疹病毒在體外試驗(in vitro)能夠感染多種培養細胞，在體內試驗 (in vivo)，將作為原發感染部位的上皮細胞和用于形成潛伏感染的神經細胞作為最重要的靶標。
因此，可以認為與gB結合而作為皰疹病毒的受體起作用的細胞表面分子不止只有 PILR 和 MAG。
為了抑制gB與其受體的結合，也可以利用使用抗gB抗體等而阻斷(block)病毒上的受體結合部位的方法。但是，如果使用例如抗gB抗體等與病毒結合的物質，則病毒自身可能會產生變異而避免受到該物質的阻滯。
另一方面，目前，阿昔洛韋作為抗皰疫病毒藥而廣為使用。如果阿昔洛韋在皰疫感染細胞中被磷酸化，則會成為活性形式，抑制DNA聚合酶而防止病毒增殖。因此，雖然對于感染細胞，起殺害作用，但是不能防止病毒感染本身。據此，不能從體內排除潛伏 感染病毒， 從而不能阻止復發性感染、不能迅速抑制感染擴散。并且，報道指出還存在對阿昔洛韋表現出抗性的皰疫病毒。
并且，最近，報道有通過給予肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑、或基于RNAi法抑制肌球蛋白輕鏈激酶的表達，可抑制HSV-I的即早基因(immediate early gene)的表達(參照非專利文獻4)。在同文獻中，記載有肌球蛋白輕鏈激酶的抑制不影響病毒與宿主細胞的結合、 以及病毒向宿主細胞的攝取。因此，建立了以下假說肌球蛋白II不參與病毒向宿主細胞的侵入，而HSV-I侵入到細胞的結果，可能導致肌球蛋白II活化，使細胞表面附近的肌動蛋白細胞骨架(actin cytoskeleton)重構,從而使HSV-I容易通過肌動蛋白皮質。
現有技術文獻
專利文獻
專利文獻I :國際公開第W02008/084710號公報
非專利文獻
非專利文獻I Montgomery, R. I.等，Cell, 1996,87 :427-436
非專利文獻2 :Geraghty，R. J.等，Science，1998，280 :1618-1620
非專利文獻3 Suenaga, T.,等，Proc. Natl. Acad. Sci. USAdoi 10. 1073/ pnas. 0913351107
非專利文獻4:Koithan T.等，The 34th International Herpesvirus Workshop, July 25to 31，2009，Ithaca，New York, USA, Abstract 4. 31發明內容
技術問題
本發明的目的在于，發現在多種細胞中表達且作為皰疹病毒的受體起作用的蛋白，并且提供通過抑制該受體與皰疹病毒的結合而防止病毒向細胞侵入的皰疹病毒感染癥的預防劑或者治療劑。
技術方案
本發明的發明者們為了解決上述問題，反復進行了研究，其結果發現，與上述的非專利文獻4的假說不同，如果皰疹病毒開始感染生物個體，則在細胞表面誘導出存在于包括肌細胞的所有細胞中的非肌肉肌球蛋白重鏈IIA以及非肌肉肌球蛋白重鏈IIB(以下有時分別稱為“NMHC-IIA”、“NMHC-IIB”。)，其C末端突出到細胞外，通過與作為皰疹病毒表面的糖蛋白的gB結合，作為宿主細胞的侵入受體(entry receptor)起作用。
并且，確認出NMHC-IIA以及NMHC-IIB的向細胞表面附近的轉移，是由于如果皰疹病毒感染，則控制非肌肉肌球蛋白IIA以及非肌肉肌球蛋白IIB(以下有時分別稱為 “NM-IIA”、“NM-IIB”。)的細胞內定位的肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)的功能被增進,其結果,NM-IIA、NM-IIB 的調節輕鏈(regulatory light chain, RLC) 的磷酸化被增強而引起的。
進一步地，發現通過抑制MLCK、抑制NMHC-IIA或者NMHC-IIB的表達、給予抗 NMHC-IIA抗體、給予MLCK顯性負性突變體等，據此能夠防止皰疹病毒的向細胞的侵入，由此完成了本發明。
SP，本發明涉及以下[I] [19]。
[I] 一種用于預防或治療皰疹病毒感染癥的醫藥組合物，該醫藥組合物作為有效成分而包含抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB結合的物質。
[2]如上述[I]所述的醫藥組合物，所述的抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈 IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB結合的物質，是肌球蛋白三磷酸腺苷酶活性抑制劑或者肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑。
[3]如上述[2]所述的醫藥組合物，所述肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑是ML-7。
[4]如上述[2]所述的醫藥組合物，所述肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑是肌球蛋白輕鏈激酶途徑抑制劑。
[5]如上述[4]所述的醫藥組合物，所述肌球蛋白輕鏈激酶途徑抑制劑是從由鈣調蛋白拮抗劑、鈣螯合物、鈣拮抗劑組成的組中選擇的。
[6]如上述[2]所述的醫藥組合物，所述肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑是肌球蛋白輕鏈激酶的顯性負性突變體。
[7]如上述[I]所述的醫藥組合物，所述的抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈 IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB結合的物質，是針對非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB的抗體。
[8]如上述[7]所述的醫藥組合物，所述抗體與由序列號為I或7中所記載的氨基酸序列構成的肽結合。
[9]如上述[7]所述的醫藥組合物，所述抗體與非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB中的、當皰疹病毒感染時露出到細胞外的區域結合。
[10]如上述[I]所述的醫藥組合物，所述的抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈 IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB結合的物質，是抑制非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB表達的物質。
[11]如上述[10]所述的醫藥組合物，所述的抑制非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB表達的物質，是從由具有RNAi效應的雙鏈核酸、反義核酸、核酶以及編碼這些的核酸組成的組中選擇的。
[12]如上述[I]所述的醫藥組合物，所述的抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈 IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB結合的物質，是可溶性非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者可溶性非肌肉肌球蛋白重鏈IIB。
[13]如上述[I]至[12]中任意一項所述的醫藥組合物，所述皰疹病毒是單純皰疹病毒、豬水皰疹病毒I型或者巨細胞病毒。
[14] 一種雙鏈RNA，由序列號為3以及序列號為4中所記載的堿基序列構成，對于非肌肉肌球蛋白重鏈IIA具有RNAi效應。
[15] 一種核酸,包含由序列號為5中所記載的堿基序列構成的DNA,編碼對于非肌肉肌球蛋白重鏈IIA具有RNAi效應的雙鏈RNA。
[16] 一種雙鏈RNA，由序列號為9以及序列號為10中所記載的堿基序列構成，對于非肌肉肌球蛋白重鏈IIB具有RNAi效應。
[17] 一種核酸,包含由序列號為11中所記載的堿基序列構成的DNA,編碼對于非肌肉肌球蛋白重鏈IIB具有RNAi效應的雙鏈RNA。
[18] 一種篩選用于預防或治療皰疹病毒感染癥的醫藥的方法，包括以下工序用候選化合物處理表達非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB的細胞；向所述細胞感染皰疹病毒；測定在所述細胞中的非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB的向細胞膜附近的移動、或者向所述細胞的皰疹病毒的侵入中的至少一個。
[19] 一種篩選用于預防或治療皰疹病毒感染癥的醫藥的方法，包括以下工序在非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB與糖蛋白B能夠結合的條件下，使非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB與糖蛋白B和候選化合物接觸；測定非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB與糖蛋白B的結合。
有益效果
本發明的醫藥組合物，由于抑制在多種細胞中作為皰疹病毒的侵入受體(entry receptor)起作用的NMHC-I IA或者NMHC-IIB與皰疹病毒表面的糖蛋白gB的結合，因此可以抑制向機體內的所有細胞的皰疹病毒的感染。
并且，本發明的醫藥組合物，由于防止病毒向細胞侵入，因此不僅有感染細胞中的病毒的殺害效果，而且還通過預防從某個細胞到其他細胞的感染擴散，由此可以從體內排除潛伏感染病毒而防止復發性感染。
并且，包含于本發明的醫藥組合物中的、作為抑制NMHC-IIA或者NMHC-IIB與gB 結合的物質，如果使用抗體或核酸等機體來源的物質，則能夠獲得副作用小、安全性高的醫藥。
尤其，包含于本發明的醫藥組合物中的、作為抑制NMHC-IIA或者NMHC-IIB與gB 結合的物質，如果使用NM-IIA或NM-IIB的抑制劑、抗NMHC-IIA抗體或抗NMHC-IIB抗體、 NMHC-IIA或NMHC-IIB的表達抑制物質等，則由于作用于受體(NMHC-IIA或NMHC-IIB)側而非皰疹病毒，因此也不會發生因病毒變異而失效。


圖IA表示向MEF細胞感染YK711，用抗myc抗體以及抗Flag抗體進行免疫沉淀， 對沉淀物進行電泳，并銀染的結果。
圖IB表示向Vero細胞感染各種HSV-I，用抗Flag抗體或者抗gB抗體進行免疫沉淀，對沉淀物用抗NMHC-IIA抗體進行免疫印跡的結果。
圖2A表示通過流式細胞術對可溶性NMHC-IIA的C末端片段與各種HSV-I的結合進行分析的結果。
圖2B表示通過流式細胞術對HSV-I的gB轉染子或gD轉染子與可溶性NMHC-IIA 的C末端片段的結合進行分析的結果。
圖3A表示向Vero細胞感染HSV-1，用熒光顯微鏡觀察NMHC-IIA的細胞內定位的結果。
圖3B表示使感染了 HSV-I細胞的細胞表面蛋白生物素化，用親和素珠進行免疫沉淀，接著用抗NMHC-IIA抗體進行免疫印跡的結果。
圖3C是分別向細胞感染gB表達HSV-I和gH表達HSV-I，使細胞表面蛋白生物素化后，用抗Flag抗體進行沉淀的結果。
圖4A是通過流式細胞術研究了對于用MLCK抑制劑ML-7進行前處理的細胞的、 HSV-I的感染的結果。
圖4B表示通過熒光顯微鏡對用MLCK抑制劑ML-7經過前處理的細胞中的、HSV-I 侵入時的細胞膜附近的NMHC-IIA濃度進行觀察的結果。
圖4C表示使用流感病毒進行了與圖4A同樣的實驗的結果。
圖5A是通過流式細胞術分析了對于用抗NMHC-IIA血清經過前處理的Vero細胞的、HSV-I的感染的結果。
圖5B是通過流式細胞術分析了對于用抗NMHC-IIA血清經過前處理的 CHO-hNectin-Ι細胞的、HSV-1的感染的結果。
圖5C是通過流式細胞術分析了對于用抗NMHC-IIA血清經過前處理的CHO-PILRa 細胞的、HSV-I的感染的結果。
圖6A是通過流式細胞術分析了對于用shRNA敲減NMHC-IIA的細胞的、HSV-I的感染的結果。
圖6B是通過流式細胞術分析了對于用shRNA敲減NMHC-IIA的細胞的、流感病毒的感染的結果。
圖6C是敲減NMHC-IIA的細胞與HSV-I的膜融合測試的結果。
圖6D是敲減NMHC-IIA的細胞中的、VSV包膜G蛋白介導性的膜融合測試的結果。
圖7A表示通過免疫印跡法確認HL60/NMHC-IIA中的NMHC-IIA過表達的結果。
圖7B表示通過流式細胞術分析了對于NMHC-IIA過表達細胞的HSV-I的感染的結果O
圖7C表示通過熒光顯微鏡觀察了對于NMHC-IIA過表達細胞的HSV-I的感染的結果O
圖7D表示通過流式細胞術分析了抗NMHC-IIA血清對于HSV-I感染NMHC-IIA過表達細胞的影響的結果。
圖7E表示通過流式細胞術分析了對于NMHC-IIA過表達細胞的偽狂犬病病毒的感染、以及基于抗NMHC-IIA血清的對感染的抑制的結果。
圖8為概略性示出YK711以及YK712制造方法的圖。
圖9A表示通過流式細胞術分析了對于用阿昔洛韋經過前處理的細胞的HSV-I的侵入的結果。
圖9B表示通過流式細胞術分析了對于用ML-7經過前處理的細胞的HSV-I的侵入的結果。
圖9C表示通過流式細胞術分析了對于用抗NMHC-IIA血清經過前處理的細胞的 HSV-I的侵入的結果。
圖10表示向Vero細胞在MLCK抑制劑(ML_7)的存在下或不存在下感染HSV-I，通過免疫印跡測定RLC的磷酸化的結果。
圖IlA表示向Vero細胞感染HSV-1，在MLCK抑制劑(BAPTA-AM)存在下或不存在下靜置后，通過使用抗NMHC-IIA抗體的免疫熒光法分析了 NMHC-IIA的細胞內定位的結果。
圖IIB表示向Vero細胞在MLCK抑制劑(BAPTA-AM)存在下或不存在下感染HSV-I， 通過免疫印跡測定了 RLC的磷酸化的結果。
圖IlC表示向Vero細胞在圖示的濃度的BAPTA-AM存在下或不存在下感染 HSV-1GFP，通過流式細胞術測定了平均熒光強度的結果。
圖IID表示向Vero細胞在圖示的濃度的BAPTA-AM存在下或不存在下感染流感病毒，通過流式細胞術測定了平均熒光強度的結果。
圖12A表示向利用空表達質粒(Vector)或者MCLK的顯性負性突變體的表達質粒 (Dn-MLCK)轉染的Vero細胞感染HSV-I，通過使用抗磷酸化RLC抗體或抗RLC抗體的免疫印跡而測定RLC的磷酸化的結果。
圖12B表示從上述圖12A的結果求出相對于全RLC蛋白量的磷酸化RLC蛋白質的相對量的結果。
圖12C表示向利用空表達質粒(Vector)或者MCLK的顯性負性突變體的表達質粒 (Dn-MLCK)轉染的Vero細胞感染野生型HSV-1GFP，通過流式細胞術測定平均熒光強度的結果O
圖12D表示向利用空表達質粒(Vector)或者MCLK的顯性負性突變體的表達質粒 (Dn-MLCK)轉染的Vero細胞感染野生型流感病毒，通過流式細胞術測定平均熒光強度的結果O
圖13是向小鼠角膜感染模型預先給予MLCK抑制劑ML-7后，接種野生型HSV-I，研究淚中的病毒效價、角膜炎癥狀、生存率的結果。
圖14是向小鼠角膜感染模型同時給予MLCK抑制劑ML-7和野生型HSV-1，研究生存率的結果。
圖15是向小鼠角膜感染模型預先給予MLCK抑制劑BAPTA-AM后，接種野生型 HSV-I，研究生存率的結果。
圖16A是研究Vero細胞以及Cos-I細胞中的NMHC-IIA和NMHC-IIB蛋白的表達的結果。
圖16B表示向Cos-I細胞感染YK711或YK712，用抗Flag抗體進行免疫沉淀，對沉淀物用抗NMHC-IIB抗體進行免疫印跡的結果。
圖16C表示向Cos-I細胞感染野生型HSV_1 (F)，用抗Flag抗體或抗gB抗體進行免疫沉淀，對沉淀物用抗NMHC-IIB抗體進行免疫印跡的結果。
圖17A表示通過流式細胞術分析HSV-I的gB轉染子或gD轉染子與可溶性 NMHC-IIB的C末端片段的結合的結果。
圖17B表示通過流式細胞術分析HSV-I的gB轉染子或gD轉染子與對照Fe (⑶200)結合的結果。
圖18A表示用ML-7進行前處理或者不進行前處理，使感染HSV-I的Cos-I細胞表面生物素化，通過親和素珠進行免疫沉淀，接著用抗NMHC-IIB抗體進行免疫印跡的結果。
圖18B是通過流式細胞術研究對于用MLCK抑制劑ML-7經過前處理的Cos-I細胞的HSV-I感染的結果。
圖18C表示使用流感病毒進行與圖18B同樣的實驗的結果。
圖19A表示確認Cos-I細胞中的NMHC-IIB的基于shRNA的敲減的免疫印跡的結果O
圖19B是通過流式細胞術分析對于用shRNA敲減NMHC-IIB的細胞的HSV-I感染的結果。
圖19C是通過流式細胞術分析對于用shRNA敲減NMHC-IIB的細胞的流感病毒感染的結果。
圖19D是敲減NMHC-IIB的細胞與HSV-I的膜融合測試的結果。
圖19E是敲減NMHC-IIB的細胞中的VSV包膜G蛋白介導性的膜融合測試的結果。
圖20A表示通過免疫印跡法確認IC21/NMHC-IIB細胞中的NMHC-IIB的過表達的結果。·
圖20B表示通過熒光顯微鏡觀察對于NMHC-IIB過表達細胞的HSV-I的感染的結果O
圖20C表示通過流式細胞術分析對于NMHC-IIB過表達細胞的HSV-I的感染的結果O
圖21A表示向Cos-I細胞在圖示的濃度的BAPTA-AM存在下或不存在下感染 HSV-1GFP，通過流式細胞術測定平均熒光強度的結果。
圖21B表示向Cos-I細胞在圖示的濃度的BAPTA-AM存在下或不存在下感染流感病毒，通過流式細胞術測定平均熒光強度的結果。
圖22是通過流式細胞術研究對于用ML-7經過前処理的細胞的HSV-2的感染的結果O
圖23是通過流式細胞術分析對于用抗NMHC-IIArod小鼠血清或抗NMHC-IIBrod 小鼠血清經過前処理的細胞的HSV-I的感染的結果。
圖24是通過流式細胞術分析對于用抗NMHC-IIArod小鼠血清或抗NMHC-IIBrod 小鼠血清經過前処理的細胞的HSV-2的感染的結果。
圖25是通過熒光顯微鏡觀察對于用抗NMHC-IIArod小鼠血清或抗NMHC-IIBrod 小鼠血清經過前処理的細胞的HCMV的感染的結果。
圖26是通過FACS測定對于用抗NMHC-IIArod小鼠血清或抗NMHC-IIBrod小鼠血清經過前処理的細胞的HCMV的感染的結果。
圖27是通過流式細胞術測定對于敲減NMHC-IIA的細胞的HSV-2的感染的結果。
圖28是通過流式細胞術測定對于敲減NMHC-IIB的細胞的HSV-2的感染的結果。
圖29是通過流式細胞術測定對于NMHC-IIA過表達細胞的HSV-2的感染的結果。
圖30是通過流式細胞術測定對于NMHC-IIB過表達細胞的HSV-2的感染的結果。
具體實施方式
以下，對本發明的實施方式進行說明。
本發明所涉及的醫藥組合物，是用于治療或預防皰疹病毒感染癥的醫藥組合物， 其特征在于，包含抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB 結合的物質。
皰疹病毒是指如上所述的動物DNA病毒，皰疹病毒科的病毒被分類成α、β、Y三個亞科。如上所述，α皰疫病毒亞科進一步被分類成單純皰疫病毒、水痘病毒、馬立克病病毒、傳染性喉氣管炎病毒，作為代表性病毒，可以舉出單純皰疹病毒I (HSV-I)、單純皰疹病毒2 (HSV-2)、水痘/帶狀皰疹病毒、豬水皰疹病毒I (偽狂犬病病毒)、牛皰疹病毒等。
作為屬于β皰疹病毒亞科的病毒，已知有人類巨細胞病毒(HCMV)等，而作為屬于 Y皰疹病毒亞科的病毒，已知有EB病毒、卡波西肉瘤相關皰疹病毒等。
作為屬于Y皰疫病毒亞科的病毒，具有代表性的是淋巴隱病毒 (Lymphocryptovirus)屬的愛潑斯坦-巴爾病毒(EB病毒)等。
本發明所涉及的醫藥組合物，可以用于任何α、β、Υ亞科的皰疹病毒感染癥。例如，可用于α皰疫病毒的HSV-I、HSV-2、豬水皰疫病毒I (偽狂犬病病毒)，β皰疫病毒的 HCMV, Y皰疹病毒的EB病毒的感染癥。
單純皰疹病毒是指皰疹病毒的一種，如上所述分類成HSV-l、HSV-2。HSV-1主要引起口唇皰疹，可成為皰疹性口腔炎、皰疹性角膜炎、單純皰疹性腦炎等的病因，潛伏感染于三叉神經節。HSV-2主要可以成為生殖器皰疹、新生兒皰疹、皰疹性髓膜炎、皰疹性脊髓炎等的病因，潛伏感染于脊神經節。
巨細胞病毒在出生時或哺乳期的感染，大多屬于隱性感染，在兒童和成人中，也多數屬于隱性感染，但是還會引起肝炎或單核細胞增多癥。在諸如AIDS患者或惡性腫瘤患者等患有免疫不全的患者中，癥狀會加重。在該病毒引起的肺炎或視網膜炎的治療中，使用更昔洛韋。
豬水皰疹病毒I還被稱為偽狂犬病病毒，其感染癥屬于申報傳染病。感染例如豬等多種動物，對于豬主要是隱性感染，但是在豬以外的動物中表現出神經癥狀，經過急性病程至于死亡。
對于EB病毒而言，多數人在嬰兒期隱性感染，成為病原攜帶者。成人的感染成為傳染性單核細胞增多癥的病因，認為是伯基特氏淋巴瘤或鼻咽癌的病因。
在本說明書中，感染作為指病毒通過皮膚或粘膜而侵入到機體的過程、或者病毒表面的糖蛋白與細胞表面的受體(侵入受體)締合而通過膜融合侵入細胞內的過程的任意一個的用語而使用。并且，本說明書中，皰疹病毒的感染癥是指病毒侵入機體內的狀態，而與癥狀無關，包含持續感染、隱性感染、潛伏感染。
在本說明書中，皰疹病毒感染癥的治療或預防，以其最為廣義的意思使用，具體而言，是指使以下情況發生緩解與皰疹病毒的感染有關的一種或多種癥狀、或者阻止與皰疹病毒的感染有關的一種或多種癥狀惡化；抑制感染后癥狀的發生；阻止(遲延或停止)機體內的病毒向細胞感染；減少機體內的病毒數等。
糖蛋白B(gB)是指存在于皰疹病毒表面的一種糖蛋白。作為同樣的糖蛋白，有gD、 gH以及gL，其中gB以及gD與細胞表面的受體結合。為了使膜融合發生，因而病毒感染細胞，這需要gB以及gD這兩個蛋白與細胞表面的受體結合。
非肌肉肌球蛋白重鏈IIA(NMHC-IIA)是指作為非肌肉肌球蛋白II(NM-II)的一種重鏈異構體(heavy chain isoform)的非肌肉肌球蛋白IIA(NM-IIA)的重鏈亞型 (subunit)ο
并且，非肌肉肌球蛋白重鏈IIB(NMHC-IIB)是指作為NM-II的一種重鏈異構體的非肌肉肌球蛋白IIB(NM-IIB)的重鏈亞型。
NM-II存在于包括肌肉細胞的所有細胞，是在細胞質分裂、細胞的移動、細胞的形態變化等細胞運動中，起重要的作用的蛋白。NM-II如肌肉的肌球蛋白一樣，由各兩條的重鏈、必需輕鏈以及調節輕鏈的六個亞基構成，由兩個球狀的頭部和細長的尾部(Rod Domain (桿狀結構域))構成。頭部由包含ATPase (三磷酸腺苷酶)活性部位以及肌動蛋白結合部位的馬達結構域(motor domain)、作為輕鏈結合部位的頸(neck)構成。桿狀結構域呈α-螺旋型卷曲螺旋(a-helical coiled-coil)構型,NM-II締合而參與雙極性蛋白絲的形成。C末端(桿狀結構域前端)不呈卷曲螺旋(coiled-coil)構型。
對于脊椎動物的NM-II而言，如果調節輕鏈的Serl9因Ca2+-鈣調蛋白依賴性的肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)而被磷酸化,則會增強ATPase活性， 以能夠形成蛋白絲。
在脊椎動物中，存在三種NM-II重鏈異構體，分別形成同源二聚體(Homodimer)而成為NM-IIA,NM-IIB,NM-IIC0其中，對于NM-IIA和NM-IIB而言，其氨基酸序列以及性質非常相似，報道有NM-IIA和匪-IIB的重鏈的基因敲除小鼠均導致胚胎死亡。并且，NMHC- IIA 與NMHC-IIB具有約80%的同源性。
如后述的實施例所示，機體內存在富含(dominant)NMHC-IIA的細胞(例如上皮細胞)、富含(dominant) NMHC-IIB的細胞(例如神經細胞)、以及只表達NMHC-IIA或NMHC-IIB 的任意一種蛋白重鏈的細胞，也可以從這一事實認為，是具有相似的功能的蛋白(例如， 參照 Bresnik AR, Curr Opin Cell Biol. 1999Feb ；11 (I) :26-33. ；Sellers JR, Biochim Biophys Acta. 2000Mar 17; 1496 (I) :3-22 等)。
如上所述，迄今為止也有過關于NM-II和HSV-I感染的關系的報道，但是其內容是，NM-II不參與HSV-I向宿主細胞的侵入，NM-II在HSV-I侵入到細胞后被活化(非專利文獻4)。
然而，如后述的實施例所示，本發明的發明者們證實了如果皰疹病毒開始感染生物個體，則Ca2+-鈣調蛋白復合物使MLCK活化，據此NMHC-IIA以及NMHC-IIB被誘導在細胞表面。并且，確認出如果NMHC-IIA或NMHC-IIB與病毒表面的gB結合，則會引起病毒與細胞的膜融合，從而病毒侵入到細胞。
該結合可以通過將包含NM-IIA的C末端的片段作為抗原制備的抗體而被抑制，由此可以認為如果皰疹病毒感染，則NMHC-IIA或NMHC-IIB移動到細胞表面而其C末端露出到細胞外，作為皰疫病毒的侵入受體起作用。
需要說明的是，在本說明書中，侵入受體(entry receptor)是指因皰疹病毒與該受體結合而引起其后的皰疹病毒與細胞的膜融合的受體。、
在本說明書中，抑制gB與NMHC-IIA或NMHC-IIB結合的物質(以下，有時僅稱為 “結合抑制物質”。)，只要是直接或間接抑制gB與NMHC-IIA或NMHC-IIB結合的物質，沒有特別限制，可以使用低分子化合物、核酸、肽、蛋白等所有物質。具體而言，可以舉出NM-IIA 或NM-IIB的ATPase活性抑制劑、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的抑制劑、抗NMHC-IIA抗體、 抗NMHC-IIB抗體、NMHC-IIA或NMHC-IIB的表達抑制物質等。以下，對于這些物質進行說明。
(NMHC-IIA或NMHC-IIB的ATPase活性抑制劑、或者MLCK的抑制劑)
本發明的NMHC-IIA或NMHC-IIB的ATPase活性抑制劑、或者MLCK的抑制劑改變細胞內的NMHC-IIA或NMHC-IIB的定位，當皰疹病毒感染時，防止NMHC-IIA或NMHC-IIB移動到細胞表面。
作為ATPase活性抑制劑,例如可以舉出Blebbistatin。
作為MLCK的抑制劑，只要選擇性地抑制肌球蛋白輕鏈激酶，而且還抑制肌球蛋白輕鏈激酶的活性，貝1J可以使用蘇氨酸/絲氨酸激酶(Ser/Thrkinase)抑制劑、穿膜蛋白激酶抑制劑等。
具體而言，可以舉出A3、卡弗他丁 C(Calphostin C)、Goe6976、Goe7874、HA1077、 金絲桃素(Hypericin)、K_252a、KT5823、ML-7、ML_9、白皮杉醇(Piceatannol)、星形孢菌素 (Staurosporine)、W-5、W-7、W_12、W-13、渥曼青霉素(Wortmannin)等，但不限于此。其中， 優選為對MLCK的選擇性高的ML-7。
并且，由于MLCK為Ca2+-鈣調蛋白依賴性的，因此作為MLCK的抑制劑，還可以使用抑制MLCK途徑的物質。在本說明書中，MLCK途徑是指，表示Ca2+與鈣調蛋白形成復合物， 通過該復合物的結合使MLCK活化，MLCK使RLC磷酸化的一系列反應。因此，作為抑制MLCK 途徑的物質，可以舉出抑制Ca2+和鈣調蛋白的復合物形成的物質、或抑制Ca2+-鈣調蛋白復合物與MLCK結合的物質(例如，鈣調蛋白拮抗劑、鈣螯合物、鈣拮抗劑等)。
作為I丐螯合物，例如可以舉出 ΒΑΡΤΑ(0, O ' -Bis (2-aminophenyl) ethyleneglycol-N,N,N' ,N' -tetraacetic acid tetraacetoxy ester :0,0'-雙(2-氨苯基)乙二醇-N，N，N'，N'-四乙酸四(乙酰氧基酯))、BAPTA-AM(將所有的BAPTA的羧基進行乙酰甲酯化，由此容易使細胞吸收)，但是不限于此。
并且，作為抑制MLCK的功能的物質，還可以使用MLCK的顯性負性突變體。優選地,給予編碼顯性負性突變體的基因的載體,因而在機體內表達該突變體。該載體可以根據本領域的技術人員的常規方法制備。例如，可以舉出以下等方法在質粒等的克隆位點插入編碼MLCK的顯性負性突變體的DNA的方法；向細胞或大腸桿菌導入具有腺病毒載體的主干 (backbone)序列的質粒以及將與其相同的序列設置在編碼MLCK的顯性負性突變體的DNA 的兩端的穿梭質粒的這兩種質粒，通過同源重組而制備病毒載體的方法。
(抗NMHC-IIA 抗體、抗 NMHC-IIB 抗體)
本發明的抗NMHC-IIA抗體與NMHC-IIA特異性結合，其結果抑制NMHC-IIA與gB 結合。并且，本發明的抗NMHC-IIB抗體與NMHC-IIB特異性結合，其結果抑制NMHC-IIB與 gB結合。
本發明的發明者們確認出將包含NMHC-IIA的C末端的片段(相當于NMHC-IIA的第1665-1960位的肽，序列號1)作為抗原制備的抗體，抑制NMHC-IIA與皰疹病毒gB結合。 這一事實說明，如果NMHC-IIA因病毒感染而移動到細胞表面附近，則其C末端突出到細胞膜外，與gB結合。同樣地，對于因病毒感染而移動到細胞表面附近并C末端突出于細胞膜外的NMHC-IIB，也可以通過將包含其C末端的片段作為抗原制備的抗體，抑制與gB的結合。
對于本發明的抗NMHC-IIA抗體而言，只要抑制NMHC-IIA與gB結合，沒有特別限制，例如優選，與NMHC-IIA上的當皰疹病毒感染時露出到細胞外的區域結合的抗體。只要是這種抗體，通過與NMHC-IIA上的與gB的結合區域結合，能夠抑制NMHC-IIA與gB結合。
更加具體而言，例如可以舉出，在NMHC-IIA的C末端附近(例如從C末端到1000 氨基酸)，與約I 約500氨基酸、優選約100 約400氨基酸左右、更優選約200 300氨基酸左右的區域結合的抗體。作為一種例子，可以舉出與相當于NMHC-IIA的第1665位 I960位的區域結合的抗體。
并且，本發明的抗NMHC-IIB抗體而言，只要抑制NMHC-IIB與gB結合，沒有特別限制，例如優選，與NMHC-IIB上的當皰疹病毒感染時露出到細胞外的區域結合的抗體。只要是這種抗體，通過與NMHC-IIA上的與gB的結合區域結合，能夠抑制NMHC-IIB與gB結合。
更加具體而言，例如可以舉出，在NMHC-IIB的C末端附近(例如從C末端到1000 氨基酸)，與約I 約500氨基酸、優選約100 約400氨基酸左右、更優選約200 300氨基酸左右的區域結合的抗體。作為一種例子，可以舉出與相當于NMHC-IIB的第1672位 1976位的區域結合的抗體。
在本說明書中，“抗體”還包括抗體片段，本發明的抗NMHC-IIA抗體或抗 NMHC-IIB抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體，重組抗體、人源抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab 段(fragment of antigen binding :抗原結合段)、F(ab ' )2 抗體、 scFv (single-chain variable fragment :單鏈Fv)、雙重特異性抗體、合成抗體等。
這些抗體可以通過本領域的技術人員的公知的方法而制備。例如，單克隆抗體可以通過以下方法而獲得。即，從用NMHC-IIA或NMHC-IIB致敏的非人哺乳動物分離抗體產生細胞，將該細胞與骨髓瘤細胞等融合，制備雜交瘤細胞，純化該雜交瘤細胞產生的抗體， 由此獲得抗體。并且，多克隆抗體可以從用NMHC-IIA或NMHC-IIB致敏的動物的血清等獲得。
在此，用于免疫的NMHC-IIA或NMHC-IIB,可以是人源的，也可以是其他動物來源的，并且，可以使用全長，也可以使用片段，本領域的技術人員可以適宜決定。如果使用片段，例如可以使用在NMHC-IIA或NMHC-IIB中的、當皰疹病毒感染時露出到細胞外的區域的片段。并且，例如，可以是NMHC-IIA或NMHC-IIB的C末端附近(例如從C末端到1000氨基酸)的、約I 約500氨基酸、優選約100 約400氨基酸左右、更優選約200 300氨基酸左右的片段。例如，還可以使用由記載于序列號1的氨基酸序列構成的NMHC-IIA的由第1665位 1960位的296氨基酸構成的片段(以下，有時還稱為“NMHC-IIA的C末端片段”。)、或者由記載于序列號-J的氨基酸序列構成的NMHC-IIB的由第1672位 1976位的305氨基酸構成的片段(以下，有時還稱為“NMHC-IIB的C末端片段”。)。
并且，一旦獲得有效抑制NMHC-IIA或NMHC-IIB與皰疹病毒的結合的非人源單克隆抗體,則也可以通過基因重組法合成該抗體。例如,從產生該抗NMHC-IIA單克隆抗體的雜交瘤細胞通過標準操作規程制備總RNA，使用市場銷售的試劑盒而制備編碼抗NMHC-IIA抗體的mRNA，然后使用反轉錄酶合成cDNA，則可以獲得編碼抗NMHC-IIA抗體的DNA。將包含該DNA的表達載體轉染到適當的宿主細胞，在適當的條件下進行培養，由此可以使其表達抗NMHC-IIA抗體。也可以通過同樣的方法表達抗NMHC-IIB抗體。
并且，也可以通過將上述cDNA作為模板的PCR法，獲得編碼⑶R區域的DNA。也可以利用編碼該CDR區域的DNA，根據常規方法，并通過基因重組法而制備人源抗體或人源化抗體。例如，利用PCR法，合成編碼來源于非人源抗體的CDR區域的DNA以及設計成連接人源抗體的構架區的DNA，進一步地，連接編碼人源抗體恒定區的DNA，由此可以獲得編碼人源抗體的DNA。
將該DNA通過公知的方法(利用限制酶的方法等)插入到表達載體(例如，質粒、逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、花椰菜花葉病毒或煙草花葉病毒等植物病毒、 粘粒、YAC、EBV來源附加體)內，將該表達載體轉染到適當的宿主細胞，獲得轉染子。需要說明的是，表達載體還可以包括調控抗體基因的表達的啟動子、復制起始點、選擇標記基因等。啟動子以及復制起始點可以根據宿主細胞和載體的種類而適宜選擇。
接著，可以通過將轉染子在適當的條件下培養，表達抗NMHC-IIA抗體或抗 NMHC-IIB抗體的人源抗體。
作為宿主細胞，例如可以使用諸如哺乳動物細胞(CH0細胞、COS細胞、骨髓瘤細胞、HeLa細胞、Vero細胞等)、昆蟲細胞、植物細胞、真菌細胞(曲霉屬、酵母屬等)等真核細胞，或者大腸桿菌(E. Coli)、枯草菌等原核細胞。
對于表達出的抗體，可以通過適宜組合公知的方法(例如，使用蛋白A等的親和柱、其他的層析柱、過濾器、超過濾、鹽析、透析等)，進行分離純化。
當本發明的抗NMHC-IIA抗體或抗NMHC-IIB抗體為Fab段、F(ab' )2抗體、scFv 等低分子抗體時，還可以使用編碼低分子抗體的DNA，通過上述的方法進行表達，并且，還可以用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶處理并制備抗體。
(NMHC-I IA 或 NMHC-IIB 的表達抑制劑)
對于本發明的NMHC-IIA或NMHC-IIB的表達抑制劑而言，只要是在細胞內抑制 NMHC-IIA或NMHC-IIB的表達的物質，沒有特別限制，例如可以舉出具有RNAi效應的雙鏈核酸、反義核酸、核酶(ribozyme)以及編碼這些的核酸。通過抑制NMHC-IIA或NMHC-IIB的表達本身，由此減少被皰疹病毒感染時作為受體起作用的NMHC-IIA或NMHC-IIB，從而能夠防止皰疹病毒侵入到細胞內。
RNAi效應，是由雙鏈核酸誘導的序列特異性基因表達抑制機制。因為是目標特異性非常高的、且利用原本在機體內存在的基因表達抑制機制的方法，因此安全性高。
作為具有RNAi效應的雙鏈核酸，例如可以舉出siRNA。siRNA是當用在哺乳動物細胞時，通常為19 30個堿基左右、優選為21 25個堿基左右的雙鏈RNA。但是，作為本發明的NMHC-IIA或NMHC-IIB的表達抑制劑，也可以是與通過酶(Dicer)切割而可成為 siRNA的長度相比更長的雙鏈RNA。具有RNAi效應的雙鏈核酸一般在其一側具有與部分目標核酸互補的堿基序列，另一側具有與其互補的序列。具有RNAi效應的雙鏈核酸一般具有相互在3'末端突出的兩個突出堿基(overhang :懸端)，但也可以是不具有懸端的平末端 (blunt end)型。例如，25個堿基的平末端RNA具有以下優點使干擾素應答基因的活化最小化、防止正義鏈引起的脫靶(off-target)效應、在血清中穩定性非常高，并且還可適用于體內試驗(in vivo)。
具有RNAi效應的雙鏈核酸可以基于靶標基因的堿基序列，根據公知的方法而設計。并且，具有RNAi效應的雙鏈核酸可以是雙鏈RNA，可以是DNA-RNA嵌合雙鏈核酸，也可以是人工核酸或者經過各種修飾的核酸。
作為本發明的具有RNAi效應的雙鏈核酸，優選為將含有在編碼NMHC-IIA的基因中的記載于序列號2的堿基序列的區域為靶標的雙鏈核酸。作為這種雙鏈核酸，例如，可以舉出，由具有記載于序列號3的堿基序列的RNA以及具有記載于序列號4的堿基序列的RNA構成的雙鏈RNA。
并且，作為本發明的具有RNAi效應的雙鏈核酸，優選為將含有在編碼NMHC-IIB的基因中的記載于序列號8的堿基序列的區域為靶標的雙鏈核酸。作為這種雙鏈核酸，例如，可以舉出，由具有記載于序列號9的堿基序列的RNA以及具有記載于序列號10的堿基序列的RNA構成的雙鏈RNA。
反義核酸，是具有與靶標基因(基本上為轉錄產物的mRNA)互補的堿基序列的核酸，一般具有10個堿基長 100個堿基長、優選具有15堿基長 30個堿基長的單鏈核酸。 通過將反義核酸導入到細胞內，并與靶標基因雜交，由此抑制基因的表達。對于反義核酸而言，只要獲得對靶標基因的表達抑制效果，則可以是不完全與靶標基因互補的核酸。對于反義核酸而言，本領域的技術人員可以使用公知的軟件等而適宜設計。反義核酸可以是DNA、 RNA、DNA-RNA嵌合體中的任意個，并且也可以被修飾。
核酶是將靶標RNA進行催化水解的核酸分子，由具有與靶標RNA互補的序列的反義區域以及承擔剪切反應的催化中心區域構成。對于核酶而言，本領域的技術人員可以通過公知的方法而適宜設計。核酶一般是RNA分子，但是也可以使用DNA-RNA嵌合分子。
編碼上述的具有RNAi效應的雙鏈核酸、反義核酸、核酶中的任意個的核酸，也可以作為本發明的NMHC-IIA或者NMHC-IIB表達抑制劑使用。如果將包含這種核酸的載體導入到細胞內，則在細胞內表達具有RNAi效應的雙鏈核酸、反義核酸以及核酶，分別起 NMHC-IIA或者NMHC-IIB的表達抑制效果。
作為編碼具有RNAi效應的雙鏈核酸的核酸，可以使用分別編碼雙鏈的DNA，也可以使用編碼通過環介導而連接形成雙鏈核酸的單鏈核酸的DNA。如果是后者，通過在細胞內轉錄而獲得的單鏈RNA其互補的部分在分子內雜交，呈發夾(Hairpin)結構。該RNA稱為 shRNA (short hairpin RNA :短發夾RNA)。shRNA如果轉移到細胞質,則環部分因酶(Dicer) 而被切割，成為雙鏈RNA，引起RNAi效應。
上述的將記載于序列號2的堿基序列為靶標的雙鏈RNA，還可以通過使用記載于序列號5的DNA在細胞內表達shRNA而獲得。并且，將記載于序列號8的堿基序列為靶標的雙鏈RNA，還可以通過使用由記載于序列號11的堿基序列構成的DNA在細胞內表達 shRNA而獲得。
(可溶性NMHC-IIA或者可溶性NMHC-IIB)
本發明的可溶性NMHC-IIA在細胞外與皰疹病毒gB結合，其結果，抑制細胞表面的 NMHC-IIA與gB的結合。
可溶性NMHC-IIA具有與gB結合的功能，是含有全部或者部分的NMHC-IIA或者其突變體的分子。
當可溶性NMHC-IIA包含部分的NMHC-IIA時，只要具有與gB結合的功能，則無論包含哪一部分均可，但是，例如可以是NMHC-IIA的桿狀結構域或者C末端片段。
可溶性NMHC-IIA還可以是全部或者部分的NMHC-IIA與其他可溶性蛋白的融合蛋白。作為該可溶性蛋白，例如，可優選使用IgG蛋白或者其Fe段。
對于可溶性NMHC-IIA而言，本領域的技術人員可以通過基因重組方法而制備。
另一方面，本發明的可溶性NMHC-IIB在細胞外與皰疹病毒gB結合，其結果，抑制細胞表面的NMHC-IIB與gB結合。
可溶性NMHC-IIB具有與gB結合的功能，是含有全部或者部分的NMHC-IIB或者其突變體的分子。
當可溶性NMHC-IIB包含部分的NMHC-IIB時，只要具有與gB結合的功能，則無論包含哪一部分均可，但是，例如可以是NMHC-IIB的桿狀結構域或者C末端片段。
可溶性NMHC-IIB還可以是全部或者部分的NMHC-IIB與其他可溶性蛋白的融合蛋白。作為該可溶性蛋白，例如，可優選使用IgG蛋白或者其Fe段。
對于可溶型NMHC-IIB而言，本領域的技術人員可以通過基因重組方法而制備。
(醫藥組合物)
本發明的醫藥組合物可以通過經口或者非經口、全身或者局部給藥。例如，可以選擇點滴等靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射、坐藥、灌腸、經口性腸溶劑等，并且可以根據患者的年齡、癥狀而選擇適宜的給藥方法。
并且，在本發明的醫藥組合物中，還可以添加有防腐劑或穩定劑等制劑上可接受的載體。作為制劑上可接受的載體，是指可以與抑制gB與NMHC-IIA或者NMHC-IIB結合的物質(有效成分)一同給藥的材料。在制劑上可接受的載體，只要是在藥理學以及制劑學上可接受的物質，沒有特別限制。例如，可以舉出水、生理鹽水、磷酸緩沖液、葡萄糖、甘油、 乙醇等藥學上可接受的有機溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合·物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、雙甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、表面活性齊IJ、賦形齊U、芳香劑、防腐齊U、穩定劑、緩沖劑、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、促流動劑、矯味劑等，但是不限于這些載體。
本發明的醫藥組合物，可以制成通常的醫療制劑的形態。該醫療制劑可以使用上述的載體適宜地制備。作為醫療制劑的形態，沒有特別限制，可以根據治療目的適宜選擇而使用。作為其代表性的制劑，可以舉出片劑、丸劑、粉劑、液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、膠囊齊U、栓劑、注射劑(液劑、懸浮劑、乳劑)等。這些制劑通過通常使用的方法制造即可。
并且，本發明的醫藥組合物包含核酸時，可以在脂質體、聚合物膠束、陽離子載體等載體中包封核酸而制成藥劑。并且，也可以利用如魚精蛋白等核酸載體。還優選地，通過在這些載體上結合抗體等而使病灶靶標化。并且，還可以在核酸上結合膽固醇等而提高血中滯留性。并且，當本發明的醫藥組合物為包含編碼siRNA等的核酸且給藥后在細胞內表達的物質時，還可以將該核酸插入到逆轉錄病毒、腺病毒、仙臺病毒等病毒載體、或者脂質體等非病毒載體上，給予細胞內。
并且，對于包含于本發明的醫藥組合物的有效成分的量，本領域的技術人員可以根據有效成分的種類而適宜決定。例如，如果是抗NMHC-IIA抗體或者抗NMHC-IIB抗體，則給藥量可以為O. 025 50mg/kg,優選為O. I 50mg/kg,更優選為O. I 25mg/kg,尤其優選為O. I 10mg/kg或者O. I 3mg/kg,但并不限于此。
本發明的醫藥組合物可以以預防或者治療皰疹病毒感染癥為目的，向人或人以外的哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、豬、牛、馬、猴)等給藥。
(治療方法)
本發明還包括預防或治療皰疹病毒感染癥的方法，其特征在于將上述的本發明所涉及的醫藥組合物以治療有效量給藥。在本說明書中，治療有效量是指使以下情況發生的量緩解與皰疫病毒的感染有關的一種或多種癥狀、或者阻止與皰疫病毒的感染有關的一種或多種癥狀惡化；抑制感染后癥狀的發生；阻止(遲延或停止)機體內的病毒向細胞感染；減少機體內的病毒數等。
本發明的治療方法以人或人以外的哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、豬、牛、 馬、猴)為對象而使用。
(篩選方法)
本發明還提供一種篩選用于預防或治療皰疹病毒感染癥的醫藥的方法。
本發明所涉及的篩選方法的一種實施方式，包括以下工序用候選化合物處理表達NMHC-IIA或者NMHC-IIB的細胞；向所述細胞感染皰疹病毒；測定在所述細胞中的 NMHC-IIA或者NMHC-IIB向細胞膜附近的移動或者皰疹病毒向所述細胞的侵入中的至少一個。
表達NMHC-IIA或者NMHC-IIB的細胞可以是原本表達這些蛋白重鏈的細胞，也可以將原本不表達的細胞或者表達量少的細胞通過用包含編碼NMHC-IIA或者NMHC-IIB的基因的表達載體轉染而使其表達。作為原本表達NMHC-IIA的細胞，例如可以使用Vero細胞， 作為原本表達NMHC-IIB的細胞，可以使用VeiO細胞或者Cos-I細胞。并且，作為幾乎沒有發現原本表達NMHC-IIA的細胞，可以使用HL60細胞，作為幾乎沒有發 現原本表達NMHC-IIB 的細胞，可以使用IC21細胞。
候選化合物可以是諸如低分子化合物、高分子化合物、肽、蛋白質、核酸等任何物質。用候選化合物的處理可以在感染之前進行，也可以與感染工序并行，或者還可以在感染后進行，本領域的技術人員可以根據候選化合物的性質而決定其方法。
對于NMHC-IIA或者NMHC-IIB向細胞膜附近的移動而言，如后述的實施例所述的那樣，通過將熒光標記的抗NMHC-IIA抗體或者抗NMHC-IIB抗體與NMHC-IIA、NMHC-IIB結合，并用熒光顯微鏡檢測，由此可以進行觀察。并且，對于皰疹病毒向細胞內的侵入而言，如后述的實施例所述的那樣，具有綠色熒光蛋白(GFP)或者增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達盒(expression cassette)的基因重組皰疫病毒作為皰疫病毒進行感染，由此可以通過熒光顯微鏡容易觀察。
由此選擇的醫藥抑制NMHC-IIA或者NMHC-IIB作為皰疹病毒的gB受體發揮作用， 作為皰疫病毒的預防或治療藥物有用。
并且，本發明所涉及的篩選方法的另一種實施形態，包括以下工序在NMHC-IIA 或者NMHC-IIB與gB能夠結合的條件下，使NMHC-IIA或者NMHC-IIB與gB和候選化合物接觸；測定NMHC-IIA或者NMHC-IIB與gB的結合。
對于NMHC-IIA或者NMHC-IIB而言，可以使用提純的物質，也可以使用表達 NMHC-IIA或者NMHC-IIB的細胞。并且，也可以使用包含與gB的結合部位的部分肽或者可溶性肽。并且，對于gB而言，可以使用表面具有gB的病毒，或者如后述的實施例I所述的那樣，也可以使用感染了病毒的細胞。
對于測定NMHC-IIA或者NMHC-IIB與gB結合的工序而言，本領域的技術人員可以適宜選擇諸如免疫沉淀法、流式細胞術(flow cytometry)等檢測蛋白之間的相互作用的公知的方法而進行。
實施例
以下，基于實施例具體說明本發明，但是本發明并不受這些實施例的任何限制。
[病毒]
在以下的實施例中所使用的各種病毒如下。
YK711 以及 YK712
分別是表達用Myc-TEV-Flag(MEF) tag標記的gB(MEF-gB)或者用 Myc-TEV-Flag(MEF) tag 標記的 gH(MEF-gH)的重組 HSV-1。根據 Kato 等人的方法(Kato, A.等 J Virol 82,6172-6189(2008))，使用含有 pYEbacl02 的 E. coli GS1783 (Jarosinski, K.等 J Virol 81,10575-87.),并通過兩步式 Red 重組法(two-step Red-mediated mutagenesis ；Jarosinski, K.等 J Virol 81,10575-87.)而制備。
調整方法概略地示出在圖8。
野生型HSV-1 (F)、rB缺失病毒以及其回復突變病毒缺失病毒中缺失的姐序列被復原的病毒)
根據Satoh等人以及Kawaguchi等人的方法，做了準備(Kawaguchi, Y.等J Virol 73,4456-60. , Satoh, T.等 Cell 132，935-44.)。
HSV-1 GFP
是在UL3基因以及UL4基因的基因間區，在Egr-I啟動子的調控下，具有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達盒的基因重組HSV-I。
HSV-2 GFP
是在UL50基因以及UL51基因的基因間區，在巨細胞病毒啟動子的調控下，具有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達盒以及桿狀病毒質粒(bacmid)的基因重組HSV-2 (J. Virol. 83 :11624-11634,2009.)。
PRY GFP
是在gG位點，在人類巨細胞病毒啟動子的調控下，具有EGFP的重組偽狂犬病病毒 PRV151。從 Dr. L. ff. Enquist 得到提供。
HSV-IGFP以及PRV GFP在培養細胞中如同野生型病毒一樣地成長，只在感染的細胞內表達熒光蛋白。
HCMV ADsubU21. 5
GFP 表達 HCMV(Wang D.等，PNAS 101 :16642-16647，2004)是從 Dr. T. Shenk 獲得的。
[融合蛋白、肽等]
在實施例中所使用的融合蛋白和肽，是通過以下的質粒而表達的。
DGEX-NMHC-IIArod
是用于產生谷胱苷妝疏基轉移酶(Glutathion-S-transferase)和NMHC-IIA的C 末端片段(序列號1)的融合蛋白(GST-NMHC-IIArod)的質粒。從pEGFP_ARF296 (Sato， Μ.等Mol Biol Cell 18，1009-17.)通過PCR擴增而構建NMHC-IIA的C末端片段的編碼區域，將獲得的DNA片段向pGEX-4T3 (GE Healthcare公司)，與GST —同克隆到框內 (in-frame)。
pGEX-NMHC-IIBrod
是用于產生谷胱苷肽巰基轉移酶和NMHC-IIB的C末端片段的融合蛋白 (GST-NMHC-IIBrod)的質粒。從pEGFP_BRF305 (Sato，M.等 Mol Biol Celll8,1009-17.)通過PCR擴增而構建NMHC-IIB的C末端片段的編碼區域，將獲得的DNA片段向pGEX_4T3 (GE Healthcare公司),與GST —同克隆到框內。
pME-Ig-NMHC-IIArod 以及 dME-Ig-NMHC-IIBrod
是用于產生作為可溶性NMHC-IIA、可溶性NMHC-IIB的、Ig與NMHC-IIA或者 NMHC-IIB的C末端片段的融合蛋白(分別為NMHC-IIArod-Ig以及NMHC-IIBrod-Ig)的質粒。
pME-Ig-NMHC-IIArod可以通過與pGEX-NMHC-IIArod同樣的方法而制備。但是,用改造的PME18S表達載體而代替了 pGEX-4T-3。改造的pME18S表達載體在N末端包含小鼠 ⑶150前導片段(leader segment),在C末端包含人IgGl的Fe段。對于Fe段,為了降低細胞的與Fe受體的結合親和性，將第266位以及第267位的亮氨酸分別突變為丙氨酸和谷氨酰胺，為了降低HSV-I的與Fe受體(gE)的結合親和性，將第467位的組氨酸突變為精氨酸。
pME-Ig-NMHC-IIBrod 也用同樣的方法而制備。但是，在 pME-Ig-NMHC-IIBrod 中， NMHC-IIB的C末端 片段(序列號7)的編碼區域是從pEGFP_BRF305 (Sato，M.等Mol Biol Cell 18，1009-17.)通過PCR擴增而構建的。
pMxs-NMHC-IIA-puro
質粒11347 (Addgene 公司)來源的 NMHC-IIA 的開放讀碼框(Open Reading Frame)被克隆到 pMxs-puro (Morita, S.等 Gene Ther 7,1063-6·)。該質粒稱為 pMxs-NMHC-IIA-puro。
Flag-MYHlO 表汰載體
根據Uchiyama Y等 Proc Natl Acad Sci U S A. 2010Mayl8 ； 107 (20) :9240-5.的方法而制備。
DEP98-gB、DPEP99-gD、pPEP101-gL、以及 pPEP100-gH(HSV-l 糖蛋白表汰質粒)
是用于表達HSV-1 的 gB、gD、gL、以及 gH 的質粒。從 Northwestern University 獲得(Pertel, P. E.等 Virology 279，313-24)。
pT7EMCLuc
用于定量融合效率。是編碼T7RNA聚合酶的pCAGT7以及T7啟動子調控下具有螢火蟲突光素酶(firefly luciferase)基因的質粒(Okuma, K.等 Virology 254,235-44·)。
dSSSP-NMHC-IIA、dSSSP-NMHC-IIB 以及 DSSSP-Cre
為了產生表達針對NMHC-IIA、NMHC-IIB的shRNA的穩定的細胞系(cell line)，通過以下方法構建了 pSSSP-NMHC-IIA以及pSSS-NMHC-IIB。
將編碼針對NMHC-IIA的shRNA的DNA (序列號5)克隆到pmU6的BbsI位點以及EcoRI位點。將獲得的質粒的BamHI-Ec0RI片段(fragment)(包含U6啟動子以及編碼針對NMHC-IIA的shRNA的序列)克隆到pSSSP的BamHI以及EcoRI位點，獲得了 pSSSP-NMHC-IIA。pSSSP是包含嘌呤霉素抗性基因的逆轉錄病毒載體pMX的衍生載體。
pSSSP-NMHC-IIB也通過與pSSSP-NMHC-IIA同樣的方法制備。但是，作為編碼針對 NMHC-IIB的shRNA的DNA，使用了由記載于序列號11中的堿基序列構成的DNA。
作為對照，根據(Haraguchi，T.，等FEBS Lett 581，4949_54·)準備了編碼針對 Cre 重組酶的 shRNA 的 pSSSP-Cre。
[細胞以及培養基]
在實施例中所使用的細胞如下。
CHO-hPILR α細胞以及CHO-hNectin-l細胞分別為穩定表達人PILR α或人 Nectin-I 的轉染子(Arii, J.等 J Virol. 83，4520-7.)。
HL60/NMHC-IIA 細胞以及 HL60/puro 細胞是用包含 pMXs-NMHC-IIA 或者 pMxs-puro的重組逆轉錄病毒轉染的具有嘌呤霉素抗性的HL60細胞。具體而言，用 pMxs-NMHC-I IA-puro或者pMxs-puro與pMDG共轉染plat-GP細胞。兩天后，回收上清。 向HL60細胞感染包含逆轉錄病毒的轉染plat-GP細胞的上清，由此進行轉導，在維持液 (maintenance media)中加入O. 5yg/ml的嘌呤霉素，選擇轉染的細胞。
IC21/NMHC-IIB細胞以及IC21/puro細胞是用包含Flag-MYHlO表達載體或者pMxs-puro的重組逆轉錄病毒轉染的具有嘌呤霉素抗性的IC21細胞。具體而言,用 Flag-MYHlO表達載體或者pMxs-puro轉染IC21細胞，兩天后，在含有O. 25 μ g/ml的嘌呤霉素(puromycin)的維持液中培養,選擇轉染的細胞。
病毒向各種Vero細胞、CHO細胞、HL60細胞、IC21細胞、HEL細胞的感染中，使用了 199培養基、Ham F-12培養基、加入1% FCS的RPMI1640培養基、加入1% FCS的199培養基。
[抗體]
實施例中所使用的抗體如下。
針對gB (1105)、Flag (M2)以及Myc(PL14)的小鼠單克隆抗體分別從Goodwin Institute公司、Sigma公司以及MBL公司購入。
針對NMHC-IIA的C末端的兔多克隆抗體從Sigma公司購入。該抗體將NMHC-IIA 的C末端的11氨基酸(序列號6)作為表位識別。
實施例4中所使用的針對NMHC-IIA的C末端的兔多克隆抗體(抗NMHC-IIA血清):用使上述的pGEX-NMHC-IIArod在E. coli中表達的GST-NMHC-IIArod，對兔進行了免疫，并根據通常的方案(protocol) (MBL公司)做了純化。將免疫的兔的血清作為抗 NMHC-IIArod多克隆抗體使用。從MBL公司購入了成為對照的兔血清。
針對NMHC-IIB的C末端片段的兔多克隆抗體從Sigma公司購入。該抗體將 NMHC-IIB的C末端(第1965位到1976位)的12氨基酸(序列號12)作為表位識別。
針對NMHC-IIA以及NMHC-IIB的C末端的小鼠多克隆抗體用GST-NMHC-IIArod, GST-NMHC-IIBrod對小鼠進行了免疫，將免疫的小鼠血清分別作為抗NMHC-IIArod小鼠血清、MNHC-IIBrod小鼠血清使用。
抗磷酸化RLC抗體以及抗RLC抗體從Cell signaling Technology公司購入。
實施例I :與姐結合的新型HSV侵入受體的研究
<小鼠胚胎成纖維細胞(MEF細胞)中的侵入受體的研究>
向MEF細胞或IC21細胞(小鼠巨噬細胞樣細胞)，在4°C下，感染YK711兩個小時，然后將細胞轉移到37°C，兩分鐘后，進行了回收。在包含2mM的DTSSP(Piers公司)的磷酸緩沖生理鹽水(PBS)中，在4°C下，處理了兩小時，然后溶解在RIPA緩沖液(1%ΝΡ-40， O. I %脫氧膽酸鈉(Sodium Deoxycholat), O. I % SDS, 150mM NaCl, IOmM Tris-HCl [ρΗ7· 4]， ImM EDTA)中。
將離心分離后獲得的上清液提供到使用了抗myc單克隆抗體(MBL公司)的第一免疫沉淀中，將免疫沉淀物與AcTEV蛋白酶(Invitrogen公司)進行反應。并且，將上述上清液提供到使用了抗Flag單克隆抗體(Sigma公司)的第二免疫沉淀中，將免疫沉淀物在變性凝膠中通過電泳進行分離，并通過銀染可視化。
據此，在稱為成纖維細胞的、在機體內廣為分布的細胞中，能夠檢測出與gB結合的蛋白。
將結果示出在圖1A。
接著，截出只在MEF細胞觀察到的條帶(箭頭)，在凝膠中用胰蛋白酶進行了消化， 供于質譜分析。質譜分析結 果，一個條帶鑒定為NMHC-IIA。
〈NMHC-I IA 和 NMHC-IIB 的表達 >
在Vero細胞以及Cos-I細胞中，分別用抗NMHC-IIA抗體、抗NMHC-IIB抗體檢測 NMHC-IIA以及具有與NMHC-IIA類似功能的NMHC-IIB的表達。結果示出在圖16A。雖然在 Vero細胞中兩個均表達，但在Cos-I細胞中只表達NMHC-IIB。
<免疫沉淀>
為了找到除了 PILR和MAG以外的HSV的侵入受體，使用了將使用不具有膜通透性的交聯劑的串聯親和純化法與使用質譜分析法的蛋白質組學技術結合的方法(Oyama， Μ.等 Mol Cell Proteomics 8,226-31·)。具體方法如下。
向￥61*0細胞，在41下，感染了￥1(711、￥1(712或肥￥-1$)兩小時。將細胞轉移到 37°C,兩分鐘后回收并用PBS清洗,溶解于包含蛋白酶抑制劑混合物(Protease Inhibitor Cocktail)的 TNE 緩沖液(1% NP-40,150mM NaCl, IOmM Tris-HCl [pH7. 8], ImM EDTA)中。 將離心分離后的上清與瓊脂糖蛋白A在4°C下溫育30分鐘，進行凈化。短時間離心分離后， 使上清與抗Flag抗體或抗gB抗體在4°C下反應2小時。接著，加入瓊脂糖蛋白A,旋轉的同時在4°C下再反應I小時。免疫沉淀物通過短時間離心分離而回收，用TNE緩沖液清洗干凈后，通過使用了抗NMHC-IIA抗體的免疫印跡進行分析。
結果示出在圖IB中。
感染了表達MEF-gB的YK711或者野生型HSV-1 (F)的Vero細胞的細胞溶解物中， NMHC-IIA與MEF-gB或野生型gB —同發生了沉淀。
并且，用Cos-I細胞代替Vero細胞而進行了同樣的實驗，最后通過使用了抗 NMHC-IIB抗體的免疫印跡進行了分析，其結果示出在圖16B以及C。圖16B為感染了 YK711 或YK712的結果，圖16C為感染了野生型HSV-1 (F)的結果。
與NMHC-IIA時的結果同樣地，感染了表達MEF-gB的YK711或者野生型HSV-1 (F) 的Cos-I細胞的溶解物中，NMHC-IIB與MEF-gB或野生型gB —同發生了沉淀，確認出 NMHC-IIB也與gB結合的事實。
<野生型HSV-1 (F)、gB缺失病毒或回復突變病毒與可溶性NMHC-IIA的C末端片段的結合>
使NMHC-IIArod-Ig產生在Cos-I細胞。向293T細胞感染HSV-1，12小時后，回收感染細胞(A)。并且，向其他293T細胞使用Iipofectamine而導入HSV-I糖蛋白表達質粒， 18小時后回收細胞(B)。使細胞與NMHC-IIArod-Ig在冰上反應30分鐘。將細胞用加入有 2% FCS的PBS清洗，然后與二抗(PE標記anti-human IgG抗體)在冰上反應30分鐘。將細胞再次用加入有2% FCS的PBS清洗,通過流式細胞儀(flow cytometer)進行了分析。
(A)以及⑶結果分別示出在圖2A以及B。
gB 缺失病毒感染細胞(YK701 (dgB)-感染)沒有被 NMHC-IIArod-Ig(NMHC-IIA 的 C末端片段與Ig的融合蛋白)識別出(圖2A的中間圖)。另一方面，野生型HSV-1 (F)感染細胞(F-感染)以及表達野生型gB的gB缺失病毒的回復突變病毒感染細胞(YK702 (回復)-感染)被NMHC-IIArod-Ig識別(圖2A的上面圖以及下面圖)。
與該結果一致地，HSV-I的gB轉染子被NMHC-IIArod-Ig識別，但是HSV-I的gD轉染子沒有被識別(圖2B)。
從這些結果，得到了如下啟示NMHC-IIA的C末端區域與HSV-I的gB相互作用。
接著，使NMHCIMrod-Ig產生在Cos-Ι細胞，向293T細胞使用Iipofectamine而導入HSV-I糖蛋白表達質粒，對于NMHC-IIB，進行了與上述(B)同樣的實驗。結果示出在圖 17A以及B。在表面表達gB的細胞被NMHC-IIBrod-Ig染色，得到了如下啟示=NMHC-IIB其 C末端區域也與HSV-I的gB相互作用。
實施例2 HSV-1停入時的NMHC-IIA的細胞內的移動
在4°C下向Vero細胞感染野生型HSV-1 (F)兩小時，轉移到37°C，然后O分鐘后、 2分鐘后以及15分鐘后，通過使用了抗NMHC-IIA抗體的免疫熒光法(使用FITC標記的二抗)，分析了 NMHC-IIA的細胞內的定位。
模擬(Mock)感染的細胞和在4°C下感染了 HSV-I(F)的細胞(O分鐘后)中， NMHC-IIA分布在整個細胞質中。如果HSV-I開始侵入(轉移到37°C而經過2分鐘后以及 15分鐘后)，則NMHC-IIA在細胞膜附近的濃度有意地提高(圖3A)。
并且，使模擬感染的細胞、或在4°C下感染野生型HSV-1 (F)兩小時后轉移到37°C 并經過15分鐘的細胞的細胞表面蛋白生物素化,進行利用親和素珠(avidin-beads)的免疫沉淀，接著進行利用抗NMHC-IIA抗體的免疫印跡。
更加具體而言，向Vero細胞在4°C下感染MOI = 5的HSV-1 (F)兩小時。將細胞轉移到37 °C，經過2分鐘后以及15分鐘后，用冰冷的BPS清洗4次，使用可裂解的 sulfo-NHS-SS-Biotin (Pierce公司)進行了生物素化兩次，每次15分鐘。
用加入O. 2 % BSA的冰冷的DMEM清洗I次，用加入10 % FCS的PBS清洗2次，然后將細胞提供于模擬處理，或者用新準備的還原溶液(15. 5mg谷胱甘肽/ml、75mM NaCl, O. 3% Na0H、10%小牛血清)在4°C下對細胞處理20分鐘，進行2次，以從細胞表面的蛋白去除殘留的生物素標記。
用加入O. 2 % BSA的DMEM清洗2次，用加入I % BSA的5mg/ml碘乙酰胺 (iodoacetamide) (PBS中)，抑制(quench)自由SH基，然后回收細胞，在包含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液中進行溶解。用親和素珠進行沉淀，用NMHC-IIA抗體進行免疫印跡。
結果示出在圖3B。
確認出，正常Vero細胞的細胞表面表達有NMHC-IIA，以及伴隨病毒的侵入而 NMHC-IIA的在細胞表面的量上升。
進一步地，感染了表達MEF-gB的HSV-1 (YK711)的細胞中，與抗Flag抗體一同沉淀的NMHC-IIA被生物素化，但是感染了表達MEF-gH的HSV-1 (YK712)的細胞中，沒有檢測出具有與被生物素化的NMHC-IIA相同的分子量的蛋白(圖3C)
從這些結果表明，因HSV-I的侵入，NMHC-IIA的在細胞表面的濃度增大，·細胞表面的NMHC-IIA與gB相互作用。
從HSV-I侵入到15分鐘以內細胞表面上的表達上升這一 NMHC-IIA的性質，是迄今為止被報道的HSV-I的侵入受體中未發現的NMHC-IIA特有的性質。該性質與HSV-I向細胞附著到侵入為止存在10分鐘到15分鐘的時間間隔(time lag)這一過去的報道相符， 用于說明該現象。這種時間間隔在牛痘病毒或流感病毒中沒有被發現。
實施例3-1 :某于NMHC-IIA的細朐內定位的控制的HSV-I感染的抑制
NM-IIA的細胞內定位通過作為NM-IIA的亞型的調節輕鏈(Regulatory light chain,RLC)被肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)磷酸化而被部分控制。
因此，研究了作為MLCK的特異性抑制劑的ML-7對NMHC-IIA的重構引起的影響。 具體而言，將Vero細胞用各種濃度的ML-7進行30分鐘前處理，在與上述濃度相同的濃度的ML-7存在下，在24孔板中，將HSV-IGFP以MOI = I接種。去除接種材料，然后向細胞給予包含與上述濃度相同的濃度的ML-7的培養基。
感染5小時、6小時或12小時后，通過熒光顯微鏡(Olympus 1X71)觀察細胞，或者使用 Cell Quest 軟件(Becton Dickinson)用 FACSCalibur 進行分析。
并且，使用流感病毒進行了同樣的實驗。
結果示出在圖4。
病毒侵入時的、細胞膜附近的NMHC-IIA的濃度的上升，因ML-7而被抑制(圖4B)。
HSV-IGFP的感染也被ML-7而得到劑量依賴性抑制(圖4A)，但是ML-7不影響流感病毒的感染(圖4C)。
從這些結果表明，有效的HSV-I感染，需要包括在HSV-I侵入時NMHC-IIA移動到細胞表面的NM-IIA的控制。
可以認為NMHC-IIA的移動，是根據病毒剛侵入后引起的信號通路的調節而控制的。HSV-I的侵入引起細胞膜以及細胞內的鈣濃度的急劇上升(CheShenk0，N.等Mol Biol Cell 18，3119-30)，這引起由MLCK介導的NM-II RLC的磷酸化。
使NM-II RLC磷酸化而控制NM-II的定位的MLCK的特異性抑制劑抑制病毒侵入時的NMHC-IIA的移動以及HSV-I的感染，這一這次表明的事實，對以下假說提供依據基于 HSV-I侵入的鈣信號通道的活化，引起NMHC-IIA的移動，介導基于與gB的相互作用的病毒侵入。
接著，通過與實施例2同樣的方法，向用ML-7進行前處理的Cos-I細胞、或者沒有進行前處理的Cos-I細胞感染野生型HSV-1 (F)，活化細胞表面的蛋白，進行利用親和素珠的免疫沉淀，然后進行使用抗NMHC-IIB抗體的免疫印跡。
結果示出在圖18A。如果感染HSV-I，則細胞膜附近的NMHC-IIB濃度上升，但是用 ML-7處理，該濃度顯著降低。
并且，與實施例3同樣地，將Cos-I細胞用各種濃度的ML-7進行30分鐘前處理， 在與上述濃度相同的濃度的ML-7存在下，在24孔板中，將HSV-IGFP以MOI = I接種，去除接種材料，然后向細胞給予包含與上述濃度相同的濃度的ML-7的培養基。進一步地，利用流感病毒而代替HSV-1GFP，進行了同樣的實驗。
結果示出在圖18B以及C。如圖18B所示，HSV-I的感染被ML-7而得到劑量依賴性抑制，但是流感病毒的感染沒有受到ML-7的影響(圖18C)。在只表達有NMHC-IIB的Cos-I 細胞中，也觀察到了這種現象，從這一事實可以表明，NMHC-IIB也在HSV-I侵入時移動到細胞表面，作為用于HSV-I侵入的受體發揮作用。
實施例3-2 :某于NMHC-IIA的細朐內定位的控制的HSV-2感染的抑制
對于HSV-2GFP，使用Vero細胞進行了與實施例3_1同樣的實驗。
結果示出在圖22。HSV-2GFP的感染也被ML-7而得到劑量依賴性抑制。
聿施例4-1 :某于杭NMHC-IIA杭體的HSV-I感染的抑制
對于Vero 細胞、CHO-hNectin-Ι 細胞、CHO-hPILR α 細胞以及 HL60/NMHC-·IIA 細胞用各種濃度的抗NMHC-IIA血清或對照血清進行了 30分鐘前處理。
在24孔板中，分別向Vero細胞、CHO-hNectin-Ι細胞以MOI = I接種了 HSV-1GFP。 進行了 I小時病毒附著后，去除接種材料，向細胞給予適宜的培養基。
并且，在24 孔板中，向 CHO-hPILR α 細胞以 MOI = I 接種 HSV-1GFP，在 32°C、IlOOg 條件下，進行了離心分離I小時。進行了 I小時病毒附著后，去除接種材料，清洗細胞，給予適宜的培養基。
感染5小時、6小時或12小時后，通過熒光顯微鏡(Olympus 1X71)觀察細胞，或者使用 Cell Quest 軟件(Becton Dickinson)用 FACSCalibur 進行分析。
結果示出在圖5。
抗NMHC-IIA 血清抑制了向 CHO-hNectin-l 細胞的 HSV-1 的感染。CHO-hNectin-l 細胞，是對原本對于HSV-I感染具有抗性的CH0-K1細胞，通過轉導gD受體的nectin-Ι，由此變成HSV-I敏感細胞的細胞。相反地，抗NMHC-IIA血清不抑制向CHO-hPILR α細胞的 HSV-I的感染。這認為是，CH0-K1細胞通過過表達另外一個gB受體的PILRa，由此獲得了對于HSV-I充分的敏感性而引起的結果。
CHO-hNectin-l 以及CHO-hPILRa 細胞均內源性表達NMHC-IIA。在該CHO-hPILRa 細胞中的競爭性結果，進一步支持NMHC-IIA為對于HSV-I發揮作用的gB受體的這一結論。
實施例4-2 :基于抗NMHC-IIA抗體以及抗MNHC-IIB抗體的HSV-I感染的抑制
根據實施例4-1的方法，作為抗體，使用抗NMHC-IIArod小鼠血清以及抗NMHC-IIB 小鼠血清而進行了實驗。使用Vero細胞,抗體稀釋為I : 20。
結果示出在圖23。抗NMHC-IIArod小鼠血清以及抗NMHC-IIBrod小鼠血清均抑制 HSV-I的感染。
實施例4-3 :某于杭NMHC-IIA杭體以及杭MNHC-IIB杭體的HSV-2感染的抑制
根據實施例4-1的方法，作為病毒而使用HSV-2GFP，作為抗體，使用抗 NMHC-IIArod小鼠血清以及抗NMHC-IIB小鼠血清而進行了實驗。使用Vero細胞，抗體稀釋為 I : 20。
結果示出在圖24。抗NMHC-IIArod小鼠血清以及抗NMHC-IIBrod小鼠血清均抑制 HSV-2的感染。
實施例5-1 :某于NMHC-IIA或者NMHC-IIB的敲減(knockdown)的HSV-1感染的抑制
根據RNAi法敲減(knockdown)NMHC-IIA的表達，研究了對于病毒感染引起的影響。
具體而言，將Vero細胞用pSSSP-NMHC-IIA或pSSSP_Cre進行轉染，在維持液中加入2. 5 μ g/ml嘌呤霉素而選擇轉染的細胞。將用PSSSP-Cre轉染的嘌呤霉素抗性細胞稱為 Vero-ShCre0分別分離用pSSSP-NMHC-IIA轉染的菌落群，通過基于抗NMHC-IIA抗體的免疫印跡，篩選了穩定表達針對NMHC-IIA的shRNA的細胞。
在24 孔板中，向 Vero-shCre 或 Vero-NMHC-IIA 細胞以 MOI = I 接種了 HSV-1GFP 或流感病毒。病毒附著I小時后，去除接種材料，向細胞給予適宜的培養基。
感染6小時后(HSV-I)或7小時后(流感病毒)，使用Cell Quest軟件(Becton Dickinson)用 FACSCalibur 進行分析。
結果示出在圖6A、B。
HSV-IGFP的敏感性，在敲減了 NMHC-IIA的細胞(Vero-shNMHC-IIA)中，與表達無關的shRNA的細胞(Vero-shCre)相比低下(圖6A)。另一方面，NMHC-IIA的敲減，對流感病毒的感染幾乎沒有產生影響(圖6B)。
實施例4以及5的結果表示，在內源性表達NMHC-IIA的細胞中，HSV-I將NMHC-IIA 作為功能性受體而利用。
并且，Vero細胞內源性表達作為NMHCII-A以及gD受體的Nectin-1 (Milne， R. S.等 Virology 281, 315-328(2001).)
已知Vero細胞上的gD受體也介導HSV-I感染，并且在這里已經證實了向Vero細胞的HSV-I感染需要gB與NMHC-IIA結合，因此表明HSV-I向Vero細胞的侵入需要針對gD 以及gB這兩者的受體的假說是正確的。
接著，通過RNAi法敲減(knockdown) 了在Cos-Ι細胞中的NMHC-IIB的表達。 具體而言，將Cos-I細胞用pSSSP-NMHC-IIB或pSSSP-Cre進行轉染，在維持液中加入2.5 μ g/ml嘌呤霉素而選擇轉染的細胞。將用pSSSP-Cre轉染的嘌呤霉素抗性細胞稱為 Cos-1-shControlo分別分離用pSSSP-NMHC-IIB轉染的菌落群,通過基于抗NMHC-IIB抗體的免疫印跡，篩選了穩定表達針對NMHC-IIB的shRNA的細胞。
在24 孔板中，向 Cos-1-shControl (圖中 sh 對照)或 Cos-I-NMHC-IIB 細胞(圖中shNMHC-IIB)以MOI = I接種了 HSV-IGFP或流感病毒。病毒附著I小時后，去除接種材料，向細胞給予適宜的培養基。
感染6小時后(HSV-I)或7小時后(流感病毒)，使用Cell Quest軟件(Becton Dickinson)用 FACSCalibur 進行分析。
結果示出在圖19A C。因NMHC-IIB的敲減(圖19A)而導致HSV-1的感染低下 (圖19B)，但流感病毒的感染沒有發生變化。
實施例5-2 :某于NMHC-IIA或NMHC-IIB的敲減的HSV-2感染的抑制
根據實施例5-1的方法，向敲減了 NMHC-IIA表達的Vero細胞以MOI = I接種了 HSV-2GFP。在對照中使用了 Vero-shCre。
結果示出在圖27。確認出敲減了 NMHC-IIA的細胞中HSV-2的感染得到了抑制。
并且，同樣地，根據實施例5-1的方法，向敲減了 NMHC-IIB表達的Cos-Ι細胞以 MOI = I 接種了 HSV-2GFP。
結果示出在圖28。確認出敲減了 NMHC-IIB的細胞中HSV-2的感染得到了抑制。
實施例6 :膜融合測定
對于包括HSV-I的包膜病毒而言，為了病毒感染，需要包膜與宿主細胞的細胞膜的融合。為了研究與HSV-I的膜融合中NMHC-IIA的作用，進行了膜融合測定。
具體而言，在24 孔板中，向 Vero 細胞轉染了 pEP98_gB、pPEP99_gD、pPEP101-gL、 pPEP100-gH(6C)或者pMD (VSV-G表達載體)、以及pCAGT7，將轉染子作為效應細胞使用。
并且，在24 孔板中，對 Vero-shCre 或 Vero-shNMHC-IIA 1-3 細胞用 pT7EMCLuc 進行轉染，將轉染子作為靶向細胞使用。
作為內部對照，用編碼由CMV啟動子調控的腎熒光素酶(Renilla luciferase)基因的pRL-CMV (Promega公司)進行了共轉染。
轉染6小時后，用O. 04% EDTA (PBS中)分離效應細胞，用維持液清洗一次，與靶向細胞共培養18小時 。然后,通過雙螢光素酶報告基因檢測系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega公司)和光度計(luminometer, Promega公司)分別對螢火蟲突光素酶以及腎熒光素酶活性進行定量。螢火蟲熒光素酶活性通過腎熒光素酶標準化。
結果示出在圖6C、D。
當將敲減了 NMHC-IIA的Vero細胞與暫時表達HSV_lgB、gD、gH、以及gL的Vero 細胞共培養時，與表達對照shRNA的Vero細胞和表達HSV-I的糖蛋白的Vero細胞共培養時相比，膜融合明顯減少(圖6C)。
可對照地，NMHC-IIA的敲減對于VSV包膜G蛋白介導性的膜融合，幾乎沒有產生影響(圖6D)。這些結果表明，NMHC-IIA是在介導與HSV-I包膜的G蛋白結合的有效膜融合中所必需的。并且,可以得到如下啟示gB與NMHC-IIA的相互作用參與HSV-I感染中的膜融合。
同樣地，為了研究與HSV-I的膜融合中NMHC-IIB的作用，進行了膜融合測定。
具體而言，在24 孔板中，向 Cos-I 細胞轉染了 pEP98-gB、pPEP99-gD、pPEP101_gL、 pPEP100-gH(6C)或者pMD (VSV-G表達載體)、以及pCAGT7，將轉染子作為效應細胞使用。
并且，在24 孔板中，對 Cos-1-shControl 或 Cos-l-shNMHC-IIB 1-3 細胞用 pT7EMCLuc進行轉染，將轉染子作為靶向細胞使用。
作為內部對照，用編碼由CMV啟動子調控的腎熒光素酶基因的pRL-CMV(Promega 公司)進行了共轉染。
轉染6小時后，用O. 04% EDTA (PBS中)分離效應細胞，用維持液清洗一次，與靶向細胞共培養18小時。此后,通過雙螢光素酶報告基因檢測系統(Dual-Luciferase ReporterAssay System, Promega公司)和光度計(luminometer, Promega公司)分別對螢火蟲突光素酶以及腎熒光素酶活性進行定量。螢火蟲熒光素酶活性通過腎熒光素酶標準化。
結果示出在圖19D、E。當將敲減了 NMHC-IIB的Cos-I細胞與共表達HSV_lgB、gD、 gH、以及gL的Cos-I細胞共培養時，與對照相比，膜融合顯著減少(圖19D)。另一方面， NMHC-IIB的敲減對于VSV G依賴性細胞融合沒有產生影響。這些結果表明，NMHC-IIB在介導與HSV-I包膜的G蛋白結合的有效膜融合中也是必需的。并且，可以得到如下啟示gB與 NMHC-IIB的相互作用參與HSV-I感染中的膜融合。
實施例7-1 :對于HSV-I向細朐停入的NMHC-IIA的參與的確認
建立高水平且穩定表達NMHC-IIA的HL60細胞(HL60/NMHC-IIA)。已報道有，人前髓細胞(promyelocyte)株 HL60 細胞低水平表達 NMHC-IIA(Toothaker, L. Ε·等 Blood 78, 1826-1833 (1991).)，并且對于 HSV-I 的感染較具有耐性(Pientong，C.等· Virology 170， 468-476(1989).)。
在24 孔板中，向 HL60/NMHC-IIA 細胞以 MOI = I 接種 HSV-1GFP，在 32°C、IlOOg 條件下，離心分離I小時。進行病毒附著I小時后，去除接種材料，清洗細胞，給予適宜的培養基。
感染5小時、6小時或者12小時后，用熒光顯微鏡(Olympus 1X71)觀察細胞，或者使用 Cell Quest 軟件(Becton Dickinson)用 FACSCalibur 進行分析。
結果示出在圖7。
圖7A表示通過免疫印跡法確認HL60/NMHC-IIA中的NMHC-IIA過表達的結果。
HL60細胞中的NMHC-IIA過表達導致感染HSV-IGFP的HL60/NMHC-IIA細胞的比例與對照的HL60/puix)細胞相比顯著增加(圖7B以及C)。
向HL60/NMHC-IIA細胞的HSV-IGFP的感染被抗NMHC-IIA血清而得到劑量依賴性抑制，而對照血清對HSV-IGFP的向同樣細胞的感染僅產生微小影響(圖7D)。
進一步地，NMHC-IIA的過表達還增強對豬α皰疹病毒的敏感性，GFP表達偽狂犬病病毒(PRV GFP)的感染、以及HL60/NMHC-IIA中的PRV GFP的感染因抗NMHC-IIA血清而得到特異性抑制(圖7Ε)。
這些結果表明，NMHC-IIA介導HSV-I感染，并且可以得到如下啟示由NMHC-IIA 介導的病毒的向細胞的侵入，在其他α皰疹病毒中也被保留。
實施例7-2 :對于HSV-I向細胞停入的NMHC-IIB的參與的確認
在原本低水平表達NMHC-IIB的IC21細胞中，使NMHC-IIB細胞過表達(圖20Α)。 向該IC21/NMHC-IIB細胞通過與HL60/NMHC-IIA同樣的方法接種HSV-1GFP，進行觀察。
結果示出在圖20Β。在IC21細胞中的NMHC-IIB的過表達導致感染HSV-IGFP的細胞的比例與對照(IC21/puro細胞)相比顯著增加(圖20B以及C)。這些結果表明，NMHC-IIB 也介導HSV-I感染。
實施例7-3 :對于HSV-2向細胞停入的NMHC-IIA的參與的確認
HSV-2GFP作為病毒，進行了與實施例7-1同樣的實驗。結果示出在圖29。NMHC-IIA 的過表達導致感染HSV-2GFP的細胞的比例增加。該結果表明，NMHC-IIA也介導HSV-2感染。
實施例7-4 :對于HSV-2向細胞停入的NMHC-IIB的參與的確認
HSV-2GFP作為病毒，進行了與實施例7_3同樣的實驗。結果示出在圖30。NMHC-IIB 的過表達導致感染HSV-2GFP的細胞的比例增加。該結果表明，NMHC-IIB也介導HSV-2感染。
實施例8:與阿昔洛韋(aciclovi^ACC)的作用點的比較
將24孔板的Vero細胞分別用抗NMHC-IIA血清或對照血清、ML_7 (20 μ Μ)、 ACC (40 μ Μ)處理30分鐘，以MOI = I接種HSV-1GFP。I小時后去除病毒液，換成維持液。 ML-7以及ACC處理細胞分別在加入有藥劑的維持液中培養。感染6小時后回收細胞，用流式細胞儀(fIowcytometer)分析了突光強度。圖中示出的均是相對突光強度。
雖然向Vero細胞的HSV侵入沒有因HSV復制抑制劑的ACC而被抑制(圖9A)，但是被MLCK抑制劑ML-7 (圖9B)或NMHC-IIA抗血清(圖9C)而抑制。雖然ACC是已被廣為使用的抗皰疹病毒藥，但是可以說，以NMHC-IIA為靶標的藥劑、抗體具有與ACC完全不同的作用點。
實施例9 :某于HSV-I感染的RLC的磷酸化
將Vero細胞用20 μ M的ML-7進行模擬(mock)處理或處理30分鐘，在ML-7存在下或不存在下、以MOI = 50、在4°C下、模擬(mock)暴露或暴露在野生型HSV-1，2小時。轉移到37°C經過15分鐘后，通過使用抗磷酸化RLC抗體或抗RLC抗體的免疫印跡，測定了 RLC 的磷酸化。
結果示出在圖10。確認出，因HSV-I的感染而導致RLC的磷酸化被增進，并且該增進因MLCK的選擇性抑制劑的ML-7而被抑制。
實施例10 :基于鈣螯合物的HSV-I感染的抑制
將Vero細胞用50 μ M的BAPTA-AM進行模擬(mock)處理或處理30分鐘，在ML_7 存在下或不存在下、以MOI = 50、在4°C下、模擬(mock)暴露或暴露在野生型HSV-1，2小時。 轉移到37°C經過15分鐘后，通過使用抗NMHC-IIA抗體的免疫熒光法進行分析。
結果示出在圖11A。BAPTA-AM是MLCK活化所必需的Ca2+螯合物。確認出，在 BAPTA-AM的存在下，即使HSV-I感染NMHC-IIA也不轉移到細胞膜附近。
并且，將Vero細胞用50 μ M的BAPTA-AM進行模擬(mock)處理或處理30分鐘，在 ML-7存在下或不存在下、以MOI = 50、在4°C下、模擬(mock)暴露或暴露在野生型HSV-I，2 小時。轉移到37°C經過15分鐘后，通過免疫印跡，測定了 RLC的表達以及磷酸化。
結果示出在圖11B。確認出，在BAPTA-AM的存在下，RLC的表達量沒有變化，但是基于HSV-I感染的RLC的磷酸化的增進得到了抑制。
接著，向Vero細胞在圖示的濃度的BAPTA-AM的存在下或不存在下以MOI = I感染了 HSV-1GFP。從感染經過5小時后，通過流式細胞術測定了平均熒光強度(MFI)。數據表示平均值和標準誤差(η = 3)。數據根據BAPTA-AM不存在下的測定值進行了標準化。
結果示出在圖11C。MFI以BAPTA-AM的濃度依賴性地減少。這表明，如果MLCK的活性因鈣螯合物而被抑制，則向細胞內侵入的HSV-I減少。
另一方面，向Vero細胞在50 μ M的BAPTA-AM的存在下或不存在下以MOI = I感染了流感病毒。從感染經過7小時后，通過流式細胞術測定了 MFI。數據表示平均值和標準誤差(η = 3)。對BAPTA-AM不存在下的平均值，用100%相對MFI進行了標準化。
結果示出在圖11D。確認出，相對MFI不受BAPTA-AM存在或不存在的影響，流感病毒的感染不被鈣螯合物而抑制。
接著，用Cos-I細胞代替VeiO細胞，在各種濃度的BAPTA-AM的存在下或不存在下，以MOI = I感染了 HSV-1GFP。與Vero細胞時的同樣的方法，測定了熒光強度。結果示出在圖21A。MFI以BAPTA-AM的濃度依賴性地減少。這表明，如果MLCK的活性因鈣螯合物而被抑制，則在僅表達NMHC-IIB的細胞中，也同樣地向細胞內侵入的HSV-I減少。并且，代替HSV-I感染流感病毒時，沒有觀察到鈣螯合物對感染引起的影響。
實施例11 :基于MLCK的顯性負性突變體的HSV-I感染的抑制
將用空表達質粒(Vector)或MCLK的顯性負性突變體的表達質粒(Dn-MLCK)轉染的Vero細胞，在4°C下，模擬(mock)溫育2小時，或者向野生型HSV-I以MOI = 50暴露2 小時。
接著轉移到37°C，15分鐘后，通過使用抗磷酸化RLC抗體或抗RLC抗體的免疫印跡測定了 RLC的表達以及磷酸化。結果示出在圖12A。數據表示獨立的3個實驗的代表性例子。
空表達質粒(Vector)為pCI-neo,從Promega購入。顯性負性突變體表達質粒使用了 J. Physiol 570 :219-235,2006 的質粒。
在用空表達質粒(Vector)轉染的細胞中，因HSV-1的感染而增加了 RLC的磷酸化，但是通過顯性負性突變體轉染的細胞中，該增加得到了抑制。
圖12B中表示從上述圖12A的結果求出相對于全RLC蛋白量的磷酸化RLC蛋白質的相對量的結果。相對量是在通過空表達質粒(Vector)轉染后模擬(mock)感染的細胞 (Mock+Vector)中的RLC的磷酸化量作為100,求出通過空表達質粒(Vector)或Dn-MLCK轉染后感染了 HSV-I的細胞(分別為HSV-l+Vector、HSV-l+Dn-MLCK)中的RLC的磷酸化量的結果。數據表示平均值和標準誤差(n = 3, two-tailed Student' s t-test (學生雙尾t 檢驗))。在HSV-1+Vector中確認出，RLC的磷酸化顯著增進，并且該磷酸化的增進因MCLK 的顯性負性突變體而大體 上被抑制。
接著，向用空表達質粒(Vector)或Dn-MLCK轉染的Vero細胞以MOI = I感染野生型HSV-IGFP (圖12C)或者流感病毒(圖12D)，從感染經過5或7小時后，分別通過流式細胞術進行分析，求出平均熒光強度(MFI)。數據表示平均值和標準誤差(n = 3, two-tailed Student' s t-test) 感染空表達質粒(Vector)的細胞中的平均值根據100%相對MFI 進行標準化。
確認出，與向用空表達質粒(Vector)轉染的細胞感染HSV-I時相比，用Dn-MLCK 轉染的細胞中的HSV-I侵入為60%左右，顯著抑制HSV-I的侵入。另一方面，感染流感病毒的情況下，當用Dn-MLCK轉染時，反而增加流感病毒的侵入。
以上，實施例9 10的結果進一步表明，根據MLCK信號，控制NMHC-IIA的細胞內定位的變化或HSV感染，因此可以通過抑制該MLCK信號而抑制HSV-I的感染。
實施例12 :對于小鼠角膜感染樽型的MLCK抑制劑的效果(感染前給藥)
用注射針頭對ICR小鼠(雌性，5周齡)的角膜引起輕傷后，以10分鐘間隔2次滴眼加入有20 μ M的ML-7的培養基或不包含ML-7的培養基。進一步地，10分鐘溫育后，以 5X IO5PFU/眼，接種HSV-1 (F)株，然后研究淚中的病毒效價、角膜炎癥狀、小鼠的生存。
結果示出在圖13。對于病毒接種2天后的病毒效價(圖13Α)、5天后的角膜炎癥狀(圖13B)而言，進行ML-7處理的小鼠與未處理的小鼠相比較，均有意地低下(A ；p<0. 001， B ；p < O. 05)。進一步地，ML-7處理群中小鼠的生存率也有意地上升(圖13C)。
這些結果表明，在生物機體內也發生HSV-I對NMHC-IIA的利用，同時啟示以下的可能性諸如ML-7等與NMHC-IIA的控制有關的藥劑，可以作為新的皰疹病毒治療、預防藥， 尤其作為預防藥使用。
實施例13 :對于小鼠角膜感染模型的MLCK抑制劑(ML-7)的效果(感染同時給藥)
用注射針頭對分別為28只的ICR(雌性，5周齡)的角膜引起傷口后，同時滴眼加入有20 μ M的ML-7的培養基或不包含ML-7的培養基、以及在199培養基(Mediuml99)中稀釋的5 X IO5HSV-I (F)，觀察21天。
結果示出在圖14。與圖13相比，ML-7處理群中小鼠的生存率進一步有意地上升。
實施例14 :對于小鼠角膜感染模型的MLCK抑制劑(BAPTA-AM)的效果
用注射針頭對分別為28只的ICR(雌性，5周齡) 的角膜引起傷口后，以10分鐘間隔2次滴眼50 μ M的ΒΑΡΤΑ-ΑΜο進一步地，10分鐘溫育后，滴眼在199培養基(Mediuml99) 中稀釋的5 X IO5HSV-I (F)，觀察21天。模擬處理(Mock-treat)群使用了加入有O. 2% DMSO 的 199 培養基(O. 2% DMSOin Mediuml99)而代替 50 μ M 的 ΒΑΡΤΑ-ΑΜ。
結果示出在圖15。BAPTA-AM處理群的生存率與模擬處理(Mock-treat)群相比有意地上升。該結果進一步表明，MLCK抑制劑作為皰疹病毒感染癥的治療、預防藥而有用。
實施例15 :某于杭NMHC-IIA杭體以及杭MNHC-IIB杭體的人類巨細朐病毒(HCMV) 感染的抑制
HEL細胞用抗NMHC-IIArod小鼠血清、抗NMHC-IIBrod小鼠血清以及對照血清前處理30分鐘，在抗體存在下以MOI = O. I感染HCMV ADsubU21. 5。通過熒光顯微鏡、FACS分析24、46、72小時后的GFP表達。
將從病毒感染經過48小時后的GFP表達細胞的熒光顯微鏡照示出在圖25。并且， 將通過FACS分析從病毒感染經過24、46、72小時后的GFP表達細胞的結果示出在圖26。
抗NMHC-IIA抗體以及抗NMHC-IIB抗體抑制HCMV感染的事實得到明確。從這一事實得到以下啟示=NMHC-IIA以及NMHC-IIB介導的感染方法，不僅限于諸如HSV-1、HSV_2 以及PRV等屬于α皰疫病毒亞科的病毒,在屬于其他亞科的皰疫病毒中，也是廣為共同適用的方法。
序列表自由內容
序列號1是NMHC-IIA的C末端區域(第1665位 1960位)的氨基酸序列。
序列號'2是針對NMHC-IIA的siRNA的靶序列的一種例子。
序列號3是針對NMHC-IIA的siRNA的一種例子的單鏈。
序列號4是針對NMHC-IIA的siRNA的一種例子的單鏈。
序列號5是編碼針對NMHD-IIA的shRNA的一種例子的DNA。
序列號6是實施例中所使用的針對NMHC-IIA的C末端的兔多克隆抗體所識別的表位。
序列號7是NMHC-IIB的C末端區域(第1672位 1976位)的氨基酸序列。
序列號8是針對NMHC-IIB的siRNA的靶序列的一種例子。
序列號9是針對NMHC-IIB的siRNA的一種例子的單鏈。
序列號10是針對NMHC-IIB的siRNA的一種例子的單鏈。
序列號11是編碼針對NMHD-IIB的shRNA的一種例子的DNA。
序列號12是實施例中所使用的針對NMHC-IIB的C末端的兔多 克隆抗體所識別的表位。
權利要求
1.一種用于預防或治療皰疹病毒感染癥的醫藥組合物，該醫藥組合物作為有效成分而包含抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB結合的物質。
2.如權利要求I所述的醫藥組合物，所述的抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈IIA 或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB結合的物質，是肌球蛋白三磷酸腺苷酶活性抑制劑或者肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑。
3.如權利要求2所述的醫藥組合物，所述肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑是ML-7。
4.如權利要求2所述的醫藥組合物，所述肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑是肌球蛋白輕鏈激酶途徑抑制劑。
5.如權利要求4所述的醫藥組合物，所述肌球蛋白輕鏈激酶途徑抑制劑是從由鈣調蛋白拮抗劑、鈣螯合物以及鈣拮抗劑組成的組中選擇的。
6.如權利要求2所述的醫藥組合物，所述肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑是肌球蛋白輕鏈激酶的顯性負性突變體。
7.如權利要求I所述的醫藥組合物，所述的抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈IIA 或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB結合的物質，是針對非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB的抗體。
8.如權利要求7所述的醫藥組合物，所述抗體與由序列號為I或7中所記載的氨基酸序列構成的肽結合。
9.如權利要求7所述的醫藥組合物，所述抗體與非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB中的、當皰疹病毒感染時露出到細胞外的區域結合。
10.如權利要求I所述的醫藥組合物，所述的抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈IIA 或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB結合的物質，是抑制非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB表達的物質。
11.如權利要求10所述的醫藥組合物，所述的抑制非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB表達的物質，是從由具有RNAi效應的雙鏈核酸、反義核酸、核酶以及編碼這些的核酸組成的組中選擇的。
12.如權利要求I所述的醫藥組合物，所述的抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈IIA 或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB結合的物質，是可溶性非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者可溶性非肌肉肌球蛋白重鏈IIB。
13.如權利要求I至12中任意一項所述的醫藥組合物，所述皰疹病毒是單純皰疹病毒、 豬水皰疹病毒I型或者巨細胞病毒。
14.一種雙鏈RNA，由序列號為3以及序列號為4中所記載的堿基序列構成，對于非肌肉肌球蛋白重鏈IIA具有RNAi效應。
15.—種核酸,包含由序列號為5中所記載的堿基序列構成的DNA,編碼對于非肌肉肌球蛋白重鏈IIA具有RNAi效應的雙鏈RNA。
16.一種雙鏈RNA，由序列號為9以及序列號為10中所記載的堿基序列構成，對于非肌肉肌球蛋白重鏈IIB具有RNAi效應。
17.—種核酸,包含由序列號為11中所記載的堿基序列構成的DNA,編碼對于非肌肉肌球蛋白重鏈IIB具有RNAi效應的雙鏈RNA。
18.—種篩選用于預防或治療皰疹病毒感染癥的醫藥的方法，包括以下工序用候選化合物處理表達非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB的細胞；向所述細胞感染皰疹病毒；測定在所述細胞中的非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB的向細胞膜附近的移動、或者向所述細胞的皰疹病毒的侵入中的至少一個。
19.一種篩選用于預防或治療皰疹病毒感染癥的醫藥的方法，包括以下工序在非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB與糖蛋白B能夠結合的條件下，使非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB與糖蛋白B和候選化合物接觸；測定非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈IIB與糖蛋白B的結合。
全文摘要
本發明的目的在于發現在多種細胞中表達且作為皰疹病毒的受體起作用的蛋白，并且提供通過抑制該受體與皰疹病毒的結合而防止病毒向細胞侵入的皰疹病毒感染癥的預防劑或者治療劑。本發明提供一種用于預防或治療皰疹病毒感染癥的醫藥組合物，該醫藥組合物作為有效成分而包含抑制糖蛋白B與非肌肉肌球蛋白重鏈IIA或者非肌肉肌球蛋白重鏈結合的物質。
文檔編號C07K16/18GK102985112SQ20118002606
公開日2013年3月20日 申請日期2011年3月25日 優先權日2010年3月26日
發明者川口寧, 有井潤, 荒瀨尚 申請人:國立大學法人東京大學