專利名稱：鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列及其鑒定方法
技術領域：
本發明涉及生物技術中的DNA引物序列及其利用DNA引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法。
背景技術：
黃瓜白粉病(powdery mildew，Sphaerotheca fuliginea L.)是一種廣泛發生的世界性植物病害。該病靠氣流進行傳播，喜溫濕、耐干燥。在溫度和濕度適宜的條件下，其病原體孢子萌發，病害先出現在植物下部葉片正面或背面，表現為白色小粉點，后擴大為粉狀圓形斑。在條件適宜時，白色粉狀斑點繼續擴展，連接成片，成為邊緣不明顯的大片白粉區，直到布滿整個葉片，看上去像長了一層白毛，所以俗稱“白毛病”，患有白粉病的葉片逐漸變黃、發脆，白毛由白色轉變為灰白色，最后使葉片失去光合作用功能。白粉病在黃瓜整個生長期均能發生，嚴重危害葉片，進而影響植株生長、結瓜，造成黃瓜減產，給蔬菜生產企業帶來經濟損失。
我國十分重視黃瓜的抗病育種研究。從上個世紀50年代末，育種家就通過常規雜交、自交等育種方法進行黃瓜抗白粉病和抗霜霉病等的選育工作，并取得了顯著成就，先后育成了一批優良品種，在生產上發揮了很大的作用。
常規的抗病育種方法雖然發揮了很大作用，但也存在許多缺點。常規抗病品種的選育主要是通過雜交和多代自交，抗病材料的選擇和田間鑒定過程復雜，周期相對較長，而且可靠性差。并大量地消耗人力、物力、財力及地力，加之黃瓜白粉病的病原(Sphaerothecafuliginea(Schlecht)Poll.)——單絲殼白粉菌(屬子囊菌亞門真菌)——為專性寄生菌，只能在活體寄主上存活，使得黃瓜白粉病的發生受季節限制，在非發病季節對該病的田間鑒定工作則難以進行。
RFLP、RAPD等分子標記技術的問世，為育種提供了一條新的途徑。分子標記可以直接以DNA的形式表現，在生物體的各個組織、各個發育階段均可檢測到，不受季節、環境限制，不存在表達與否等問題。
分子標記技術在尋找與目標性狀連鎖的分子標記方面已有諸多報道，但與黃瓜白粉病抗性相關基因緊密連鎖的分子標記目前尚未見報道。在利用分子標記進行抗性鑒定的過程中，特異性的引物序列是關鍵。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列；本發明的另一個目的是用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法。
本發明的技術方案概述如下鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列，它由上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′，下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′組成。
一種使用上述引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA 15～30ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性180～300秒，94℃變性60秒，47～53℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個循環，再72℃延伸300～420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用6％變性聚丙烯胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
第二種鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列，它包括兩組引物，所述第一組引物由上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′，下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′組成，所述第二組引物由上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′組成。
一種使用第二種引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA；(2)進行PCR擴增在兩支PCR擴增專用薄壁管中分別放入所述黃瓜基因組DNA 15～30ng、在第一支擴增專用薄壁管中放入第一組上游引物5′-CAG TAAATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′20～40ng、在第二支擴增專用薄壁管中放入第二組上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′20～40ng下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、再在兩支擴增專用薄壁管中分別加入dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μ，將所述兩支PCR擴增專用薄壁管分別進行PCR擴增，擴增條件為94℃預變性180～300秒，94℃變性60秒，第一支PCR擴增專用薄壁管在50～55℃退火40～60秒，第二支PCR擴增專用薄壁管在53～56℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個循環，再72℃延伸5～7分鐘，擴增完成；(3)PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個擴增產物均采用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點樣于事先制備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進行電泳使溴酚藍泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
該技術鑒定結果與田間抗病吻合率達94％，而且具有快速、準確、不受環境條件影響等優點，在黃瓜白粉病抗性篩選上具有很大的應用價值。


圖1是第一種技術方案的電泳圖；圖2和圖3是第二種技術方案的電泳圖。
具體實施例方式
下面結合實施例和附圖對本發明作進一步的說明實施例1一種使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規方法；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入黃瓜基因組DNA 30ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′30ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′30ng、dNTP 0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性300秒，94℃變性60秒，48℃退火60秒，72℃延伸120秒，35個循環，再72℃延伸420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性，由于抗病單株、感病單株或中間類型單株經擴增以后產生不同分子量的DNA片段，在凝膠上分離時其在凝膠上的遷移速率不同，從而形成位置上存在差異的條帶，通過條帶在凝膠上的相對位置就可對黃瓜白粉病材料的抗性進行快速鑒定。如圖1所示1為指示DNA標準條帶的分子量200bp；2為抗性帶；3為感性帶，M為DNA標準，泳道1及3～9為抗病單株；泳道2及10～16為感病單株；泳道17～23為中間類型單株，純合抗性株僅有抗性帶，純合感性株僅有感性帶，雜合類型同時具有抗性帶和感性帶。
實施例2一種使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規方法；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入黃瓜基因組DNA 15ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20ng、dNTP0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性180秒，94℃變性60秒，47℃退火40秒，72℃延伸60秒，25個循環，再72℃延伸300秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色后在KANGRIDE可見光下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
實施例3一種使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規方法；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入黃瓜基因組DNA 20ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′40ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′40ng、dNTP 0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性240秒，94℃變性60秒，53℃退火60秒，72℃延伸100秒，30個循環，再72℃延伸600秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色后在KANGRIDE可見光下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
實施例4是第二種技術方案中使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規方法；(2)進行PCR擴增在兩支PCR擴增專用薄壁管中分別放入黃瓜基因組DNA 30ng、在第一支擴增專用薄壁管中放入第一組上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′30ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′30ng、在第二支擴增專用薄壁管中放入第二組上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′30ng下游引物5′-ATA CAT AGC CATACA AAA AT-3′30ng、再在兩支擴增專用薄壁管中分別加入dNTP 0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴增專用薄壁管分別進行PCR擴增，擴增條件為94℃預變性300秒，94℃變性60秒，第一支PCR擴增專用薄壁管在50℃退火60秒，第二支PCR擴增專用薄壁管在53℃退火60秒，72℃延伸120秒，35個循環，再72℃延伸7分鐘，擴增完成；(3)PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個擴增產物均采用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點樣于事先制備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進行電泳使溴酚藍泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性，圖2所示的是第一支擴增產物，1為指示DNA標準條帶的分子量200bp；2為指示DNA標準條帶的分子量100bp；3為抗性帶，圖3所示的是第二支擴增產物，1為指示DNA標準條帶的分子量100bp；2為性帶，兩個圖中的M為DNA標準，泳道1及3～9為抗病單株；泳道2及10～16為感病單株；泳道17～23為中間類型單株，在圖2中，抗病單株和中間類型單株具有抗性帶，而感病單株無此條帶，據此可鑒定出純合感病個體；在圖3中，感病單株和中間類型單株均具有感性帶，而抗病單株無此條帶，據此可以鑒定出純合抗病個體。將圖2和圖3結合在一起觀察和分析，可以當作一個共顯性的標記。在第一組中無帶的為純合感性株，在第二組中無帶的為純合抗性株，在兩組中均有條帶的為雜合中間型，據此快速鑒定出純合抗性株、純合感性株及雜合中間型株，實現黃瓜白粉病抗性的快速鑒定。
實施例5是第二種技術方案中使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規方法；(2)進行PCR擴增在兩支PCR擴增專用薄壁管中分別放入黃瓜基因組DNA 30ng、在第一支擴增專用薄壁管中放入第一組上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′40ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′40ng、在第二支擴增專用薄壁管中放入第二組上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′40ng、下游引物5′-ATA CAT AGCCAT ACA AAA AT-3′40ng、再在兩支擴增專用薄壁管中分別加入dNTP 0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴增專用薄壁管分別進行PCR擴增，擴增條件為94℃預變性200秒，94℃變性60秒，第一支PCR擴增專用薄壁管在55℃退火60秒，第二支PCR擴增專用薄壁管在56℃退火60秒，72℃延伸120秒，30個循環，再72℃延伸10分鐘，擴增完成；(3)PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個擴增產物均采用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點樣于事先制備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進行電泳使溴酚藍泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
實施例6是第二種技術方案中使用鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA，提取的方法為常規方法；(2)進行PCR擴增在兩支PCR擴增專用薄壁管中分別放入黃瓜基因組DNA 15ng、在第一支擴增專用薄壁管中放入第一組上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTG AAA AAC-3′20ng、在第二支擴增專用薄壁管中放入第二組上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′20ng下游引物5′-ATA CAT AGC CATACA AAA AT-3′20ng、再在兩支擴增專用薄壁管中分別加入dNTP 0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴增專用薄壁管分別進行PCR擴增，擴增條件為94℃預變性180秒，94℃變性60秒，第一支PCR擴增專用薄壁管在48℃退火40秒，第二支PCR擴增專用薄壁管在50℃退火40秒，72℃延伸60秒，25個循環，再72℃延伸5分鐘，擴增完成；(3)PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個擴增產物均采用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點樣于事先制備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進行電泳使溴酚藍泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
權利要求
1.鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列，其特征在于它由上游引物5′-CAG TAA ATG AAAGAA AAG AAG-3′，下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′組成。
2.一種使用權利要求1的引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，其特征是它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA 15～30ng、上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性180～300秒，94℃變性60秒，47～53℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個循環，再72℃延伸300～600秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用6％變性聚丙烯胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
3.鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列，其特征在于它包括兩組引物，所述第一組引物由上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′，下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTGAAA AAC-3′組成，所述第二組引物由上游引物5′-CTC AAG TTT TTT TCT TGT TTC-3′下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′組成。
4.一種使用權利要求3的引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，其特征是它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA；(2)進行PCR擴增在兩支PCR擴增專用薄壁管中分別放入所述黃瓜基因組DNA 15～30ng、在第一支擴增專用薄壁管中放入第一組上游引物5′-CAG TAA ATG AAA GAA AAG AAG-3′20～40ng、下游引物5′-TTC TGA TTT TGA GTGAAA AAC-3′20～40ng、在第二支擴增專用薄壁管中放入第二組上游引物5′-CTC AAG TTTTTT TCT TGT TTC-3′20～40ng下游引物5′-ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT-3′20～40ng、再在兩支擴增專用薄壁管中分別加入dNTP 0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴增專用薄壁管分別進行PCR擴增，擴增條件為94℃預變性180～300秒，94℃變性60秒，第一支PCR擴增專用薄壁管在48～55℃退火40～60秒，第二支PCR擴增專用薄壁管在50～56℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個循環，再72℃延伸5～10分鐘，擴增完成；(3)PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個擴增產物均采用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點樣于事先制備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進行電泳使溴酚藍泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。
全文摘要
本發明公開了一種鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列及其鑒定方法，引物序列由上游引物5′－CAG TAAATG AAA GAA AAG AAG－3′，下游引物5′－ATA CATAGC CAT ACA AAA AT－3′組成，使用該引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組的DNA；(2)進行PCR擴增；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性，采用本方法的鑒定結果與田間抗病吻合率達94％，而且具有快速、準確、不受環境條件影響等優點，在黃瓜白粉病抗性篩選上具有很大的應用價值。
文檔編號C07H21/00GK1482132SQ03129978
公開日2004年3月17日 申請日期2003年6月4日 優先權日2003年6月4日
發明者杜勝利, 張桂華, 李淑菊, 魏愛民, 張歷, 韓毅科 申請人:天津科潤農業科技股份有限公司, 天津市農業生物技術研究中心