專利名稱：牛傳染性鼻氣管炎病毒重組毒株、其構建方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種^aftft， ；W^及一種^f專染性鼻氣管，毒^a,， i^^a^a餅勾
~法。本發明還涉及^^且 *{乍為判專染性鼻氣管^^^^ 、 itft訊翁iJ^作為病毒載體用于
外源基因表達的應用，屬于基因工程領域。
背景技術：
牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)，又稱牛皰疹病毒1型(化W77e力eipesWiT/s t，e 7)，可引起的牛的以上呼吸道炎癥為特征的急性接觸性傳染病。在臨床上表現多種病 型，如上呼吸道黏膜炎癥、膿皰性外陰陰道炎、龜頭炎、結膜炎、幼牛腦膜腦炎、乳 房炎、流產等。IBRV在牛多種細胞如鼻甲、氣管、腎、睪丸、肺、皮膚細胞和兔、豬、 狗、綿羊、山羊、馬和人二倍體腎細胞(WI-38)培養物中生長良好，并產生細胞病變， 感染細胞有核內包涵體。病毒核酸為線性雙股麗A，基因組全長為135 301nt， G + C 含量為72%，編碼區占84%。病毒編碼30 40種結構蛋白，其中有ll種為糖蛋白。 IBRV gE基因全長為1728bp，編碼575個氨基酸殘基，為病毒復制的非必需基因。 由牛傳染性鼻氣管炎病毒感染引起的牛傳染性鼻氣管炎(IBR)是引發養牛業重大
經濟損失的疾病之一。本病最初在歐洲發生，1930年以前隨著牛的輸出而傳到美國，
曾作為牛生殖器官感染癥而蔓延，1955年Miller在美國首次報道，1956年Madin等
分離到病毒，1964年Huck確認了本病毒屬于皰疹病毒。本病呈世界性分布，主要經
濟損失在于延緩育肥牛的生長和增重及奶牛產奶量下降和流產等，對養牛業危害極大。
由IBRV引發的呼吸道疾病在美國每年可造成5億美元的經濟損失，在北美則高達10
億美元。我國于1980年從新西蘭進口牛中發現本病，隨后在國內部分地區的農牧場及
奶牛場發現均有不同程度的感染和發病。國內陳永澗(1982)、崔言順(1999)、楊春
明(2003)、肖定漢(2004)、朱遠茂等(2005)等對我國部分地區牛只進行了血清學調査，發現國內牛只的IBR抗體陽性率從O. 12%到66. 7%不等。而肖定漢等(2005)對 14個牛場在1991-1995和1996-1999年間進行的調查表明，IBR血清抗體陽性率從 8.03%(114頭)升高到65.4%(557頭)。近年在進口牛只檢疫中，廣東出入境檢疫局羅 瓊等(2005)檢測了 5000多只澳大利亞進口種牛，其中1505頭血清樣品呈現IBR抗 體陽性，并有兩頭分離到病毒。由此可知，國內無IBRV感染的牛場受內(國內部分地 區感染牛)和外來(攜帶病毒的進口牛只)的雙重壓力，該病的防治形勢不容樂觀。 在IBR陽性率不斷升高的情況下，使用IBR疫苗來防控本病的重要性已日漸突出。
Madin等于1956年首次分離出IBRV后，同年就報道了第一個減毒活疫苗，充分 體現了用疫苗防控IBR的重要性，至今已開發出了多種常規的活苗和滅活苗。但這些 常規疫苗都存在致潛伏感染、散播病毒、無法區別野生毒與疫苗毒等缺點，已逐步被 安全性更好的基因缺失標記疫苗所替帶。盡管現有疫苗的免疫效果令人不太滿意，但 一般說來，疫苗可阻止臨床癥狀的出現和減少感染后病毒的排出。使用傳統的弱毒疫 苗或滅活疫苗的缺點是不能區別疫苗接種和自然感染所誘生的抗體，這樣會干擾以血 清學檢測來消滅本病的防制措施的實施。而利用缺乏特定糖蛋白的基因缺失和亞單位 疫苗，則可以解決這一問題。歐洲已于1995年開發出了 gE基因缺失疫苗，利用 gE-ELISA可區分自然感染和疫苗免疫牛。
牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)TK基因缺失苗于1984年首先在美國報道(Kit等， 1990)，采用鼻內、肌肉及靜脈內試用接種均無致病性，其唯一的缺點是疫苗病毒仍具 有潛伏感染性。1994年澳大利亞學者Smith構建了一株BHV-1的TK基因缺失苗，肌 肉接種和靜脈接種后能誘導機體產生良好的免疫原性，且無明顯的副作用。同年荷蘭 學者van Engelenburg等構建了 IBRV gE單基因和gE、 TK雙基因缺失毒株，首次證實 了gE單基因缺失就可在很大程度上降低IBRV的毒力，且病毒增殖滴度未見下降，但 gE和TK雙基因缺失毒株增殖滴度有一定下降。其中IBRV gE基因缺失毒株成了歐洲 后來生產并應用的IBRV gE基因缺失疫苗，也就是說歐洲主要是使用IBRV gE基因缺 失疫苗。此后，美國的Belknap等(1999)構建了 gE、 gG和US2三基因缺失毒株， 免疫與攻毒試驗表明該毒株可使犢牛產生良好的免疫保護。目前已有多種IBRV單基
因、雙基因乃至三基因缺失疫苗的問世，如美國己普遍使用IBRV TK基因缺失疫苗， 荷蘭于1998年5月在全國范圍內啟動撲滅計劃，推廣使用IBRVgE基因缺失疫苗。此 外，歐洲的比利時也使用了 IBRVgE基因缺失疫苗，啟動了 IBR撲滅計劃(Ackerma皿 等，2006)。牛傳染性鼻氣管炎病毒的第一代基因缺失疫苗是TK基因缺失疫苗，而第 二代基因缺失疫苗主要是gE基因缺失疫苗，其毒力較TK基因缺失疫苗又得到進一步 降低，同時可以建立相應的血清學鑒別診斷方法。目前，IBRV gE基因缺失疫苗在歐 洲己獲得廣泛應用(貓Dr匿n Little-羅den Hurk，2006)。
我國于1980年發現IBR后，中國獸藥監察所周泰沖等(1981)研制了IBR弱毒
凍干疫苗，所用種毒為IBRVBartha-Nu/67，是由中國獸藥監察所于1978年從匈牙利
引進的IBRV弱毒。該種毒是目前國內進行IBR病毒中和試驗所用的病毒，是國內進行
IBR研究的一個參考毒株。用IBRVBartha-Nu/67制備的弱毒疫苗接種黑白花小乳牛2
周后，中和抗體滴度可達1:8以上，符合匈牙利IBR弱毒疫苗效力檢驗標準。中國農
業科學院蘭州獸醫研究所李崇華等(1988)禾lj用從四川牦牛體內分離的IBR85-Y毒株
制備了 IBR油乳劑滅活苗，免疫牦牛后用ELISA可測到較高水平的抗體。但這些疫苗
都未投入使用。這些都是國內早期IBR傳統疫苗的研究。
在借鑒國外研究的基礎上，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所張桂紅等(1998)
構建了 IBRV TK基因缺失毒株，在TK基因缺失部位插入了 LacZ表達盒，用PCR可鑒
別TK基因缺失毒株與野生型毒株。牛傳染性鼻氣管炎病毒的TK基因缺失疫苗是第一
代基因缺失疫苗，而第二代基因缺失疫苗主要是gE基因缺失疫苗，其毒力較TK基因
缺失疫苗又得到進一步降低，同時可以建立相應的血清學鑒別診斷方法。

發明內容
本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種牛傳染性鼻氣管 ，毒(IBRV)重i且轉移載體，該重組轉移載體將gE基因的大部分序列缺失。
本發明首先所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的 ——禾中4^[專染性鼻氣管ife^毒(// /ectj'ows /wT/7'"e r/ i/ ot_rac/ ej't/s k"tas ， IBRV) H且轉移載體，包括啟動子、牛傳染性鼻氣管^ 因、終止子等，該重組轉移載體中gE 基因包括起始密碼子ATG在內的1134bp被缺失，在缺失了 gE基因的位置插入有LacZ 表達盒。
本發明所要解決的另 一 個技術問題是提供 一 種構建上述牛傳染性鼻氣管炎病毒 (IBRV) ^S轉移載體的方法。
本發明所要解決的另一個技術問題是通過以下技術方案來實現的 一種構建上述牛傳染性鼻氣管，毒(IBRV) ^a轉移載體的方法，包括
(1) 按照常規方法提取IBRV基因組DNA;
(2) 以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為引物，以IBRV基因組DNA為摸板，按照 常規PCR方法進行擴增，得到上游同源重組臂；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為引 物，以IBRV基因組DNA為摸板，按照常規PCR方法進行擴增，得到下游同源重組臂；
(3) 將所擴增的上、下游同源重組臂分別克隆于T Easy載體后測序；利用限 制性內切酶AsuII與NsiI酶切正向插入的上游同源重組臂質粒，回收質粒部分；同時 用HindIII與Nsil酶切正向插入的下游同源重組臂質粒，回收相應的下游同源重組臂 片段；先用回收的質粒和片段進行連接，再用Klenow大片段酶補平，用TJ)NA連接酶 連接，將連接產物轉化感受態細菌，篩選出gE基因缺失1134bp的轉移載體；
(4) 將LacZ表達盒插入轉移載體上游同源重組臂的下游，將下游同源重組臂定 向插入LacZ表達盒的下游，即得。
本發明所要解決的再一個技術問題是提供一種牛傳染性鼻氣管，毒(IBRV) ^a毒株。
本發明所要解決的再一個技術問題是通過以下技術方案來實現的
一種牛傳染性鼻氣管彌毒(IBRV)軍組毒株(IBRV46)，該^S毒株中牛傳染性鼻氣管炎 病毒的gE基因包括起始密碼子ATG在內的1134bp被缺失。
將本發明的牛傳染性鼻氣管ife^毒(IBRV) ^a轉移載體與IBRV基因組共轉染后， 篩選，即得。
本發明牛傳染性鼻氣管ife^毒(IBRV) ^a^a勺微生物保藏號是CGMCC NO. 2102; 分類命名是7/Lfec"ows Zw&e 2^/7"潔力ei"s w'r蹄保藏時間是2007年7
月6日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北
京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所。
本發明判專染性鼻氣管ife^毒(IBRV)塾且 *主要具有以下幾方面的鵬前景
1、 制備預防和治療傳染性鼻氣管ife^毒的;Sffi。
2、 可制備成診斷試劑，按照常規的分子生物學方法或血清學方法，將gE基因缺 失毒株的感染與野毒株的感染加以區別開來。這對流行病學的調査和傳染性鼻氣管ife^ 毒,方和治療極為觀。
3、 可以進一步將其進行改構或缺失，例如，可將TK (胸苷激酶)及其它病毒非 必需基因缺失，得到突變毒株并進一步制備成疫苗等。
5、將其作為外源基因的表達載體。
總之，本發明牛傳染性鼻氣管炎病毒gE基因缺失毒株(IBRV46)的成功構建，為 IBRV gE基因缺失疫苗及鑒別診斷試劑、IBRV多基因缺失毒株構建及疫苗與IBRV表達 外源基因重組病毒構建等的研究奠定了堅實的基礎。
具體實施例方式
以下通過實施例來進一步描述本發明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的 目的，決不限制本發明的保護范圍。 本發明利用我國從匈牙利引進的IBRV Bartha-Nu/67弱毒株構建了 IBRV gE基因 缺失毒株IBRV46，該毒株的gE基因編碼核苷酸包括起始密碼子ATG在內的1134bp已 被成功缺失(gE基因全長為1728bp) 。 IBRV gE基因缺失毒株IBRV46的構建過程如下
1. IBRV基因組DNA模板的制備
參照Pignatti等報道的方法抽提IBRV基因組DNA，并略做改進。用IBRV Bartha-Nu/67接種牛胎鼻甲細胞單層，待細胞出現80%病變后，用預冷的0. 01MpH7. 4 PBS洗兩遍細胞單層，刮取細胞后低速離心，將細胞懸浮于PBS中，置一7(TC保存備 用。取上述懸浮細胞液lml，加入9倍DNA提取液(10mM Tris-HCl pH8. 0， 10mM EDTA pH8. 0， 0. 5% Triton X- 100)，于室溫作用20min后加入2M NaCl使終濃度至0. 2M， 4°C 3400r/min離心10min。取上清液加RNase A至100 u g/ml， Proteinase K至100 ug/ml， SDS至O. 5%， 37。C水浴30min。等量酚、酚/氯仿各抽提一次，兩倍無水乙 醇于4。C放置20min， 4°C 12000r/min離心15min。 70%乙醇洗2次，然后溶解于50 ul TE (pH8.0)，紫外分光光度計測定病毒DNA含量。
2. gE基因缺失轉移載體的構建
參照已發表的IBRV全基因組序列(Benebank登錄號為NC 001847)，分別設計兩 對引物，用于擴增構建gE基因缺失轉移載體的上下游同源重組臂。擴增上游同源重組 臂的引物為
gIF 5， -GCG CGT CGG CGA CTC AAG CCA T-3' 120234 120255 (SEQ ID N0:1); gIR 5， -GAC CGT GTC GAC CGA AGC CGA g-3， 121842 121821(SEQ ID N0:2)，擴增片段為1609bp。
擴增下游同源重組臂的引物為gESmalF 5' - CCC CCG GGC TTT ACG TCT TTG TGC T-3' (SEQIDN0:3)， gENsiR 5， -CCA TGC ATG GGC CGG GGC ACT
ACC T-3' (SEQIDN0:4)， 擴增片段為1609bp。 PCR反應條件93。C預變性3min; 95°C 45s， 65°C 45s， 72°C 3min， 30個循環后，72。C延伸10min。取擴增產物電泳， 用膠回收試劑盒回收目的片段，克隆于T Easy Vector后測序。利用限制性內切酶AsuII 與Nsil酶切正向插入的上游同源重組臂質粒，回收質粒部分；同時用HindIII與Nsil 酶切正向插入的下游同源重組臂質粒，回收相應的下游同源重組臂片段。然后先用回 收的質粒和片段進行連接，再用Kl冊now大片段酶補平，用T4DNA連接酶連接，將連 接產物轉化感受態細菌，篩選出gE基因缺失的轉移載體，缺失1134bp。
同時構建在gE基因缺失部分插入LacZ表達盒的gE基因缺失轉移載體。構建LacZ 表達盒所用的引物為LdgEF: 5， -TTT TCg AAT gCT TCg CgA TgT ACg ggC CAg-3， ， LdgER: 5， - ATT CCC ggg gCA TCC CCA gCA TgC CTg CTA T -3，。利用pcDNA3. 1(+)作為模板，用上述引物擴增帶有完整CMV啟動子和poly A的 片段，將其克隆入T easy Vector后用HindIII與XbaI雙酶切，回收質粒部分。同時 用HindIII與Xbal雙酶切pcDNA3. 1HisLacZ質粒，回收LacZ片段，將其定向插入帶 有完整CMV啟動子和BGA poly A片段的質粒中，獲得LacZ表達盒。先利用AsuII與 Nsil位點將LacZ表達盒插入gE基因缺失轉移載體上游同源重組臂的下游，然后利用 Smal與Nsil位點將下游同源重組臂定向插入LacZ表達盒的下游，即獲得了帶有LacZ 表達盒的gE基因缺失轉移載體。
3.轉染用IBRV基因組DNA的制備
參照Morgan等(1990)報道的方法制備IBRV基因組DNA。用IBRV Bartha-Nu/67 接種牛胎鼻甲細胞單層，待細胞出現80%病變后，用預冷的0. 01M pH7. 4 PBS洗兩遍 細胞單層，加入細胞裂解液(lOraMTris-HC1 pH8. 0， ImM EDTA pH8. 0， lOOmMNaCl， SDS 至O. 5%， Proteinase K至200iig/ml) 4ml (100cm2玻璃培養瓶)作用20min。然后將 細胞裂解物加入10ml離心管中，在37。C下孵育3h。用等酚抽提l次，用等量酚/異戊 醇(24:1)抽提2次，加兩倍無水乙醇于-2(TC保存備用。用于轉染時，在16。C以12 000g 離心15min，用75%乙醇洗2次，每次離心5分鐘。將上:清液倒掉，干燥15min，用 適量去離子水懸浮，于37。C下孵育lh，即可用于轉染。
4. IBRV基因組的磷酸鈣沉淀法轉染
核酸一磷酸鈣沉淀的制備取2只1.5ml離心管，分別標記為A管和B管。在A 管中分別加入2MCaCl2、 IBRV基因組DNA、線性化的轉移載體質粒，最后加去離子水 至300ul，其中CaCL終濃度為140函，IBRV基因組DNA含量為5u g，線性化的轉移 載體質粒DNA含量為g。 B管加2XHBSP (1. 5mM Na2HP04， 10raMKCl， 280mMNaCl， 12mMGlucose， 50mM H印es， pH7. 05) 300ul。 A管各成份充分混勻后，將B管溶液緩 慢逐滴加入A管(約l一2分)，用吸管吹打6次后，在室溫下孵育30分鐘。用MEM 沖洗牛鼻甲細胞單層(60mm培養平皿)2次，將上述制備的核酸一磷酸鈣沉淀加到細 胞單層上吸附2h。然后加入5X胎牛血清的MEM培養液，過夜。次日用0.01M、 pH7. 4 PBS洗培養平皿1次，加25%DMS0 (用1XHBSP配制)，作用4min。將DMSO吸出，用 MEM洗2次，加入含2。/。胎牛血清的MEM培養液，繼續培養。待觀察到細胞病變后收取 培養皿，經3次凍融后于-2(TC結凍保存。
5. IBRV gE基因缺失重組病毒的篩選與鑒定 重組病毒的篩選策略是先用帶有LacZ表達盒的gE基因缺失轉移載體質粒與
IBRV基因組共轉染后，利用加X-gal底物的方法進行藍白斑篩選，首先篩選出表達 LacZ基因的IBRV gE基因缺失重組病毒，即藍斑病毒。然后制備表達LacZ基因的IBRV gE基因缺失重組病毒基因組DNA，與不帶有LacZ表達盒的gE基因缺失轉移載體質粒 共轉染，篩選出不帶LacZ表達盒的gE基因缺失重組病毒，即白斑病毒。篩選方法如 下
用0. 2陶針式濾器將有病變的轉染細胞培養液濾過，按1:10作倍比稀釋，接種 MDBK細胞的24孔培養板，于37'C吸附lh，然后將病毒液吸出，每孔加0.5ml的lX 甲基纖維素。待出現病變后，將甲基纖維素吸出，用MEM液洗3次，然后每孔加1% 瓊脂糖(含X-gal的濃度為15(mg/ml)，在室溫下待凝固后繼續培養。根據病毒蝕斑 的顏色來篩選重組病毒。用上述方法篩選到了一株gE基因缺失重組病毒，命名為IBRV
46。
用PCR對重組病毒進行了鑒定，上游引物為5' —CgC gTg TgT CTT ggT TTC Tg - 3，，下游引物為5， 一Tgg TCg gCA AgC Tgg TgT AT - 3，，從IBRV gE基因未缺失 毒株DNA中可擴增出長為1668bp片段，從gE基因缺失的IBRV46毒株中可擴增出約 500bp的片段，說明gE基因已被成功缺失。用Reed-Muench法測定病毒滴度，IBRV46 的TC瓜。為1077ml， gE基因未缺失弱毒株的TC瓜。為1077ml，病毒滴度未見下降， 符合制備疫苗的要求。
序列表
SE,NCE LISTING
<iio〉中閨農業科學院哈爾濱獸K研究所
<i20〉屮傳染性鼻氣管炎病毒:雖組毒株、it構^方法及Kv:ffl
<i30> P0886 <160〉 4
<170> Patentln version 3.1
<210〉 1
<211〉 21
<212〉 DNA
<213〉 Artificial
"00> 1
gcgcgtcggc g ictC33gcc a 21
<210〉 2
<211〉 22
<212〉 瞧
<213〉 Artificial
〈400〉 2
gaccgtgtcg accg3agccg ag 22
<210〉 3 <211〉 25 <212> 腿
〈400〉 ，3
rcrccgggct U acgt('t 11 gtg('t 25
〈m〉 阻
':2I:" .\rt
200710129866.2
〈400> 'l
ccatgcatgg gccggggcac tacct
權利要求
1、一種牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus)重組轉移載體，包括啟動子、牛傳染性鼻氣管炎病毒基因、終止子等，其特征在于所述牛傳染性鼻氣管炎病毒基因中gE基因包括起始密碼子ATG在內的1134bp被缺失，在缺失了gE基因的位置插入有LacZ表達盒。
2、 一種構建權利要求1所述^1^&#^管|^ 1&轉移載體的方法，包括-(1) 按照常規方法提取IBRV基因組DNA;(2) 以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2為引物，以IBRV基因組麗A為摸板，按照 常規PCR方法進行擴增，得到上游同源重組臂；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為引 物，以IBRV基因組DNA為摸板，按照常規PCR方法進行擴增，得到下游同源重組臂；(3) 將所擴增的上、下游同源重組臂分別克隆于T Easy載體后測序；利用限制 性內切酶AsuII與NsiI酶切正向插入的上游同源重組臂質粒，回收質粒部分；同時用 HindIII與Nsil酶切正向插入的下游同源重組臂質粒，回收相應的下游同源重組臂片 段；先用回收的質粒和片段進行連接，再用大片段酶補平，用T.，DNA連接酶連接，將 連接產物轉化感受態細菌，篩選出gE基因缺失U34bp的轉移載體；(4) 將UcZ表達盒插入轉移載體上游同源重組臂的下游，將下游同源重組臂定 向插入LacZ表達盒的下游，即得。
3、 一種4^^l4鼻氣管i^^ (J/ f"ecti'o脂6ow'iie rAi加加d eitfs k/jt"s) IBRV46,^Effi^:該SS^t中4^l4^氣管J^^JgE基因包括起始密碼子ATG 在內的1134bp被缺失。
4、 按照權承展求3的特嫩鼻氣管魏毒(Ji fec"ous Zwi/ e rM加f潔力eif j.s ra> s) ML毒株IBRV46,其微生物保藏號是CGMCC節.2102。
5、 權利要求3或4的4^^ft鼻氣管^tlffi,IBRV46在制備預防、治療或診 斷4K微主鼻氣管^i^M中的鵬
6、 一種預防或治療的4^專#1*鼻氣管炎6^魚11組，，含有fe^麼求3或4^jl]Mm專染 性鼻氣管!8i^^a,IBI V46和藥學上可接受的載體或佐劑。
7、 權承BStlfiW^ft鼻氣管l^figl轉移載體作為外源基因的表達載體的應用。
8、 權利要求3或4的牛"f與^r主鼻氣管^^Wl毒株IBRV46作為外源基因的表達載 體的應用。
全文摘要
本發明公開了一種牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)重組轉移載體，其構建方法。本發明還公開了用該重組轉移載體與IBRV基因組DNA共轉染后所得到的重組毒株IBRV46。本發明重組轉移載體中gE基因包括起始密碼子ATG在內的1134bp被缺失，在缺失了gE基因的位置插入有LacZ表達盒。本發明重組毒株可用于制備預防和治療傳染性鼻氣管炎病毒的疫苗。也可制備成診斷試劑，按照常規的分子生物學方法或血清學方法，將gE基因缺失毒株的感染與野毒株的感染加以區分。此外，還可以進一步將其進行改構或將其非必需基因缺失，得到突變毒株并進一步制備成疫苗等。
文檔編號G01N33/571GK101353670SQ20071012986
公開日2009年1月28日 申請日期2007年7月27日 優先權日2007年7月27日
發明者朱遠茂, 王延輝, 童光志, 飛 薛 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所