抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物制劑領域，尤其是一種抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子的制備方法。
【背景技術】
[0002]雞傳染性喉氣管炎(ILT)是由雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起的雞的一種急性接觸性呼吸道傳染病。雞傳染性喉氣管炎按癥狀表現可分為喉氣管炎型和眼型，雛雞發病多表現為眼型。該病以呼吸困難、咳嗽和咳出血樣滲出物或黃色干酪樣假膜為特征，受侵害的氣管粘膜腫脹、水腫，導致糜爛和出血，發病率接近100 %，死亡率50 %?70 %，蛋雞產蛋量明顯下降。給養禽業造成了巨大的損失，是集約化養雞場的重要疫病之一。
[0003]喉氣管炎型的病雞表現為精神沉郁、食欲下降、流涕、有濕啰音，呼吸極為困難，病雞雞冠、肉髯紫紅色，排灰白色、綠色糞便、產蛋雞產蛋率下降。眼型病雞表現為流鼻涕，目艮瞼紅腫，有泡沫樣分泌物，眼內有漿液性或膿性分泌物，上下眼瞼黏連等癥狀，病程持續時間較長，可達2-3個月。該病主要在秋冬季節和早春極易發生，多發于成年雞，病因極其復雜。病雞主要通過呼吸道分泌物排出病毒，經空氣傳播；被病毒污染的蛋、飼料、飲水、用具等也會傳染。本病除經水平傳播外，還可經卵垂直傳播，雞場一旦發生本病，很容易造成連年發生。
[0004]目前尚無治療本病的的特效藥，通常采用消除病因、提高機體抗病能力等對癥綜合療法，以緩解癥狀，減少并發癥的發生治療方法。此法雖對控制本病有一定的效果，但對發病較重的雞則效果甚微。發病雞群主要以投服抗菌藥物為主，該項措施對防止繼發感染有一定作用，但是該方法不能起到預防作用。對于雞傳染性喉氣管炎病的易感雞群，每年定期對雞接種雞傳染性喉氣管炎疫苗是預防雞傳染性喉氣管炎的有效方法。其次應增強營養或藥物干預，提高自身免疲力。通過藥物提高機體抵抗力或調節免疫力也是一種預防雞傳染性喉氣管炎的有效方法，轉移因子可起到此作用。
[0005]轉移因子(Transferfactor, TF)是T淋巴細胞釋放的一種能夠轉移致敏信息的可透析小分子物質-多肽核苷酸復合物，它能夠特異地將供體的細胞免疫信息轉移給受體正常的淋巴細胞，從而增強受體的免疫功能，被譽為T細胞活性的觸發劑、細胞免疫的增強劑、細胞免疫調節劑及干擾素產生啟動劑。具有傳遞免疫信息、激發免疫細胞活性、調節免疫功能、增強機體特異性和非特異性細胞免疫功能等作用，可以抵抗真菌、病毒等非細菌性感染。TF含多種成分，分子量小，無熱原，無抗原性，無毒副作用和無種屬差異，是一種新型而又安全的免疫制劑。
[0006]目前轉移因子的生產主要是通過半透膜透析得到，一次性生產量少，操作費用高，因此需要一種高效、快速、經濟的方法來獲取轉移因子，進而實現轉移因子的大規模工業化生產。除此之外，豬脾臟、胸腺以及淋巴結組織作為免疫活性細胞聚集的場所，且是活豬宰殺后的下腳料，成本較低而且材料來源非常廣泛，因此從這類細胞中提取特異性轉移因子，有重要的理論意義和現實意義。

【發明內容】

[0007]本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中存在的不足，提供一種抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子的制備方法。
[0008]本發明抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子的制備方法，按照以下步驟進行:
[0009](I)制備病毒抗原:將雞傳染性喉氣管炎病毒接種于9-11日齡的雞胚尿囊液中，330C _37°C溫箱孵育，24h內死亡的雞胚棄去，120h后收集有明顯痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，置于組織勻漿機內制成懸液，-200C一-40°C冰箱內保存備用；
[0010](2)提取病毒抗原:將步驟(I)中得到的懸液反復凍融3-5次后，裝入厚壁小瓶子內，超聲15-20min，4°C、5000rpm離心20_30min，棄去沉淀，收集上清液，將上清液經4°C、7000rpm離心20_30min,棄去沉淀，收集上清液,經4°C、25000rpm離心20_30min,棄去上清液，取沉淀，用等體積PBS溶液溶解。將上述溶液裝入以15 %、30 %、45 %、60 %及80 %的蔗糖制備的不連續梯度密度離心管，超速離心，4°C、15000-20000rpm離心2-4h，根據雞傳染性喉氣管炎病毒的分子量確定雞傳染性喉氣管炎病毒所在位置，吸出并置于_20°C—-400C冰箱內保存備用；
[0011](3)將步驟(2)制備病毒抗原免疫豬:挑選健康免疫豬，取步驟(2)制備的病毒抗原，采用皮下多點免疫方法，注射免疫豬，共免疫3-4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機打勻，在動物皮內或皮下多點注射免疫，第3次和第4次后在動物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7-10天后取動物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現病毒特異性免疫效價后，宰殺動物，取脾臟和胸腺于冰上，轉移至_20°C—-40°C保存，備用；
[0012](4)從步驟(3)得到的免疫豬中提取抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子:
[0013]①原材料的制備及預處理:取步驟(3)接種雞喉氣管炎病毒免疫豬的脾臟、胸腺及淋巴結組織，用冷三蒸水洗凈豬的脾臟，去除表面筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復沖洗；
[0014]②破碎:將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機以1000r/min搗碎3次,每次3min,制得勻衆液；
[0015]③凍融:將勻漿液置于_80°C快速冷凍，水浴30°C中融化，交替凍融4-8次，每次融化后均以組織勻漿機高速勻漿粉碎；
[0016]④提取:加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機于5°C以4000r/min離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；
[0017]⑤超濾:將上述濾液用截流值為5000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾，濾液為分子量小于5000道爾頓的轉移因子；
[0018]⑥除菌:將超濾得到的濾液用孔徑為0.1-0.22um的濾膜加壓過濾除菌；
[0019]⑦分裝:4°C密封保存，即得所述的抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子提取液。
[0020]本發明的優點及有益效果是:
[0021](I)原材料來源豐富、無污染、成本低。豬脾臟、胸腺以及淋巴結組織屬于屠宰后豬的下腳料。
[0022](2)破碎組織后，加入低溫凍融處理的步驟，特別是在37°C以下溶解，不使小分子物質活性喪失，并能夠使雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子得以充分地提取。
[0023](3)工藝采用了比較先進的中空纖維超濾膜超過濾法，從而縮短了制備時間，保證物質分離過程中活性不被破壞。
[0024](4)提取物經生化測定和若干成分分析，是一種低分子量多肽-核苷酸復合物，是一種不含蛋自質、可溶的小分子物質，平均分子量在5000道爾頓以下。經體內外生物活性試驗以及藥理、毒性試驗等證明，具有純度高、免疫活性強、起效快而維持時間長、易吸收、無任何不良反應等特點，其療效確切，安全可靠，既可治療又可增強抗病能力。該提取物可做成口服液或注射液等劑型，便于應用。
[0025]本發明的抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子可以全面或部分抑制雞傳染性喉氣管炎病毒，能保護正常機體細胞免受病毒感染。因此使用本發明的轉移因子可以起到預防雞傳染性喉氣管炎病毒感染、能夠保護正常機體細胞免受雞傳染性喉氣管炎病毒侵害的作用，從而降低發病率。同時對于遭到雞傳染性喉氣管炎病毒感染的雞使用轉移因子進行治療，可有效的改善臨床癥狀，提高治愈率、降低死亡率。
【具體實施方式】
[0026]本發明通過以下實施例進一步詳述。需要說明的是:下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。
[0027]實施例1
[0028]抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子的制備:
[0029](I)制備病毒抗原:將雞傳染性喉氣管炎病毒接種于10日齡的雞胚尿囊液中，37°C溫箱孵育，24h內死亡的雞胚棄去，120h后收集有明顯痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，置于組織勻漿機內制成懸液，-20°C冰箱內保存備用；
[0030](2)提取病毒抗原:將(I)中得到的懸液反復凍融3-5次后，裝入厚壁小瓶子內，超聲20min, 4°C、5000rpm離心30min,棄去沉淀,收集上清液,將上清液經4°C、7000rpm離心20min,棄去沉淀,收集上清液,經4°C、25000rpm離心30min,棄去上清液,取沉淀，用等體積PBS溶液溶解。將上述溶液裝入以15%、30%、45%、60%及80%的蔗糖制備的不連續梯度密度離心管，超速離心，4°C、ISOOOrpm離心4h，根據雞傳染性喉氣管炎病毒的分子量確定雞傳染性喉氣管炎病毒所在位置，吸出并置于-20°C冰箱內保存備用；
[0031](3)將步驟(2)制備病毒抗原免疫豬:挑選健康免疫豬，取步驟(2)制備的病毒抗原，采用皮下多點免疫方法，注射免疫豬，共免疫4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機打勻，在動物皮內或皮下多點注射免疫，第3次和第4次后在動物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫8天后取動物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現病毒特異性免疫效價后，宰殺動物，取脾臟和胸腺于冰上，轉移至-20°C保存，備用；
[0032](4)從步驟(3)得到的免疫豬中提取抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子:
[0033]①原材料的制備及預處理:取步驟(3)接種雞喉氣管炎病毒免疫豬的脾臟、胸腺及淋巴結組織，用冷三蒸水洗凈豬的脾臟，去除表面筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復沖洗；
[0034]②破碎:將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機以1000r/min搗碎3次,每次3min,制得勻衆液；
[0035]③凍融:將勻漿液置于_80°C快速冷凍，水浴30°C中融化，交替凍融6次，每次融化后均以組織勻漿機高速勻漿粉碎；
[0036]④提取:加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機于5°C以4000r/min離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過濾，取濾液；
[0037]⑤超濾:將上述濾液用截流值為5000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾，濾液為分子量小于5000道爾頓的轉移因子；
[0038]⑥除菌:將超濾得到的濾液用孔徑為0.22 μ m的濾膜加壓過濾除菌；
[0039]⑦分裝:4°C密封保存，即得所述的抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子提取液。
[0040]實施例2
[0041]抗雞傳染性喉氣管炎病毒轉移因子的制備:
[0042](I)制備病毒抗原:將雞傳染性喉氣管炎病毒接種于9日齡的雞胚尿囊液中，33°C溫箱孵育，24h內死亡的雞胚棄去，120h后收集有明顯痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，置于組織勻漿機內制成