一種對微生物發酵法生產的n-乙酰神經氨酸進行分離提純的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種對微生物發酵法生產的單體N-乙酰神經氨酸進行分離提純的方法，屬于生化分離工程技術領域。
【背景技術】
[0002]微生物發酵法生產N-乙酰神經氨酸，已有很多文獻報道。申請號為201310600843.0的中國發明專利公開了利用大腸桿菌工程菌通過微生物發酵法生產N-乙酰神經氨酸的方法，該方法獲得了含產物的發酵液。
[0003]雖然微生物發酵法生產N-乙酰神經氨酸的發酵方法和工藝已有很多報道，但對于下游階段產物的分離提純方法卻鮮有報道，而下游的分離提純方法和工藝直接決定了產品的品質和市場價格。目前市場需求領域如食品、保健和醫藥領域對N-乙酰神經氨酸產品品質要求較高，純度均要求大于98%，而目前市場上純度大于98%的產品價格非常昂貴，如Sigma公司銷售的微生物發酵法來源的純度98%的N-乙酰神經氨酸，售價約1000美元/克，即使是大眾產品，98%的N-乙酰神經氨酸，售價也不低于6000元/千克。昂貴的價格和較高的品質需求，導致下游的分離提純方法和工藝亟待研宄和開發。

【發明內容】

[0004]為避免上述現有技術所存在的不足之處，本發明的主要目的是提供一種對微生物發酵法生產的單體N-乙酰神經氨酸進行分離提純的方法，旨在獲得一種高純度的質量穩定的N-乙酰神經氨酸，滿足食品、保健、醫藥和化妝品等領域的應用需求。
[0005]本發明解決技術問題，采用如下技術方案:
[0006]本發明對微生物發酵法生產的N-乙酰神經氨酸進行分離提純的方法，其特點在于按如下步驟進行:
[0007]a、以大腸桿菌發酵生產N-乙酰神經氨酸的發酵液為原料，加入蒙脫石粉進行菌體絮凝沉淀，然后采用板框過濾器進行粗濾，對所得濾液進行離心分離，以去除發酵液中菌體，獲得除菌發酵液；
[0008]b、在所述除菌發酵液中加入鹽酸，調節pH至3.0?5.0，再在80?90°C條件下加熱處理，以使雜蛋白沉淀，離心分離，去除雜蛋白沉淀，獲得除蛋白發酵液；
[0009]C、利用活性炭或凹土對所述除蛋白發酵液吸附脫色，獲得脫色發酵液；
[0010]d、使用離子交換樹脂對所述脫色發酵液進行離子交換，去除所述脫色發酵液中的無機鹽，獲得除鹽發酵液；
[0011]e、將所述除鹽發酵液進行減壓蒸發濃縮，然后在所得濃縮液中加入有機溶劑進行降溫結晶，離心分離獲得晶體；
[0012]f、洗滌所述晶體，利用真空程序升溫干燥法對洗滌后晶體進行干燥，即完成對微生物發酵法生產的N-乙酰神經氨酸的分離提純，獲得產物N-乙酰神經氨酸。
[0013]本發明對微生物發酵法生產的N-乙酰神經氨酸進行分離提純的方法，其特點也在于:步驟a所述蒙脫石粉為鈣基蒙脫石；所述蒙脫石粉的加入量為所述發酵液質量的10 ?20% ；
[0014]步驟a所述板框過濾器中濾布孔徑大小為1000?5000目。
[0015]步驟a所述的離心是通過管式高速離心機，以不低于1000rpm的轉速進行離心，以使菌體沉淀。
[0016]步驟b所述的加熱處理的時間不少于0.5h，以使雜蛋白徹底變性。
[0017]步驟c所述的活性炭或凹土的加入量為所述除蛋白發酵液質量的I %?5%，所述的吸附溫度為20?50°C，所述吸附時間不少于0.5h。
[0018]步驟d所述離子交換樹脂為陽離子交換樹脂，優選為DOOl型陽離子交換樹脂。
[0019]步驟e中所述濃縮液的濃度為100?200g/L ;所述有機溶劑為一元有機酸或一元醇和一元有機酸按體積比1:2?1:5構成的混合物；所述有機溶劑的加入量為所述濃縮液體積的2?5倍；所述降溫結晶的溫度為2?30°C，結晶時間為10?50h。
[0020]步驟f所述洗滌是以無水乙醇作為洗滌液進行洗滌；步驟f所述干燥是通過程序升溫干燥法，在70?80°C真空烘干I?6h，再在80?90°C真空烘干I?6h。
[0021]本發明的技術效果體現在:
[0022]1、本發明根據蒙脫石粉能夠絮凝菌體的性能，在大腸桿菌發酵液中加入少量蒙脫石，可以使菌體和蒙脫石粉迅速絮凝，利用板框分離即可達到很好的菌液分離效果，且對目標產物沒有影響，分離前后發酵液中目標產物含量經高效液相色譜檢測，幾乎沒有變化，如實施例1中證明了此效果；因大量菌體通過板框過濾除去后，就減輕了后續離心除菌體的壓力，含少量菌體的發酵液通過高速離心，徹底分離菌體和液體，提高分離效率；
[0023]2、本發明在加熱除雜蛋白前加入少量鹽酸調節pH至3.0?5.0，然后在80?90 °C條件下加熱，可徹底去除變性的雜蛋白。一般蛋白變性溫度在70°C左右，但因大腸桿菌發酵液比較復雜，除蛋白溫度至少在70°C以上，80?90°C熱處理效果更好，能夠徹底使發酵液中的蛋白變性，減少了結晶液中的雜蛋白，就提高了產品的純度，實施例2和對比實施例3通過比較證明了此效果，同樣條件下，當90°C熱處理時，產品純度是98.3%，而70°C熱處理時，產品純度是97.9% ；
[0024]3、因發酵液中含有少量的無機鹽，采用離子交換法去除如鈣、鎂等陽離子鹽，減少了結晶液中雜質含量，提高了產品純度，實施例4和對比實施例5通過比較證明了此效果，同樣條件下，除無機鹽后結晶產品純度是98.1%，未除無機鹽結晶產品純度是97.6% ;
[0025]4、本發明采用低溫溶劑結晶法，既可以提高產品純度，又可以提高產品收率，產品純度98%以上，此結晶步驟收率90%以上；
[0026]5、本發明采用程序升溫真空干燥法，既提高了產品純度，又提高了干燥效率；干燥過程實際是物質的吸附和脫附過程，當吸附脫附達到平衡時，干燥速率就會變得很慢，此時如果打破吸附和脫附平衡，即可提高干燥效率；一般干燥方式都是恒溫干燥，恒溫干燥過程平衡很難打破，而采用程序升溫干燥目的就在于打破此平衡，殘留在固體內的溶劑很容易揮發出來，從而提高干燥后產品的純度和干燥效率，實施例6和對比實施例7通過比較證明了此效果，同樣條件下，90°C恒溫真空干燥6h，純度97.7% ;而程序升溫干燥法，在80°C真空干燥3h，然后再90°C真空干燥2h，純度是98.5% ；
[0027]6、經高效液相色譜法檢測，本發明方法所得產品的純度高于98%，滿足市場需求，且成本低。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發明實施例1所得產品的外觀形態；
[0029]圖2為本發明實施例1所得產品的高效液相色譜檢測圖譜。
【具體實施方式】
[0030]下面結合具體實施例進一步闡明本發明。但這些實施例僅用于說明本發明，而不構成對本發明范圍的限制。
[0031]實施例1
[0032]本實施按如下步驟對微生物發酵法生產的N-乙酰神經氨酸進行分離提純:
[0033]a、菌液分離:以申請號為201310600843.0的發明專利所公開的方法中，大腸桿菌基因工程菌發酵生產的含N-乙酰神經氨酸的發酵液為原料，加入占發酵液質量15%的鈣基蒙脫石粉進行菌體絮凝沉淀，然后采用濾布孔徑為2000目的板框進行擠壓過濾，所得濾液通過管式高速離心機進行過濾，轉速12000rpm，使菌體和發酵液徹底分離，獲得除菌發酵液，經高效液相色譜檢測，除菌前后發酵液中目標產物N-乙酰神經氨酸含量幾乎沒有變化，即采用蒙脫石粉絮凝菌體，不會對N-乙酰神經氨酸造成損失；
[0034]b、去除雜蛋白:在除菌發酵液中加入鹽酸，調節pH至4.0，在85°C條件下加熱0.5h，以使雜蛋白沉淀，離心分離，去除雜蛋白沉淀，獲得除蛋白發酵液；
[0035]C、脫色:向除蛋白發酵液中加入占除蛋白發酵液質量4%的活性炭，在30°C條件下進行吸附脫色0.5h，獲得脫色發酵液；
[0036]d、去除無機鹽:將脫色發酵液緩緩進入DOOl型陽離子交換樹脂柱，連續交換，去除除蛋白發酵液中的鈣、鎂等影響產品純度的無機鹽，獲得除鹽發酵液；
[0037]e、結晶:將除鹽發酵液進行減壓蒸發濃縮，濃縮至200g/L，然后在濃縮液中加入3倍體積的甲醇和乙酸(甲醇和乙酸的混合比是1:4)的混合溶劑，降溫至10°C，結晶20h，得晶體；
[0038]f、洗滌、烘干:結晶好的晶體采用無水乙醇進行洗滌，然后進行程序升溫真空干燥烘干，真空干燥方法是75°C真空烘干3h，然后升溫至85°C再真空烘干4h，烘干后的晶體(外觀形態如圖1所示)采用高效液相色譜法檢測(結果如圖2所示)，純度為98.2%。
[0039]實施例2
[0040]本實施按如下步驟對微生物發酵法生產的N-乙酰神經氨酸進行分離提純:
[0041]a、菌液分離:以申請號為201310600843.0的發明專利所公開的方法中，大腸桿菌基因工程菌發酵生產的含N-乙酰神經氨酸的發酵液為原料