一種類黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種類黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2及其編 碼基因和應用。
【背景技術】
[0002] 波羅蜜（ArtocarpusheterophyllusLam.)屬于桑科水果類植物，主要種植于熱 帶、亞熱帶區域。果實香味濃郁，酸甜可口，深受我國南方消費者的青睞。波羅蜜不僅是一 種特色水果資源，其枝葉組織富含一類特殊結構的黃酮類物質，即異戊烯基類黃酮。該種黃 酮類物質比常見結構的黃酮類物質生物活性更強，例如其在抑制腫瘤細胞增殖活性、免疫 調節活性等方面，均比沒有異戊烯基化的黃酮類物質更顯著。波羅蜜組織中異戊烯基類黃 酮的含量不僅高，而且結構種類豐富，目前已發現有二十余種不同結構形式的異戊烯基類 黃酮。由此可見，波羅蜜既是豐富的異戊烯基類黃酮天然資源，也是類黃酮異戊烯基轉移酶 的豐富資源。異戊烯基類黃酮在腫瘤等疾病治療方面具有非常重要的價值，具有廣泛的應 用前景。因此，利用菠蘿蜜固有的天然優勢，通過生物技術的手段來開發一種生物合成異戊 烯基類黃酮的方法將具有重要的產業價值。

【發明內容】

[0003] 本發明的第一個目的是提供一種類黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2及其編碼基因 AhFDT2。
[0004] 本發明的類黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 本發明還提供了編碼上述類黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2的類黃酮異戊烯基轉移 酶基因AhFDT2,其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0006] 本發明的第二個目的是提供類黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2在制備異戊烯基類黃 酮中的應用。
[0007] 所述的應用優選是將芹菜素加入超量表達類黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2的釀酒 酵母菌液中，經類黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2催化產生異戊烯基芹菜素。
[0008] 所述的應用優選是以類黃酮和異戊烯基供體作為底物，經類黃酮異戊烯基轉移酶 AhFDT2催化產生異戊烯基類黃酮。
[0009] 優選，所述的催化，其反應體系的pH值為7~9,反應溫度為20~40°C。
[0010] 優選，所述的類黃酮為芹菜素，所述的異戊烯基供體為二甲基丙烯基焦磷酸，經類 黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2催化產生異戊烯基芹菜素。
[0011] 優選，所述的類黃酮為山奈酚，所述的異戊烯基供體為二甲基丙烯基焦磷酸，經類 黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2催化產生異戊烯基山奈酚。
[0012] 本發明從菠蘿蜜中克隆得到類黃酮異戊烯基轉移酶基因AhFDT2,其編碼的類黃酮 異戊烯基轉移酶AhFDT2具有良好的催化合成異戊烯基類黃酮的活性。通過利用類黃酮異 戊烯基轉移酶基因AhFDT2構建表達載體轉化釀酒酵母，獲得超量表達類黃酮異戊烯基轉 移酶AhFDT2的釀酒酵母；利用其菌液或微粒體催化異戊烯基供體和類黃酮底物合成異戊 烯基類黃酮，轉化率可高達26%，產物純度可達76-95%。本發明為異戊烯基類黃酮的生物 合成提供了一種新的方法，具有操作簡便，反應污染小，產物純度高等優勢。
【附圖說明】
[0013]圖1是異戊烯基芹菜素的一級質譜圖。
[0014] 圖2是異戊烯基芹菜素的二級質譜圖。
[0015] 圖3是釀酒酵母陽性菌的菌落PCR產物電泳圖。
[0016] 圖4是異戊烯基山奈酚的一級質譜圖。
[0017] 圖5是異戊烯基山奈酚的二級質譜圖。
【具體實施方式】
[0018] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0019] 下列實例中未具體注明的實驗方法，均可按照常規方法進行。
[0020] 實施例1 :克隆類黃酮異戊烯基轉移酶基因AhFDT2、構建超表達載體及轉化釀酒 酵母
[0021] 提取波羅蜜葉片的RNA，采用逆轉錄酶M-MLV，逆轉錄反應合成的 cDNA。以該cDNA為模板，采用正向引物GCCACCATGGAGCTCTCAATTTCT，反向引物 TATGAATGGAAATAAGAAAAATTCTGCA，TakaRa公司ExTaqDNA聚合酶，進行PCR擴增；PCR條 件為：94°C，5min;94°C，45s、55°C，lmin、72°C，1. 5min;35 個循環；72°C延伸lOmin。采用瓊 脂糖凝膠電泳回收目的片段，將目的片段送交測序。經測序分析，克隆得到的類黃酮異戊烯 基轉移酶基因AhFDT2,其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，其含有1209個堿基，編碼的蛋 白命名為類黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2,共402個氨基酸，具體氨基酸序列如SEQIDNO. 2 所示。
[0022] 連接類黃酮異戊烯基轉移酶基因AhFDT2至超表達載體pYes2. 1T0P0(購自 Invitrogen公司，貨號K4150-01)上，連接反應條件為：類黃酮異戊烯基轉移酶基因 AhFDT2、質粒pYES2. 1T0P0、1. 2MNaCl、0. 06MMgClJg合后，室溫放置 30min完成連接反 應，獲得重組質粒（類黃酮異戊烯基轉移酶基因AhFDT2插入到超表達載體pYes2. 1T0P0 后的重組質粒）。然后將其再轉化至釀酒酵母感受態細胞中，轉化條件為：向酵母感受態 細胞中加入2yL重組質粒、5yL鮭魚精DNA，混勻；加入600yL轉化液（轉化液配方為： lmL50%PEG，125yL10XTE，125yL10\1^六。），301：、100卬111搖床轉化30111111;加入 70yLDMS0 (二甲基亞砜），42°C熱激15min;冰浴放置2min后13000rpm離心5s，加200yL IXTE懸浮細胞，涂布SC-U抑制平板，30 °C培養3~5天。菌落PCR篩選重組質粒成功 轉化至釀酒酵母細胞的陽性菌，篩選方法為：挑選單個菌落轉移至50yL無菌水，100°C加 熱5min，離心去除細胞碎片；取10yL上清液，加入5yLExTaqDNA聚合酶緩沖液、1yL 10mMdNTPs，1yL正向引物GCCACCATGGAGCTCTCAATTTCT，1yL來自質粒序列的反向引物 ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT，0. 5yLExTaqDNA聚合酶，31. 5yL無菌水，混合；PCR程序為： 94°C，5min;94°C，40s;55°C，40s;72°C，1. 5min;35 個循環；72°C延伸 10min。PCR產物用瓊 脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示，圖3的M為marker，1為陽性菌，該陽性菌能夠擴增出 目的片段，表明類黃酮異戊烯基轉移酶基因AhFDT2插入到超表達載體pYes2. 1T0P0后的重 組質粒成功轉化至釀酒酵母細胞，再經測序驗證確認，由此得到將類黃酮異戊烯基轉移酶 基因AhFDT2插入到超表達載體pYes2. 1T0P0后的重組質粒成功轉化至釀酒酵母細胞的陽 性菌，命名為釀酒酵母pYes2.lT0P0-AhFDT2。對釀酒酵母pYes2.lT0P0-AhFDT2進行大量 培養，首先挑釀酒酵母口￥682.11'0?041^012轉移至501^3(：1抑制培養基（2%葡萄糖為 碳源），30°0,200印111，培養至對數生長期；離心收集細胞，用3(：1誘導培養基（2%半乳糖， 1 %棉子糖為碳源）稀釋至0D600 = 0? 4, 30°C，200rpm，培養24h。用SC-U誘導培養基培養 釀酒酵母pYes2.lT0P0-AhFDT2,誘導其超量表達類黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2,即獲得超 量表達類黃酮異戊烯基轉移酶AhFDT2的釀酒酵母菌液。
[0023] 實施例2:合成類黃酮異戊烯基轉移酶基因AhFDT2、構建超表達載體及轉化釀酒 酵母
[0024] 采用全合成的方法直接合成類黃酮異戊烯基轉移酶基因AhFDT2全長序列 (具體如SEQIDNO. 1所示），按照實施例1的方法連接類黃酮異戊烯基轉移酶基因 AhFDT2至超表達載體pYes2.1T0P0上，再轉化至釀酒酵母感受態細胞中，得到釀酒酵母 pYes2.lT0P0-AhFDT2。將釀酒酵母pYes2.lT0P0-AhFDT2進行大量培養，誘導超量表達類黃