專利名稱：:黃瓜白粉病抗性主效qtl緊密連鎖分子標記方法和應用方法
技術領域：
：本發明涉及的是一種生物
技術領域：
：的分子標記方法和應用方法，尤其是一種黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記方法和應用方法。
背景技術：
：黃瓜白粉病(PM，powderymildew)由專性活體寄生的白粉菌引起，在溫室和大田都普遍發生的葉部病害；病原白粉菌主要包括瓜單囊殼(Podosphaeraxanthii)和二抱白粉菌(Golovinomycescichoracearum)兩禾中；中國以瓜單囊殼(P.xanthii)危害較為普遍。白粉病病原寄主廣泛，成熟孢子可隨空氣氣流傳播；干燥、涼爽季節易發生，白粉病菌可以感染黃瓜植株葉片、莖和花，在開花期感染白粉病可減少產量2040%。噴灑殺菌劑和種植抗病品種是防御此病的主要方法。但長期使用殺菌劑會危害環境安全，且易引起病菌小種變異產生拮抗作用。推廣種植抗病品種是安全、環保和高效的控制策略。大量前人工作(毛愛軍，植物保護科學，2005，V21:302321;;MorishitaM，J即anAgriculturalResearchQuarterly(日本農業科學季干lj)，2003，37(1):714;SakataY，TheorApplGenet(應用遺傳理論)，2006，112:243250;張桂華，園藝學報，2004，31(2):189192)已表明，黃瓜白粉病的抗性遺傳機理復雜；常規育種實踐中，對于抗白粉病材料的選擇是十分困難的一方面選育周期長，需要經歷雜交和回交復雜的選擇程序，另一方面白粉病的發生受到很多因素的綜合影響，例如溫度、濕度和病菌小種等，鑒定抗性材料的過程不容易控制。這些都導致黃瓜白粉病育種進展緩慢的重要原因。近幾年發展起來的分子標記輔助育種技術，有效地解決了著這一問題，通過構建重要抗源的遺傳圖譜和數量性狀位點(QuantitativeTratitLoci，QTL)分析，可以找到與黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖(或共分離)的分子標記。使用與某一特定抗源抗白粉病主效QTL緊密連鎖的分子標記，可以對該特定抗源的后代及其衍生品種(系)在苗期進行早代篩選，淘汰不抗病的植株，節約生產成本，提高育種和選擇效率(張桂華，園藝學報，2004,31(2):189192);，。JohanD，TRENDSinPlantScience(植物科學趨勢)，2003，Vol.8No.7;SakataY，TheorA卯lGenet(應用遺傳理論)，2006，112:243250;)。經對現有技術文獻的檢索發現，
專利名稱：為"鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列及其鑒定方法"，公開號CN1482132。該專利技術公開了一種鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列及其鑒定方法，弓I物序列由上游引物5'-CAGTAAATGAAAGAAAAGAAG-3'，下游引物5'-ATACATAGCCATACAAAAAT_3'組成，使用該引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，包括如下步驟(l)提取黃瓜基因組的DNA;(2)進行PCR擴增；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。但是該專利技術是代表單基因控制的白粉病抗性基因作用形式，鑒定結果與田間抗病吻合率還不高。
發明內容本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記方法和應用方法。本發明是一種多基因控制的白粉病抗性的技術，比
背景技術：
在鑒定結果與田間抗病吻合率明顯提高，不受環境條件的影響，節約了成本，提高了育種和選擇效率。本發明是通過以下技術方案實現的本發明所涉及的黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記的方法，包括以下步驟①黃瓜白粉病感病品種S94(早)和黃瓜白粉病抗病品種S06($)雜交，得到雜種^;②由雜種巳自花授粉獲得子代，通過子代單粒傳(SSD)方法獲得&代的重組自交系；③分離每個重組自交系單株黃瓜葉片的DNA，進行PCR擴增，擴增產物電泳分離后，獲得分子標記資料；⑤接種白粉病病原菌，接種12d后開始調查發病情況，以第l片真葉感病面積10X為梯度，病情級別劃定為0-10級(0:植株沒有感病癥狀，10級植株真葉葉片布滿了白粉菌絲)，根據病情分級結果，計算出每個家系的病情指數(DI)，家系三次重復的DI的平均值用于統計分析和QTL定位，為遺傳分析的需要，劃定抗病(DI《20)，感病(DI>20);⑥將重組自交系每個家系的白粉病抗性與黃瓜遺傳連鎖圖中的分子標記進行連鎖和QTL分析，以2.5為LOD閾值，大于2.5說明存在一個QTL位點，確定與抗源S06白粉病抗性主效QTL連鎖的分子標記F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c。步驟③中所述的分離每個重組自交系單株黃瓜葉片的DNA，采用引物TTAACTACTTCGGACGGGCATAG禾口AGGTGTTCAGCAAACATAGGGTG;GGAAGTTTGGCTTTGGGAT禾口TGGAGTACACAGTGGGGGAA;GACTGCGTACCAATTCT和GATGAGTCTAGAACGGCT;TGAGTCCAAACCGGTCT和GACTGCGTACGAATTGAT;進行PCR擴增，擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠(100mlTAE溶液中含有1.5克瓊脂糖)和6%聚丙烯酰胺凝膠(100ml聚丙烯酰胺凝膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺)上電泳分離后，分別獲得分子標記F、CSEPGNll、e23ml8f禾口MEllEM9c。本發明所涉及的應用黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記的方法，將分子標記F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c用于黃瓜品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有白粉病抗性，包括以下步驟a)以S06及其衍生品種或品系為父本或母本與其他黃瓜雜交并繁衍至FM戈以上；b)對通過步驟a)獲得的黃瓜單個植株，分離葉片DNA，檢測分離的DNA中是否存在與白粉病主效QTL相連鎖的分子標記；如有3個以上分子標記同時出現，預測黃瓜對于白粉病達到抗病水平。所述的S06及其衍生品種或品系，是指以S06為親本，通過常規雜交、或采用組織培養、或采用組織培養、或采用花藥培養、或用別的物理或化學方法雜交誘導單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉化方法獲得的黃瓜品種或品系。將F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c分子標記用于所述的S06及其衍生品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有白粉病抗性。本發明能克服常規育種中黃瓜白粉病抗性鑒定易受環境影響，在苗期就可通過檢測分子標記對黃瓜植株的白粉病抗性進行預測和篩選，淘汰感病植株，減少在常規育種中的科研工作者的人力和設備物力的浪費，顯著加快育種進程，從而提高育種效率。本發明對抗病品種S06(早)和感病品種($)雜交獲得的重組自交系的每個家系的基因型和每個家系的白粉病抗性表型數據進行QTL和遺傳連鎖分析，獲得與S06白粉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c。通過檢測S06及其衍生品種(系)的DNA中是否有分子標記，可預測其白粉病抗性水平，從而可加快抗白粉病黃瓜的選擇進度。本發明是一種多基因控制的白粉病抗性的技術，比
背景技術：
在鑒定結果與田間抗病吻合率上有明顯提高，由94%提高到100%。本發明使用的S06是溫室型黃瓜自交系，在我國南方已經廣泛被育種家使用作為抗白粉病親本，其白粉病抗性主效QTL相連鎖的分子標記為首次報道，利用與抗源S06抗白粉病主效QTL緊密連鎖的分子標記，可以不受環境條件的影響，對該特定抗源的后代及其衍生品種(系)在早代苗期進行篩選，節約成本，提高育種和選擇效率。本發明涉及的黃瓜白粉病菌的孢子懸液由上海交通大學農業與生物學院真菌實驗室蔡潤教授提供，相關文獻發表在期刊《種子》，2008年第2期，35-38頁。圖1為S06白粉病抗性QTL連鎖群定位分析示意圖其中包含QTL的連鎖群區段被顯示，左側為標記之間的距離(cM);右側為標記名稱。具體實施方式以下結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1:黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記方法(1)采用S06與黃瓜感白粉病品種S94雜交產生F:雜種。(2)巳自交產生&，F2的252個單株隨即選取一粒種子種植，采用單粒傳的方法，繁殖到&代，產生224個家系。(3)選取在兩個親本間具有擴增多態性的SRAP、SSR、SCAR和STS引物組合，對224個家系根據已有方法(王剛，中國科學C生命科學2004，34(6):510516;SakataY，TheorApplGenet(應用遺傳理論)，2006，112:243250)進行分析，分離每個重組自交系黃瓜葉片的DNA，采用相關序列擴增多態性(SRAP)、微衛星(SSR)、序列特異性擴增區(SCAR)和序列標簽位點(STS)分子標記引物進行PCR擴增，擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠(SCAR、STS)和6g/100ml聚丙烯酰胺凝膠(SRAP、SSR)上電泳分離后，獲得分子標記多態性數據。(4)基于遺傳連鎖交換定律，對分子標記分析資料構建黃瓜遺傳連鎖圖；，將獲得的多態性數據采用軟件MAPMAKER/EXP3.0，設定LOD>3.0，使用Kosambi函數構建S06的遺傳連鎖圖譜。5[0031](5)白粉病抗性接種鑒定分別在2005年秋天和2006年春天溫室進行，分別于2005年秋季和2006年春季，家系種植采用完全隨機區組3次重復實驗設計，每重復8株；親本和巳各種植30株做為對照。采用穴盤種植(d=12cm)，基質成分為1份泥炭+1份煤渣+2份蛭石。當幼苗長至2葉一心時(約播種后20d)，對植株真葉人工噴霧接種由上海交通大學農業與生物學院真菌實驗室蔡潤教授提供黃瓜白粉病菌的孢子懸液，濃度在5-7X104個/毫升。溫室中自天溫度22-28°C，夜晚溫度15-18°C，日照時間17h左右，接種后24h內，用加濕器噴霧保持相對濕度在70%左右。接種12d后開始調查發病情況，以第1片真葉感病面積10%為梯度，病情級別劃定為0-10級(0:植株沒有感病癥狀，10級植株真葉葉片布滿了白粉菌層)。根據病情分級結果，計算出每個家系的病情指數(DI)，家系三次重復的DI的平均值用于統計分析和QTL定位。病情指數公式如下病情指數(DI)=[E(rXnr)]/10ntX100r:病級&:對應病級的病葉數；nt:調查總葉片數。為遺傳分析的需要，劃定抗病(DI《20)，感病(DI>20)。(6)綜合遺傳圖譜數據和抗性鑒定資料，QTL分析采用WinCartQTL2.5進行，利用復合區間作圖(CompositeIntervalMapping,CIM)分析，以2.5為LOD閥值，大于2.5說明存在一個QTL位點。以兩季節平均數據為基礎，復合區間作圖(CompositeIntervalM即ping，CM)分析發現在連鎖群2和4上分別在標記F和CSEPGNll，e23ml8f和MEllEM9c之間存在一個抗白粉病QTL位點，其LOD值分別為3.7和7.8，分別解釋遺傳變易為15.6%和21%(見表1、圖1)，表明F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c標記與S06的主效白粉病抗性QTL相連鎖，可用于以S06為白粉病抗源的品種和品系的白粉病抗性預測。表1S06/S94抗白粉病主效QTL分析<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2與S06抗白粉病主效QTL相連鎖的分子標記在高代遺傳群體中的驗證獲得的與黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記，在S06與S94雜交的F8代后代的部分植株進行了白粉病抗性預測，先從它們的葉片中分離DNA，然后利用標記F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c的引物對這些DNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)，并通過評判圖譜來確定是否存在相應的標記，存在3個以上分子標記，說明該品種或品系是屬于白粉病抗性的材料，不存在則是感病的材料。然后基于這些判斷準則對每個黃瓜植株的白粉病抗性進行預測。隨后利用接種白粉病病原菌的方法測定受測樣品的白粉病實際抗性并與預測結果進行對比。結果見附表2，預測結果與實測結果吻合度達到100%。附表2用與S06主效QTL緊密連鎖分子標記預測S06/S94的雜交后代(F8)的白粉病抗性口口系名稱預測結果實際結果FCSEPGN11e23m18fME11EM9c白粉病抗性病情指數終2Nil+一-一感80.5感N13++++抗9.5抗N16_-_+感68.2感感77.5感N23+感78.5感N30+++抗158抗N35++++抗10.4抗N36++++抗19.0抗N45+感54.3感N55++++抗16.7抗N59++++抗11.6抗腦感67.4感N62++++抗17.3抗N70+感75.6感N72感56.4感N74+++抗12.0抗N76+++抗14.8抗訓感77.0感N98+感46.8感7[0046]表中+表示有標記(F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c)的擴增條帶；_表示無標記(F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c)的擴增條帶。權利要求一種黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記的方法，其特征在于，包括以下步驟①黃瓜白粉病感病品種S94(♀)和黃瓜白粉病抗病品種S06(♂)雜交，得到雜種F1；②由雜種F1自花授粉獲得子代，通過子代單粒傳方法獲得F7代的重組自交系；③分離每個重組自交系單株黃瓜葉片的DNA，進行PCR擴增；④基于遺傳連鎖交換定律，對分子標記分析資料構建黃瓜遺傳連鎖圖；⑤接種白粉病病原菌，接種12d后開始調查發病情況，用于統計分析和QTL定位；⑥將重組自交系每個家系的白粉病抗性與黃瓜遺傳連鎖圖中的分子標記進行連鎖和QTL分析，以2.5為LOD閾值，大于2.5說明存在一個QTL位點，確定與抗源S06白粉病抗性主效QTL連鎖的分子標記F、CSEPGN11、e23m18f和ME11EM9c。2.根據權利要求1所述的黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記的方法，其特征是，步驟③中所述的PCR擴增，其擴增產物電泳分離后，獲得分子標記資料。3.根據權利要求1所述的黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記的方法，其特征是，步驟③中所述的分離每個重組自交系單株黃瓜葉片的DNA，采用引物TTAACTACTTCGGACGGGCATAG禾口AGGTGTTCAGCAAACATAGGGTG;GGAAGTTTGGCTTTGGGAT禾口TGGAGTACACAGTGGGGGAA;GACTGCGTACCAATTCT和GATGAGTCTAGAACGGCT;TGAGTCCAAACCGGTCT和GACTGCGTACGAATTGAT;進行PCR擴增，擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠和6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，分別獲得分子標記F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c。4.根據權利要求3所述的黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記的方法，其特征是，所述的1.5%瓊脂糖凝膠，是指100mlTAE溶液中含有1.5克瓊脂糖。5.根據權利要求3所述的黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記的方法，其特征是，所述的6%聚丙烯酰胺凝膠，是指100ml聚丙烯酰胺凝膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺。6.根據權利要求1所述的黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記的方法，其特征是，步驟⑤所述的用于統計分析和QTL定位，是指以第1片真葉感病面積10%為梯度，病情級別劃定分級，根據病情分級結果，計算出每個家系的病情指數DI，家系三次重復的DI的平均值用于統計分析和QTL定位。7.—種應用如權利要求1所述的黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記的方法，其特征是，包括以下步驟a)以S06及其衍生品種或品系為父本或母本與其他黃瓜雜交并繁衍至F2代以上；b)對通過步驟a)獲得的黃瓜單個植株，分離葉片DNA，檢測分離的DNA中是否存在與白粉病主效QTL相連鎖的分子標記。8.根據權利要求7所述的黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記的方法的應用方法，其特征是，所述的S06及其衍生品種或品系，是指以S06為親本，通過常規雜交、或采用組織培養、或采用花藥培養、或用別的物理或化學方法雜交誘導單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉化方法獲得的黃瓜品種或品系。9.根據權利要求7或者8所述的黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖分子標記的方法的應用方法，其特征是，將F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c分子標記用于所述的S06及其衍生品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有白粉病抗性。專利摘要本發明涉及的是一種生物
技術領域：
：的與黃瓜白粉病抗性主效QTL緊密連鎖的分子標記方法。包括以下步驟黃瓜白粉病感病品種S94(♀)和黃瓜白粉病抗病品種S06(♂)雜交，得到雜種F1；通過子代單粒傳方法獲得F7代的重組自交系；分離每個重組自交系單株黃瓜葉片的DNA，進行PCR擴增；對分子標記分析資料構建黃瓜遺傳連鎖圖；用于統計分析和QTL定位；確定與抗源S06白粉病抗性主效QTL連鎖的分子標記F、CSEPGN11、e23m18f和ME11EM9c。本發明鑒定結果與田間抗病吻合率由94％提高到100％。利用與抗源S06抗白粉病主效QTL緊密連鎖的分子標記，可以不受環境條件的影響，對該特定抗源的后代及其衍生品種(系)在早代苗期進行篩選，節約成本，提高育種和選擇效率。文檔編號C12Q1/68GKCN101240342B發布類型授權專利申請號CN200810034527公開日2010年6月23日申請日期2008年3月13日發明者何歡樂,劉龍洲,姚丹青,潘俊松,蔡潤申請人:上海交通大學導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan專利引用(1),非專利引用(1),