專利名稱:增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白及方法
技術領域：
本發明涉及一種增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白及其制備方法。
背景技術：
紅細胞生長因子是紅細胞生長分化的重要刺激因子，其功能為調節和促進幼稚紅細胞的生長分化，對晚期BFU-E(Burst Forming Units-Erythrocytes)及CFU-E(Colony Forming units-Erythrocytes)有促進分化作用，并使其合成的血紅蛋白變成成熟紅細胞。它也能促進網質紅細胞的提前釋放，并能刺激骨髓巨核細胞。
臨床已廣泛使用紅細胞生長因子治療腎臟疾病引起的貧血，腫瘤病人化療后引起的貧血，以及外傷引起的大出血，即可以刺激患者自身的造血功能，彌補各種原因造成的紅細胞減少。因紅細胞生長因子只是造血因子的一種，另有其它造血因子能刺激血細胞的生長發育(如粒細胞和淋巴細胞等)，因此，世界上已有幾種構建復合性刺激因子的例子，如IL3-EPO，EPO-IL3，IL3-6CSF(WO 92/06116，專利)。實驗證明，IL3-EPO和EPO-IL3具有刺激BFU-E和CFIJ-E的作用。復合因子的構建是根據其自身功能，同時又具有雙重協同作用。最新一例證明是生產紅細胞生長因子/粒細胞集落因子(EPO/GM-CSF)(Antonio M et al，US Patent 5916773)。
根據紅細胞生長因子的生長和代謝過程，其二聚體及三聚體(二聚體以下簡稱EPO-EPO，三聚體以下簡稱EPO-EPO-EPO)也能夠促進其生物活性。紅細胞生長因子產生于腎臟，作用于骨髓，然而它的分子量較低，由腎臟產生進入血液循環后，可很快曲腎臟經尿液排出，而且尿液排出后的紅細胞生長因子經提純仍具有生物活性。盡管利用生物工程技術生產的紅細胞生長因子已廣泛應用，但仍有同樣問題。針對其應用與不足，為提高紅細胞生長因子的半衰期，增長其在血液中的停留時間以發揮更長功效，研究人員進行了各方面的實驗，如用多聚乙二醇連接蛋白，用化學方法將蛋白連接成二聚及多聚體等，其結果均為增大分子量，增長其體內循環時間。在以前的研究中，有的獲得成功，有的沒有成功。在這里我們利用基因工程的方法制造出二/三聚體的蛋白，經過初步實驗證明，其合成藥物具有和天然單體一樣的生物功效，而且延長了蛋白的生物活性，進而減少了用藥次數。

發明內容 本發明提供增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白及方法，的目的在于克服已有的用化學方法將蛋白連接成二聚及多聚體，其結果均為大分子量的混合物，且活性低的缺點，為了提高紅細胞生長因子的半衰期，增長其在血液中的停留時間以發揮更長功效，而且延長了蛋白的生物活性，進而減少了用藥次數；從而提供一種增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白。
本發明的目的是這樣實現的該結構包括在兩單體中間由一個連接片段將兩個單體連接為二聚體融合蛋白，或在其三單體中間有兩個連接片段將三個單體連接為三聚體融合蛋白，并具有紅細胞生長因子的蛋白自然順序，二聚體融合蛋白具有如下所示的序列
EPO-L-EPO，
三聚體融合蛋白具有如下所示的序列
EPO-L-EPO-L-EPO 。
本發明一種實施方案是在兩單體中間由一個連接片段，其連接片段是將一紅細胞生長因子的3′端與另一紅細胞生長因子的5′連接而成。
本發明一種實施方案是在三聚體中間由二個段連接片段而成。
本發明一種實施方案是在三單體中間有二段連接片段是第一個紅細胞生長因子的3′端通過連接片段與第二個紅細胞生長因子的5′端連接，再通過第二個連接片段把第二個紅細胞生長因子的3′端與第三個紅細胞生長因子5′端連接而成。
本發明一種實施方案是連接片段為連接肽，該連接肽是具有9-20個相同的或不相同的氨基酸連接順序。
本發明一種實施方案是所述的連接肽包括但不限于如下序列
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Ala-Ala；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
本發明一種實施方案是所述的二聚體/三聚體紅細胞生長因子的質粒構建，在構建中使用設汁合成的引物寡聚脫氧核苷酸P1，P2，P3，P4，P5，P6，它們的核苷酸序列分別是
P15’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’；
P25’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’；
P35’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’；
P45’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCA CCTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’；
P55’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGC GGAGCCCCACCACGCCTCATC 3’；
P65’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’。
本發明提供的一種用基因工程方法生產增強其生物活性的紅細胞生長因子二聚體/三聚體融合蛋白的制備方法，包括如下步驟
1.獲得EPO-EPO及EPO-EPO-EPO的融合基因質粒，首先從細胞中提取信使核糖核酸(mRNA)，利用逆轉錄酶-DNA聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法制備單鏈和雙鏈互補脫氧核糖核酸(cDNA)，經過分離純化，將EPO cDNA克隆到載體上，以此為基礎進行融合蛋白的構建(重組質粒的構建如圖1所示的)；
2.利用聚合酶鏈反應(PCR)對EPO cDNA進行了亞克隆和未端改造，然后 在末端改造的兩/三個蛋白之間增加了一/兩小段連接片段(連接肽Linker，L見圖2A，2B，2C)；
3.通過限制性內切酶，構建成了能夠表達如圖3所示的EPO-EPO及如圖4所示的EPO-EPO-EPO的融合蛋白質粒，并將其質粒轉化進入細胞株如CHO或COS細胞株。轉化后的細胞能分泌EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白。以下詳細描述制備方法
所使用的材料包括
一.細胞株包括CHO細胞株，COS細胞株。
菌株包括菌株DH5α，菌株HB101，
質粒包括TopoTA連接質粒(3.9Kb，Ampr)，pBR322，pUC18。
真核細胞表達質粒包括pBS1(4.6Kb，DHFR)，pMCM(5.6Kb，Ampr)。
二.酶類DNA聚合酶(Clonetech)；限制性內切酶(Promega，Biolab).
T4 DNA連接酶(Life Technologies)；mRNA純化Kit(Invitrogen)；
cDNA合成Kit(Strategen)。
三.主要生化試劑和材料
EPO標準品(Amgen)； dNTP(Perkin Elmer)；瓊脂糖(BRL)；氨卞青霉素(Sigma)；蛋白分子量標準(Bio-Rad)；DNA分子量標準(Life Technologies)；EPO ELISAKit(R&D)。馬丁培養基，肉湯培養基購自天壇生物制藥；支原體培養基，購自長春生物制品所。以上所需的材料均是市場上可以買到的。
四.質粒的制備質粒篩選，
1.將含有目的質粒的細菌培養物培養到對數晚期(OD600約0.6)，將含有相應抗生素的LB培養液(預溫到37℃)放入燒瓶內，加入對數晚期培養物，于37℃劇烈振搖培養25小時，所得培養物的OD600值約0.4，于4℃以4000轉/分離心15分鐘，棄上清；將細菌沉淀重懸于用冰預冷的STE溶液中(STE溶液0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl，pH8.0，1mmol/LEDTA，pH8.0)，離心收集細菌細胞。將收集細菌的細胞重懸于用冰預冷的含10％蔗糖，50mmol/LTris·Cl，pH8.0的溶液中，加溶菌酶溶液，混勻，在冰上放10分鐘，加10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，混勻，立刻加5mol/LNaCI(終濃度為1mol/L)混勻，在冰上放1小時，離心，將上清用酚氯仿和氯仿各提一次，將水相于室溫加入2倍體積乙醇混勻，于室溫放1.2小時，離心，回收質粒。
2.DNA片段的放大
用PCR方法將EPOcDNA(以及其它DNA片段)放大，放置PCR儀中進行擴增94℃，45秒，55℃，45秒，72℃，1-2分鐘，循環35次后，72℃，7-10分鐘。
3.DNA片段的連接
用相同限制性內切酶切質粒和EPOcDNA(以及其它DNA片段)，37℃，30-60分鐘，經瓊脂糖電泳純化后，用T4 DNA連接酶連接，形成重組質粒的構造。
4.限制性內切酶分析
用限制性內切酶切重組質粒，經瓊脂糖電泳純化后，得到EPOcDNA(以及其它DNA片段)，由此證明連接的正確性。
5.DNA序列分析
用Sanger雙脫氧鏈終止法，將dNTP，DNA模板，Klenow，等量加在4個管中，55℃，30分鐘，分別加入ddA，ddG，ddT，ddC，保存于室溫15-20分鐘，按常規方法處理，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測序。
6.SDS-PAGE電泳等常規方法均參照下述文獻(Sambrook J et al，ALaboratory Methods-Molecular Cloning，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，2ndEdition，1989；Current Protocol of Molecular Biology，John wiley & Sons)進行電泳檢測。
五、細胞培養
從液氮中取出冷凍細胞，置37℃水浴中迅速融化，將細胞懸液移入離心管內，加入培養基，離心10分鐘，用含10％小牛血清(Life Technologies)的培養基重懸細胞，然后移入培養瓶內，接種量為3×104cells/cm2，將細胞置于CO2，培養箱內，37℃，5％CO2，，活細胞比例＞85％(48-72小時)。
六、樣品蛋白含量測定
1.染色液的配制100mg考馬斯亮蘭G-250溶于50ml 95％乙醇中，然后與100ml 85％(w/v)磷酸混合，用水稀釋至1000ml；
2.測定方法若蛋白量為＞0.2mg/ml，取0.1ml樣品與5ml染色液均勻混合，靜置10-30分鐘后測定A600nm；若蛋白量為5-100μg/ml，取0.8ml樣品與0.2ml染色液均勻混合后進行測定；
以BSA測得曲線為標準曲線。
本發明的優點在于本發明為一種利用基因工程技術生產紅細胞生長因子(簡稱EPO)二聚體/三聚體融合蛋白的亞克隆和末端改造及用聚合酶鏈反應(Polymeraase Chain Reaction，PCR)方法，把兩個/三個相同的能表達紅細胞生長因子的基因通過一段/兩段多肽連接起來，并接入哺乳動物細胞表達質粒，將其轉入哺乳動物細胞后得到了表達。融合蛋白不僅具有紅細胞生長因子的生理活性，而且延長了蛋白在生物體內的儲留時間，進而增強其生物功效。該方法簡單，并且得到的二聚體/三聚體融合蛋白具有天然的紅細胞生長因子的生物活性，而且，實施例中EPO-EPO具有生物活性為135000IU/mg，三聚體EPO-EPO-EPO具有生物活性為150,000IU/mg本發明的EPO-EPO/EPO-EPO-EPO通過增強生物效應，延長體內半衰期，減少用藥次數，極大地提高了紅細胞刺激因子的臨床實用價值。

圖1是EPO cDNA的合成及重組質粒的構建；
圖2A，2B，2C是中間連接片段的設計，構造以及通過PCR方法修飾和構建
的EPO質粒。cDNA序列的兩端都得到了修飾，即末端改造。
圖3是構建pTrm-EPO-Linker-EPO質粒的流程圖。
圖4是pMNAD EPO-Linker-EPO-Linker-EPO質粒的構建流程圖。
圖5是轉染CHO-dhfr-細胞的陽性克隆照片。
圖6A是CHO-dhfr-細胞形態照片，圖6B是工程細胞株CHO-BTE形態照片。
圖7是Linker’s氨基酸序列圖例。
圖8A是二聚體融合蛋白的序列，和圖8B是三聚體融合蛋白的序列。
圖9A是構建后二聚體融合蛋白的示意圖，和圖9B是三聚體融合蛋白的示意圖。
圖10是是融合蛋白的純化圖(SDS-PAGE)。

具體實施方式 實施例1本實施例中所用的連接片段是連接肽，其連接肽順序的一級結構，即連接二聚體/三聚體的蛋白順序，是9-20個氨基酸連接順序，具有這些連接順序的氨基酸都可以用，圖7所示的一種序列是本例中應用的。
引物寡聚脫氧核糖核酸的設計與制備
P15’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’
P1是從EPO基因起始因子開始，包括信號肽鏈。
P25’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’
P2是互補于3’末端的寡聚脫氧核糖核酸，與P1一起，通過PCR，
放大并克隆全長(蛋白編碼)EPO cDNA。以后的亞克隆及二聯/三聚體的構建均用該質粒為基礎。
P35’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’
P3的后部分與EPO的起始密碼之后的脫氧核糖核酸序列一致。在起始密碼之前，我們加了一個BamH I位點。
P45’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCACCTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’
P4是與EPO cDNA終止密碼之前的序列互補(不包括終止密碼)，并額外加了一段連接肽的核苷酸序列，其中含有一個Sac II位點。在SacII位點之后又加了一個EcoR I位點。P4與P3一起，通過PCR方法，將EPO基因的3’末端的終止密碼去掉，并加上一段連接片段(Linker)。
P55’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGA GCCCCACCACGCCTCATC 3’
P5是與EPO成熟蛋白的5’脫氧核糖核酸的起始序列一致(在信號肽下游不包括信號肽)，在上游加了一段連接肽的核苷酸序列，其中包括了Sac II位點，同時在Sac II位點前插入了一個EcoR I位點。P4和P5一起，通過PCR方法，將EPO基因的起始因子和終止因子去掉，并將EPO基因兩端各加上一段連接片段(Linker)。
P65’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’
P6與EPO cDNA的末端互補(包括終止密碼)，并帶有一個Hind III位點。
P5和P6一起，通過PCR方法，將EPO基因的5’末端的起始因子去掉，并加上一段連接片段(Linker)。
實施例2 EPO-EPO和EPO-EPO-EPO所用LINKER序列的篩選及確定
經過一些列預試驗及檢測，確定了下述的連接肽序列，包括但不限于如下序列
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Ala-Ala；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
Gly-Gly-Scr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
以下實施例中均為應用其中由14個氨基酸組成的LINKER所構建的EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白所得到結果，其它各種LINKER所構建的EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白的生物活性及功能與之相似。
實施例3 EPO，EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合基因全長核苷酸序列的測定
為了獲得EPO基因，EPO-EPO以及EPO-EPO-EPO融合基因，對cDNA及改造后序列進行了亞克隆和末端改造，并利用常規方法對每一cDNA及改造后的融合基因進行了核苷酸序列測定(詳見實施例1，圖2，圖3，圖4)。
實施例4 EPO cDNA的制備
用1ug mRNA為起始物，將mRNA溶于20ul去離子的水中，加熱65℃，10-20分鐘，置于冰浴中備用；然后加入cDNA合成緩沖混合液和AMV逆轉錄酶，其中含有1ug mRNA，50mM Tris·HCl(pH 8.3)，40mM KCl，6mM MgCl2，4mM DTT，0.5mM dNTP，0.1mMpoly(dT)12-18，0.1mg/ml BSA。在37℃反應一小時。從上面的反應液中，取5ul，放入DNA聚合酶鏈反應(PCR)的試管中，依次加入100pmolP1和P2的上下游引物，(見實施例1)，5ul PCR緩沖液(10X)，2.5mmol/L的dNTP和5單位的DNA聚合酶(Taq DNAPolymerase)，最終體積為50ul；放置PCR儀中進行擴增94℃，45秒，55℃，45秒，72 0C，1-2分鐘，循環35次后，72℃，7.10分鐘；反應完成后立刻取出，放置冰浴中待用。
實施例5 EPO重組質粒的構建
按照圖1，PCR反應完成后，從試管中取5ul反應液，加入另一試管中，其中含有Topo載體以及T4 DNA連接酶，形成EPO的基本構造，成為以后基因改造的基礎。本發明對所有質粒均進行了限制性內切酶的分析以保證序列的正確性。
實施例6 EPO-EPO重組質粒的構建
參考圖3，經過改建和亞克隆后形成EPO-EPO重組質粒。經過對其最后表達質粒的限制性內酶的分析和序列測定后，證明其結構與所設計的結構一致。
實施例7 EPO-EPO-EPO重組質粒的構建
參考圖4，經過改建和亞克隆后形成EPO-EPO重組質粒。經過對其最后表達質粒的限制性內酶的分析和序列測定后，證明其結構與所設計的結構一致。
實施例8 EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合基因在真核細胞中的高效表達
用于表達EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白真核細胞株為CHO-dhfr-(CHO，DUKXBl)(Urlaub G，et al，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.77，1216)。利用Lipofectin(LifeTechnologies)將EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合基因進行轉化；轉化克隆生長于含有氨甲蝶蛉(Methotrexate，Sigma)的細胞培養液中，在含5％CO2培養箱中，37℃培養；逐漸增加氨甲蝶蛉濃度以選擇出高效表達細胞株。本發明用EPO ELIsA Kit(R&D)對融合蛋白的活性進行了測定。
1.CHO-dhfr-細胞穩定轉染預試驗
根據Lip2000說明書，用不同的質粒對應不同體積的轉染試劑Lip2000進行預試驗摸索，同時設立空白對照。對CHO-dhfr-細胞進行轉染預試驗。
2.CHO-dhfr-細胞轉染
將真核表達質粒及Lip2000分別與DMEM混合，室溫20分鐘，加入CHO-dhfr-細胞中，兩周后出現陽性克隆，參考圖5。
3.MTX加壓方法如下CHO-dhfr-細胞2.4×106+真核表達質粒+Lip2000，完全培養基，轉染48小時+篩選培養基+10nM MTX加壓，出現克隆，逐步提高MTX濃度，用100 nM的MTX篩選培養基傳代，挑選克隆細胞測EPO的表達量，將高表達細胞株繼續加壓，增至500nM MTX水平，將高表達細胞株擴大培養，凍存，亞克隆，獲得高效穩定表達株，經MTX反復加壓，逐步加大MTX的濃度，擴大細胞培養，收取上清，最終篩選到高效表達的細胞株CHO-BTE，參考圖6。
4.CHO-BTE細胞形態和特征
CHO-BTE細胞株在體外連續傳代25代，其形態與轉染前的CHO-dhfr-無明顯差別。為多角形類似上皮細胞。參考圖7A及7B。
5.CHO-BTE細胞株、細菌、真菌、支原體檢查
用配制好的馬丁、肉湯培養基，使用前121℃15分鐘高壓滅菌。分裝10ml/枝。將CHO-BTE上清(2天)抽取1ml分別加入馬丁、肉湯各1ml，每個樣品各兩管。蓋好蓋。同時設陰性對照2管，放37℃培養7天。每天觀察結果。7天判定CHO-BTE株陰性。
支原體檢查
將支原體培養基用前煮沸15分鐘，冷卻56℃以下，加入牛血清2ml(培養基8ml+2ml血清)，充分振搖，取CHO-BTE細胞上清1ml分別加入支原體培養基中，每個樣品接種4管，同時設空白對照，放37℃觀察21天，結果判定陰性。此細胞株無支原體污染。
6.CHO-BTE細胞外源性檢測(紅細胞吸附試驗)
取CHO-BTE細胞3瓶，制成1×105/ml，每瓶接種5ml，待細胞生長單層，換維持液(IMDM+2％FCS+丙酮酸鈉+非必須氨基酸)10ml/瓶，繼續觀察2周，每三天換液一次，每日鏡檢細胞，CHO-BTE細胞基本保持正常形態，即多角形。上皮細胞。14天后，取1/3細胞培養瓶細胞，用0.2％-0.5％豚鼠紅細胞混合細胞懸液，做紅細胞吸服試驗，加入紅細胞后置4-8℃，30分鐘，鏡下觀察結果，陰性，無細胞凝集。然后將其細胞置于20-25℃、30分鐘。鏡下觀察結果陰性，無細胞凝集。說明此細胞沒有外源性病毒污染。
豚鼠主要檢測細胞內核枝分枝桿菌，在注射前觀察4周，做結核菌素應為陰性。家兔主要檢查猴源細胞是否有B病毒污染。
具體試驗結果如下
動物體內接種法進行外源病毒檢查結果，(其結果見表1)。
表1CHO-BTE細胞外源性檢測
7.CHO-BTE細胞穩定性試驗
CHO-BTE細胞經反復液氮凍存，復蘇，細胞形態正常，無改變。經檢測CHO-BTE細胞株，室溫、4℃、-20℃凍存上清，EPO的表達量無明顯影響，說明CHO-BTE細胞株穩定表達的細胞株。
實施例9 EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白的分離純化
經克隆后的細胞株，在無血清細胞培養液中培養(CHO-S-SFM II，LifeTechnologies)，待細胞長到80％充滿時(約48-72小時)，收集細胞培養液.將細胞培養液進行濃縮，然后進行透析(pH4.2，100mM磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液)4℃，24小時.將透析后的溶液上樣于已平衡后的CM Sepharose FF柱(柱為5×20cm；用pH4.2，100mM磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液平衡5-10倍柱體積).分別用含100mmol/L、300mmol/L、500mol/L NacL的緩沖液進行鹽梯度洗脫，收集融合蛋白，經活性測定后收集有活性部分，將其濃縮并交換成pH7.0 10mmol/L磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液.將濃縮并交換緩沖液后的樣品上樣于已平衡好的Sepharose分子篩層析柱(柱為2.6×100cm；平衡液流動相均為10mmol/L pH7.0磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液).分管收集各洗脫峰，經活性測定有活性部分即為純化的融合蛋白.所得融合蛋白經SDS-PAGE測定(參考圖10)純度達95％。
實施例10 EPO，EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白生物活性的測定
1.用R&D EPO免疫試劑盒為工具，其中的標準品為標準，進行體外活性測量。對每一個樣品用統一的稀釋液稀釋。稀釋液含有細胞培養液，5％小牛血清，1％的β-Mercaptoethanol，和抗菌素(青霉素，鏈霉素及Fungizone)(其結果見表2)。
2.集落生成實驗，測定紅系爆式集落形成單位(burst forming unit-erythroid，BFU-E)的集落數目。利用低密度粘著于培養皿的骨髓細胞，對所有集落進行測定。低密度細胞在IMDM(Iscov’s Modified Dulbecco’s Media)培養液中(含有小牛血清)，37℃，培養1-2小時，按Ficoll-Hypague方法分離。對BFU-E的測定在1mLIMDM培養液中(含有0.8％甲基纖維素，20％小牛血清，0.05mM巰基乙醇，1IUrhEPO或者rhEPO二聚體融合蛋白)放置1×105細胞，培養十四天后，檢測其集落數目和形態，通過系列稀釋后與標準品對照。
表3的結果表明，培養14天后rhEPO二聚體及三聚體的BFU-E集落數顯著高于rhEPO單體，差異有統計學意義(P＜0.01)。上述結果表明rhEPO二聚體及三聚體的體外生物活性高于rhEPO單體。
3.表4中所示的體內活性測量由8-10周的小鼠被麻醉后，從眼眶抽血，測其血沉計數，然后按照小鼠體重，根據表1中所測表達蛋白的活性，以300IU/Kg體重給予一次皮下注射。每三只小鼠為一組，共四組(單體、二聚體、三聚體、對照組)，在第九天麻醉小鼠，重新從眼眶抽血，測其血沉，其結果如表4所示。
綜上所述，EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白的體內、體外生物活性比單體EPO顯著提高，說明本例中的EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白有增強的生物活性。
表2 體外活性測量
表3rhEPO二聚體蛋白的集落生成實驗結果

表4體內活性測量

權利要求
1.一種增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白，其特征在于該結構包括在兩單體中間由一個連接片段將兩個單體連接為二聚體融合蛋白，或在其三單體中間有兩個連接片段將三個單體連接為三聚體融合蛋白，并具有紅細胞生長因子的蛋白自然順序，二聚體融合蛋白具有如下所示的序列
EPO-L-EPO，
三聚體融合蛋白具有如下所示的序列
EPO-L-EPO-L-EPO。
2.按權利要求
1所述的增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白，其特征在于所述的在兩單體中間由一個連接片段，其連接片段是將一紅細胞生長因子的3′端與另一紅細胞生長因子的5′連接而成。
3.按權利要求
1所述的增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白，其特征在于所述的在三聚體中間由二個段連接片段而成。
4.按權利要求
3所述的增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白，其特征在于所述的在三單體中間有二段連接片段是第一個紅細胞生長因子的3′端通過連接片段與第二個紅細胞生長因子的5′端連接，再通過第二個連接片段把第二個紅細胞生長因子的3′端與第三個紅細胞生長因子5′端連接而成。
5.按權利要求
1-3中任意一項權利要求
所述的有增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子雙或多聚體融合蛋白，其特征在于所述的連接片段為連接肽，該連接肽是具有9-20個相同的或不相同的氨基酸連接順序。
6.按權利要求
5所述的增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白，其特征在于，所述的連接肽包括但不限于如下序列
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Ala-Ala；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala-Gly-Gly-Gly；
Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Glr-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Gly-Ser-Ser-Ala；
7.按權利要求
1所述的增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白，其特征在于所述的二聚體/三聚體紅細胞生長因子的質粒構建，在構建中使用設汁合成的引物寡聚脫氧核苷酸P1，P2，P3，P4，P5，P6，它們的核苷酸序列分別是
P15’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’；
P25’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’；
P35’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’；
P45’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCA
CCTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’；
P55’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGC
GGAGCCCCACCACGCCTCATC 3’；
P65’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’。
8.一種制備權利要求
1所述的有增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子二聚或多聚體融合蛋白，即EPO-EPO二聚體/EPO-EPO-EPO三聚體融合蛋白的方法，包括如下步驟
(1)獲得EPO-EPO及EPO-EPO-EPO的融合基因質粒，首先從細胞中提取信息核糖核酸mRNA，利用逆轉錄酶-DNA聚合酶鏈反應RT-PCR方法制備單鏈和雙鏈互補脫氧核糖核酸cDNA，經過分離純化，將EPO cDNA克隆到載體上，以此為基礎進行融合蛋白的構建；
(2)利用聚合酶鏈狀反應試驗，對EPO cDNA進行了亞克隆和末端改造，同時在蛋白之間增加了一小段連接片段；
(3)通過限制性內切酶，構建成了能夠表達EPO-EPO及EPO-EPO-EPO的融合蛋白質粒，并將其質粒轉化進入CHO(CHO-dhfr-)或COS7細胞株，轉化后的細胞株能分泌EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白；
(4)通過稀釋克隆方法，篩選出均一、高效表達二聚或多聚人紅細胞生長因子的工程細胞株；
(5)蛋白的提取工藝；收集細胞培養液，濃縮，過CM Sepharose FF柱，梯度洗脫，收集活性部分，過Sepharose分子篩層析柱，收集活性部分。
8、如權利要求
1所述的增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白，在用于治療腎性貧血的藥物中的應用。
9、如權利要求
1所述的增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白，在用于癌癥相關性貧血(CRA)、自身免疫性疾病伴發性貧血、骨髓增生異常綜合癥(MDS)、再生障礙性貧血(AA)、單純紅細胞再生障礙性貧血(PRCA)、慢性髓系白血病(CML)、特發性骨髓纖維化(IMF)、溶血性貧血、艾滋病引起的貧血和化療引起的貧血等疾病的治療、對于造血干細胞移植及用于擇期手術的自身輸血血液儲備的藥物中的應用。
專利摘要
本發明涉及一種增強生物活性的長效重組人紅細胞生長因子融合蛋白。該方法把兩個/三個相同的能表達紅細胞生長因子的基因通過一段/兩段連接多肽連起來，并構建入哺乳動物細胞表達質粒，將其轉入哺乳動物細胞后得到了表達。融合蛋白不僅具有紅細胞生長因子的生理活性，而且延長了蛋白在生物體內的儲留時間，進而增強其生物功效，延長體內半衰期，減少給藥次數，極大地提高了紅細胞刺激因子的臨床實用價值。
文檔編號C07K14/475GK1995064SQ200610167734
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月20日
發明者李洪興 申請人:李欣越導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan