一種發酵微生物中藥制劑及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及發酵微生物中藥制劑領域，具體來說是一種治療呼吸系統疾病及其衍 生疾病的發酵微生物中藥制劑及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 目前臨床上治療急慢性支氣管炎、哮喘、肺氣腫、肺必病、感冒咳嗽等呼吸系統疾 病及其衍生疾病，西醫多采用抗炎、抗敏和解疫平喘等治法，輕則采用氨茶堿、受體興奮劑、 抗膽堿類、激素類及介質釋放阻滯類等藥物控制，效果不理想，治標不治本，難W根治，通常 伴有副作用，并且長期使用容易產生抗藥性；重則采用手術等方法，不僅費用高，還會給病 人帶來經濟和精神上極大的痛苦。而中醫采用的藥物針對病程長的患者常采用增加服藥次 數、服藥兩的方法來維持療效緩解病情，給身體代謝器官帶來極大負擔，且長期使用會引起 細菌耐藥性。

【發明內容】

[0003] 本發明針對上述問題，提供一種治療急、慢性支氣管炎、咳嗽喘息、感冒咳嗽、哮 喘、肺氣腫、肺必病、肺源性必臟病、肺癌等呼吸系統疾病及其衍生疾病的發酵微生物中藥 制劑及其制備方法和應用，該發酵微生物中藥制劑具有止咳平喘，清熱解表、潤肺健脾、益 氣巧姨等功效。
[0004] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：
[0005] -種發酵微生物中藥制劑，將側耳在中藥原料中發酵所得，所述中藥原料按重量 份數計；金銀花10-20份，枯梗5-15份，黃辜10-15份，黃柏10-15份，款冬花15-25份，沙 參8-13份，百部8-13份和甘草10-20份；
[0006]所述側耳為Pleuro化Ssp.，已于2014年4月14日保藏在"中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中必"，保藏編號為CGMCCNo. 9060。
[0007] 所述中藥原料按重量份數計；金銀花15份，枯梗10份，黃辜15份，黃柏10份，款 冬花15份，沙參10份，百部10份和甘草15份。
[0008] -種發酵微生物中藥制劑的制備方法，按W下步驟：
[000引 （1)按重量份數計，將金銀花10-20份，枯梗5-15份，黃辜10-15份，黃柏10-15 份，款冬花15-25份，沙參8-13份，百部8-13份，甘草10-20份的中藥原料混合，待用；
[0010] (2)將側耳接種到巧冬中發酵，得到經發酵后的發酵物，待用；
[0011] (3)取步驟（1)的中藥原料與步驟（2)所得發酵物混合后再發酵，所得發酵物即為 發酵微生物中藥制劑；
[0012] 或，按下述方法將側耳接種至中藥原料和巧冬的混合物中發酵，所得發酵物即為 發酵微生物中藥制劑，其中巧冬的添加量與中藥原料中黃柏添加量相當；
[0013]所述側耳（Pleurotussp.)，已于2014年4月14日保藏在"中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中必"，保藏編號為CGMCCNo. 9060,保藏單位地址為北京市朝陽區 北辰西路1號院3號。
[0014]所述步驟（2)將側耳按質量百分比為1-5%的量接種于巧冬中，并在35-75°C下發 酵1-7天。其中，側耳是將其接于PDA固體培養基中，在20-35°C、培養70-120小時，得側耳 純培養的單菌落；而后將單菌落再接種于巧冬中。
[0015]所述步驟（3)中，將步驟（1)的中藥原料藥與步驟（2)所得發酵物按質量比為 1-25:1的比例混合，混合后在35-75°C下發酵1-7天。
[0016]制備方法中，將側耳按質量百分比為1-5%的量接種于中藥原料和巧冬中，在 35-75°C下發酵1-7天，所得發酵物即為發酵微生物中藥制劑。
[0017]所述發酵產物可制成散劑、片劑、丸劑、膠丸、膠囊劑、乳劑、糖漿或口服液。
[0018] 一種藥制劑作為制備預防或治療呼吸系統疾病及其衍生疾病的藥物中的應用。
[0019]所述呼吸系統疾病及其衍生疾病包括咳嗽喘息、感冒咳嗽、急、慢性支氣管炎、哮 喘、肺氣腫、肺必病、肺癌、肺源性必臟病。
[0020] 用上述方法制備的發酵微生物中藥制劑可W用于制備預防或治療呼吸系統疾病 及其衍生疾病的藥物，所述呼吸系統疾病及其衍生疾病包括咳嗽喘息、感冒咳嗽、急、慢性 支氣管炎、哮喘、肺氣腫、肺也、病、肺癌、肺源性也、臟病等。
[0021] 本發明所用金銀花、枯梗，清熱解毒、補腎益肺、納氣定喘、排賊；黃辜、款冬花，瀉 火燥濕、止咳下氣、解氣管疫李；百部、沙參、甘草，補肺腎、益胃生津、巧姨補氣、止咳、推陳 致新，促進機體細胞的完整性，增加抗病免疫力，消除機體有害物質，是治愈后的病理結構 可W完全恢復正常；本發明為純發酵微生物中藥制劑，安全無毒副作用；另外，本發明在繼 承中藥炮制學發酵法基礎上，結合現代生物工程的發酵技術，利用側耳對中藥材進行發酵 處理，增加了藥物的療效和利用率。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1
[0023] 發酵微生物中藥制劑散劑的制備：
[0024] 1.按重量份數計，取金銀花15份，枯梗10份，黃辜15份，黃柏10份，款冬花15 份，沙參10份，百部10份，甘草15份的中藥原料藥，混合粉碎，過100目篩，混勻制成中藥 混合細粉；
[00巧]2.將側耳接種于PDA固體培養基，在2(TC、培養70小時，得側耳純化的單菌落。
[0026] 3.將單菌落側耳按質量分數3 %接種量接種于巧冬中，5(TC發酵7天，得到側耳發 酵物；
[0027] 4.取上述中藥混合細粉和側耳發酵物，按中藥混合細粉與側耳的發酵物質量比為 12. 5:1的比例混勻，7(TC發酵7天，得到產物；
[0028] 5.上述產物烘干、粉碎，過120目篩，所得細粉為散劑。
[0029] 所述側耳（PleurotusSP.)，已于2014年4月14日保藏在"中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中必"，保藏編號為CGMCCNo. 9060。
[0030] 對所述側耳（Pleurotussp.)進行DNA檢測：
[00引](l)DNA提取
[0032]用化stDNA5?^±壤0臟提取試劑盒（MPBiomedicals，SantaAna，CA)提取真 菌DM。
[0033] (2)PCR擴增
[0034] PCR擴增引物：
[0035] ITSl;5,CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3'
[0036] ITS4:5,TCCTCCGCTTATTGATATGC3'
[0037] PCR擴增程序
[0038]
[0039] (3)測序
[0040] 將PCR產物委巧上海生物工程有限公司測序 [00川基因序列結果：
[0043](4)比對結果，經NCBI(NationalCenterofBiotechnologyInformation[麗W. ncbi.nlm.nih.gov])數據庫比對，結果如下：
[0044] Pleu;ro1:usostreatusisolateNW426 18SribosomalRNAgene(登錄號： EU622251. 1)
[0045] Pleu;ro1:usostreatus即側耳。
[004引 實施例2
[0047] 1.按重量份數計，取金銀花20份，枯梗15份，黃辜10份，黃柏15份，款冬花20 份，沙參13份，百部8份，甘草10份的中藥原料藥，混合粉碎，過100目篩，混勻制成中藥混 合細粉；
[0048]2.將側耳接種于PDA固體培養基，在35°C、培養120小時，得側耳純化的單菌落。
[0049] 3.將單菌落側耳按質量分數5 %接種量接種于巧冬中，7(TC發酵7天，得到側耳發 酵物；
[0050] 4.取上述中藥混合細粉和側耳發酵物，按中藥混合細粉與側耳的發酵質量比為 20:1的比例混勻，5(TC發酵5天，得到產物；
[0051] 5.上述產物烘干、粉碎，過120目篩，所得細粉為散劑。
[00閲 實施例4
[0053] 制備方法，將側耳按質量百分比為3%的量接種于中藥原料和巧冬中，在7(TC下 發酵7天，所得發酵物產物、烘干、粉碎，過120目篩，所得細粉為散劑即為發酵微生物中藥 制劑。其中巧冬的添加量與中藥原料中黃柏添加量相當。
[0054] 中藥原料，按重量份數計，取金銀花15份，枯梗10份，黃辜15份，黃柏10份，款冬 花15份，沙參10份，百部10份，甘草15份的中藥原料藥，混合粉碎，過100目篩，混勻制成 中藥混合細粉。
[00巧]實施例5 [005引急性毒性試驗：
[0057] 受試藥物為上述實施例1制備的發酵微生物中藥制劑散劑，將其用滅菌水配制成 44%和33%濃度（g/ml)供試驗用。受試動物為昆明種封閉群小白鼠，體重18-22g，由中國 醫科大學實驗動物中必提供，實驗動物合格證號：迂實條合字1號與迂實質合字008。
[005引 （1)取小白鼠20化雌雄各半，禁食不禁水17小時，稱體重；
[0059] (2)按劑量22g/kg-次灌胃給藥44%濃度（g/ml)的受試藥物（不超過動物所能 接受的最大容積lml/20g)，給藥后常規飼養，觀察7天；
[0060] (3)按劑量16. 5g/kg-次一次灌胃給藥33 %濃度（g/ml)的受試藥物（不超過動 物所能接受的最大容積lml/20g)，給藥后常規飼養，觀察7天。
[0061] 結果顯示，上述步驟（2)中的受試動物在給藥后10分鐘出現亂跳亂娜、對刺激反 應過敏等興奮癥狀，大約持續6小時候回復；次晨發現動物死亡6只，占受試動物總數的 30% (6/20);死亡動物解剖肉眼觀察必、肝、脾、腎、肺等重要臟器，未見異常改變；24小時 內為死亡受試動物在試驗觀察期間均能恢復健康。上述步驟（3)中的受試動物未見由藥物 中毒引起的異常改變。
[0062] 綜上，本發明所述發酵微生物中藥制劑散劑小白鼠一次灌胃給藥的最大耐受量大 于或等于16. 5g/kg，小于22g/kg。此劑量大于或等于臨床承認（W60kg計）每日試用劑量 0.Ig/kg·日的165倍，小于其220倍，參照中藥新藥毒性試驗安全性的要求（中華人民共 和國衛生部；新藥審批辦法《有關中藥部分的修訂和補充規定》，1992年9月1日起施行）。 故本發明所述發酵微生物中藥制劑散劑臨床成人用藥量3g/次，日服2次是安全的。
[0063] 實施例6
[0064] 抗炎作用試驗：
[0065] 受試藥物為上述實施例1制備的發酵微生物中藥制劑散劑，用滅菌水配制成 6. 6%濃度（g/ml)供試驗用。受試動物為昆明種封閉群小白鼠，體重18-22g，由中國醫科大 學實驗動物中必提供。實驗動物合格證號：迂實條合字1號與迂實質合字008。
[0066] (1)取受試小白鼠40只，雌雄各半，禁食不禁水17小時，稱體重，隨機分為4組，每 組10只，雌雄各半；
[0067] (2)按下表1灌胃給藥，每天一次，連續給藥3天（不超過動物所能接受的最大容 積lml/20g) ;3X22今 1000
[0068] (3)末次給藥后1小時，按二甲苯致炎法，右耳涂抹二甲苯致炎，20分鐘后處死小 白鼠，用直徑7mm的打孔器切取兩耳相同部位耳片，分析天平稱重，W兩耳片重量差作為腫 脹度，用