專利名稱：:一種用于dna檢測的納米金信號探針及其制備方法和dna檢測的方法一種用于DNA檢測的納米金信號探針及其制備方法和DNA檢測的方法
技術領域：
：本發明涉及生物檢測
技術領域：
：，特別涉及一種用于DNA檢測的納米金信號探針及其制備方法和應用該納米金信號探針的DNA檢測的方法。
背景技術：
：DNA檢測在臨床診斷、單核苷酸多態性分析、DNA測序、法醫學鑒定、器官移植、環境分析、反恐等領域具有重要的意義。隨著人們對自身健康的曰益關注，迫切需要能對各種重大疾病進行早期診斷和治療，這就需要對致病基因進行高靈敏度的檢測。然而，由于發病早期體內致病基因的含量非常低，無法對其進行直接檢測，常常需要對待檢基因或信號進行放大。目前，常用的放大方法包括聚合酶鏈反應(M.C.Estes,J.S.Sevall,Mo/.CW/尸ra6"2003，17，59)、bio-bar-code放大(J.M.Nam,C.S.Thaxton,C.A.Mirkin，5Wewce2003,301,1884;J.M.Nam,S.I.Stoeva,C.A.Mirkin,/爿附.Ozem.Soc.2004，126，5932)和共軛高分子放大(LChen,D.W.McBranch，H.Wang,R.Helgeson，F.Wudl,D.G.Whitten,Ato.Jc^/.5W.t/.S.A1999,96,12287)等。然而，這些方法有的比較繁瑣，費時、昂貴，有的又存在選擇性和靈敏度較低的不足。因此，迫切需要發展新的簡便、經濟、無需標記并且選擇性和靈敏度較高的方法來滿足對微量樣品的檢測。納米技術的發展為生物分子的高靈敏度檢測提供了新的思路。以納米金、熒光量子點和磁性顆粒為典型代表的納米顆粒，已被廣泛應用于生物分子的固定，信號的放大以及待測物質的富集和濃縮。納米金顆粒因具有優異的光學性能，巨大的比表面積以及形狀與性能的可調控性，目前已陸續開發出了多種基于納米金的新型DNA檢測技術。4美國西北大學的Mirkin研究組(R.Elghanian,J.J.Storhoff,R.C.Mucic，R.L.Letsinger，C.A.Mirkin,5W^zce1997,277,1078)最先發展了一種納米金表面組裝DNA的方法。通常所用的納米金是通過檸檬酸鈉還原法制備的，表面包覆了一層負電荷的檸檬酸根離子。巰基修飾的DNA(SH-DNA)可與納米金形成強的Au-S共價鍵，使包覆在納米金表面的檸檬酸根離子被SH-DNA取代，從而將DNA牢固的組裝在納米金表面。由于納米金顆粒具有光學性質隨聚集狀態(顆粒間距)的不同而變化的特點，因此通過DNA之間的雜交，可以使納米金顆粒之間的距離發生改變，從而產生顏色的變化。基于此原理，他們實現了對單核苷酸多態性的檢測。目前，DNA修飾的納米金(DNA-AuNP)已經被廣泛研究和使用，如作為分子尺、基因和蛋白質檢測、DNA三螺旋的組裝、金屬離子檢測以及DNA連接分子的檢測等。由于每個納米金顆粒表面可以同時組裝多個DNA分子，這為信號放大提供了一個很好的思路。Mirkin等(J.M.Nam,C.S.Thaxton，C.A.Mirkin，5We"ce2003，301,1884)就發展了一種稱為"bio-bar-code"的放大方法。這種方法采用磁性顆粒來連接捕獲探針，可以從混合介質中特異性的捕獲到靶序列；采用DNA-AuNP納米顆粒作為信號探針，通過DNA之間的雜交形成三明治夾心結構，最后將納米金顆粒表面的DNA分離下來進行檢測，靶分子的量與分離下來的DNA的量直接相關，因此可以實現基因的檢測。這種方法非常靈敏，但是需要將DNA從納米金表面分離下來再進行檢測，增加了反應的步驟o
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種用于DNA檢測的納米金信號探針，應用其進行DNA檢測無需將DNA從納米金表面分離下來再進行檢測，步驟簡便，而且具有較好的靈敏度和選擇性。本發明要解決的第二個技術問題是提供一種所述的納米金信號探針的制備方法。酶催化底物反應具有專一性強、速度快、效率高的特點，常被用于DNA的放大檢測。在含有受檢物質和酶的標本中加入酶反應的底物后，底物被酶催化生成具有顏色或熒光的產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，所以可根據顏色深淺或熒光強弱進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應效果，從而使檢測方法達到很高的靈敏度。本發明人發現，酶或其它一些能自身反應生成具有顏色或光學性質的蛋白質可與納米金吸附結合，故本發明人將納米金的放大功能與酶促反應的放大功能有機結合起來，用以檢測DNA。結果本發明人驚奇地發現不僅無需將DNA從納米金表面分離下來再進行檢測，簡便了步驟，而且保持了較好的靈敏度和選擇性。因此，本發明解決上述第一個技術問題所采用的技術方案是一種用于DNA檢測的納米金信號探針，其為表面組裝有信號探針DNA的納米金顆粒，其中該納米金顆粒表面還同時組裝了可以產生顯色或熒光信號的蛋白質，所述的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質為能催化底物生成具有顏色或熒光信號的產物的酶，或具有自發光性能的熒光蛋白。由于一個金顆粒表面可以同時組裝多個DNA和蛋白質分子，因此本發明納米金信號探針可以作為一種放大試劑，通過催化劑催化的底物反應或自身反應起到信號放大的作用。根據本發明，優選的，所述的能催化底物生成具有顏色或光學性質的產物的酶，優選的可為辣根過氧化酶(HRP酶)、堿性磷酸酶、3—半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或熒光素酶；所述的自身具有顏色或光學性質的蛋白質，優選的可為綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋或藻紅熒光蛋白。這些可以產生顯色或熒光信號的蛋白質已為現有技術所公開(如文獻范春蕾、溫珍昌.藥物分析中常用的化學發光試劑及其應用進展.海南大學學報自然科學版，2006，24(1):66-73;ShaginD.A.，BarsovaE.V.,YanushevichY.G.,FradkovA.F.,LukyanovK.A.，LabasY.A.，UgaldeJ.A.,MeyerA.，NunesJ.M.，WidderE.A.,LukyanovS.A.andMatzM.Z.GFP-likeproteinsasubiquitousMetazoansuperfamily:evolutionoffunctionalfeaturesandstructuralcomplexity.Mol,Biol.Evol.2004,21(5):841-850.)。所述納米金信號探針上組裝的蛋白質所產生的顯色或熒光信號可以用常規的檢測方法，如采用顯色法或電化學方法等檢測方法進行定量檢測，從而對待檢測的靶物質含量進行測定。根據本發明，所述的納米金顆粒可以按照現有技術，如上述Mirkin等公開的方法制備。優選的，所述的納米金顆粒的粒徑可以是1020nm。當本發明所述的納米金顆粒表面組裝的是能催化底物生成具有顏色或光學性質的產物的酶時，本發明納米信號探針可簡稱為納米酶。本發明優選辣根過氧化酶為例來說明。本發明采用下列技術方案來解決上述第二個技術問題一種如上所述的納米金信號探針的制備方法，可以包括下列步驟.-1)將所述的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質加入到納米金溶液中，調節pH，振蕩溫育，然后離心濃縮；2)加入巰基修飾的信號探針DNA溶液，室溫溫育組裝；3)加入封閉液封閉金顆粒表面的空余的結合位點，然后將此混合物離心、用洗滌液洗滌。優選的，步驟l)所述的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質可以是酶，如辣根過氧化酶，加入的摩爾量可以是納米金的12502500倍。酶的加入是過量的，但過量太多了不僅造成試劑的浪費，也會降低組裝的效率，故通常不超過2500倍，而更優選1250倍。優選的，步驟l)所述的pH可為7-9，pH9最佳。溫育時較佳的可在37"C振蕩(350rpm)30分鐘。納米金具有很好的生物相容性，可以吸附蛋白質，辣根過氧化酶是一種蛋白質。辣根過氧化酶與納米金的連接是通過吸附作用實現的。同常規，步驟l)所述的納米金溶液的制備可以采用檸檬酸三鈉還原法制備。根據本發明，步驟2)中作為信號探針的DNA序列與納米金的連接同現有的方法。其中的信號探針DNA序列修飾有巰基，與納米金通過金硫鍵連接。通常將信號探針DNA加入納米金溶液，室溫反應16小時左右，然后逐次加入lMPBS至NaCl終濃度為0.1M，靜置過夜。優選的，步驟2)所述的加入的巰基修飾的信號探針摩爾數可為納米金的100-500倍，300倍最佳。優選的，步驟3)中所述的封閉液可為10mMPB,100mMNaCl,1.5w/v%PEG,lw/v%BSA，pH7.4的PBS緩沖溶液，所述的洗滌液為10mMPB，O.lMNaCl，pH7.4的PBS緩沖溶液。其中，封閉液還可以含有其它常規使用的封閉劑如酪蛋白等，封閉的反應時間0.5-1小時，優選30分鐘。優選的，步驟1)或步驟3)中所述的離心條件可為13,000rpm，30min，4°C。如果納米金信號探針不馬上使用，則可用等體積的儲備液重新懸浮，4°C儲存備用。所說的儲備液優選含有10mMPB，O.lMNaCl,lw/v%BSA，0.01w/v%硫柳滎，pH7.4的PBS。本發明還在上述基礎上設計了一種固相載體輔助的納米金信號探針信號放大的方法，實現對DNA高靈敏度和高選擇性的檢測。因此，本發明還提供一種DNA的檢測方法，可包括以下步驟1)通過固定于磁性顆粒上的捕獲探針將靶向DNA連接在固相載體表面；2)加入上述本發明的納米金信號探針，通過DNA之間的雜交形成固相載體一耙向DNA—納米金信號探針的三明治復合物；3)然后使該納米金信號探針上的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質催化底物生成具有一定顏色或熒光的產物并進行顯色或熒光測定，或直接測定熒光蛋白自身的熒光信號。根據本發明，步驟l)可以采用現有技術，如
背景技術：
中的文獻以及本申請人公開號為CN1808101A的申請文件所公開的方法來實現。通常采用商業化的修飾有鏈親和素的磁珠(MMPs)和修飾有生物素的捕獲探針，通過生物素與鏈親和素之間的特異性反應，將生物素修飾的捕獲探針連接在固相載體表面；然后通過捕獲探針與靶向DNA的雜交反應將靶向DNA捕獲于固相載體上；當固相載體為磁性顆粒時，易于靶向DNA的快速富集和分離。而步驟2)中為使納米金顆粒表面的巰基修飾的信號探針盡量保持豎立起來的狀態，而不是倒伏在金顆粒表面，以利于與靶向DNA的結合，同常規，選用間隔DNA分子(spacerDNA)來占據納米金顆粒表面的空余位點。因為封閉劑如BSA和酶如HRP分子較大，而巰基DNA之間又可能會產生空間位阻，所以用另一條較短的巰基修飾的DNA作為Spacer,其序列同現有技術，通常為10個T或A，相應地在信號探針巰基端也設計連續的相同堿基以產生空間位阻而使信號探針豎立，同時提高與靶的雜交效率。本發明以SH—TIO為例來說明。較佳地，步驟2)中通常選用含有信號探針和SpacerDNA的工作液，其中信號探針和SpacerDNA的摩爾比例較好的可為1:2。該工作液的最佳配方是750mMNaCl，75mM檸檬酸鈉，pH7.4，0.5%(w/v)BSA，1pMspacerDNA，1.5nM納米金信號探針(以納米金的濃度來計，為1.5nM)。較佳地，捕獲探針與靶向DNA，以及靶向DNA與信號探針之間的雜交溫度控制在2542。C之間，更佳的是37'C左右。優選的，步驟3)所述的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質可以是辣根過氧化酶，可以加入10^八[3-(4-羥基苯丙酸)]和H202的熒光底物進行反應，相應地采用熒光法進行檢測。根據本發明，可以通過底物的選擇采用不同的檢測方法，例如，采用TMB或ABTS時可以采用顯色法；采用TMB時，也可以采用電化學方法。顯然，所述的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質可以是能催化底物生成具有顏色或熒光信號的產物的其它酶，如堿性磷酸酶、P—半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或熒光素酶；也可以是自身具有顏色或光學性質的蛋白質，如綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白或藻紅熒光蛋白等。反應生成的具有顏色或熒光信號的物質的量與標本中受檢DNA的量直接相關，所以可根據顏色深淺或熒光強弱進行定性或定量分析，除熒光方法外，還可以用比色法、紫外一可見光譜法等。相對于現有技術，本發明設計的納米金信號探針信號放大的DNA檢測方法，實現了對DNA的高靈敏度檢測。與PCR放大方法相比，這種基于納米金信號探針的方法無需對靶進行PCR擴增，即可實現信號的倍增；與Mirkin的bio-bar-code方法相比，這種方法又具有無需對DNA進行分離即可實現更靈敏檢測的優點。本發明中所提供的納米金信號探針制備簡單，成本低廉，而且可以通過底物的選擇采用不同的檢測方法，使用很方便。本發明可以顯著提高DNA及DNA突變檢測，特別是基因如乳腺癌易感基因BRCA1及其突變基因檢測的選擇性和靈敏度，在生物檢測、疾病的早期診斷和治療中有著重要的意義。下面結合附圖對本發明做進一步說明。圖1為本發明基于磁性顆粒和納米酶的DNA檢測方法的工作原理圖。圖2為反應溫度分別為25°C、37'C和42'C時本發明對不同濃度的靶基因進行檢測的結果。圖3為對本發明檢測方法的特異性進行研究的結果；其中a為靶濃度為0;b為非同源靶(濃度為250nM)，c為靶基因(濃度為250pM)。圖4為對本發明檢測方法的靈敏度進行分析的結果；其中A為濃度025000pM耙序列產生的熒光信號，B為熒光信號隨靶濃度的變化趨勢圖。具體實施方式下面用實施例來進一步說明本發明的工作流程及功效，但本發明并不僅限于此。以下是部分本發明實施例中所用的儀器和設備，其他未具體注明的實驗條件按照常規或以其制造廠商所建議的條件。熒光檢測所用儀器為熒光分光光度計(HitachiF-4500,日本)。熒光光譜測量條件氙燈激發，激發和發射狹峰寬度均為2.5nm，電壓PMT950V，響應時間2S。激發波長為320nm，發射波長掃描范圍330—600nm。用3mL石英比色皿進行測量，樣品體積lmL，室溫。鏈親和素修飾的超順磁性顆粒(magneticmicro-particles,MMPs)購于Promega公司，顆粒直徑為1.0pm左右，固含量為1mg/mL，結合能力為1.25nmol探針/mgMMPs。納米金采用檸檬酸三鈉還原法制得(如Grabar,K.C.;Freeman,R.G.;Hommer,M.B.;Natan,M.J.爿"a/.CTze附.1995,67,735-743)。取濃度為0.1%的氯金酸溶液100mL，在帶有回流裝置的圓底燒瓶中加熱至沸騰，然后向其中迅速加入3.5mL濃度為1%的擰檬酸三鈉溶液，劇烈攪拌并加熱15分鐘。然后停止加熱，繼續攪拌20分鐘，冷卻至室溫，用0.2pm的硝酸纖維素膜過濾，4'C冷藏備用。根據此方法，即可制備濃度為2.3nM，粒徑為15nm左右的納米金溶膠。各種DNA序列如表1所示，均購自上海生物工程技術有限公司。其中，DNA3為特異性的靶序列，為乳腺癌易感基因BRCA1。表l寡聚核苷酸堿基組成表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例所用各種溶液成分如表2所示，其中的納米酶工作液中所用的納米酶是由實施例1制備的納米酶1。_表2溶液成分表_溶液名稱_溶液組成_0.5xSSC75mMNaCl，7.5mM擰檬酸鈉，pH7.4TTL100mMTris-HCl，0.1%(v/v)Tween20，1MLiCl，pH8.0TTA250mMTris-HCl，0.1%(v/v)Tween20，5%(w/v)BSA，pH7.4雜交液750mMNaCl，75mM擰檬酸鈉，pH7.4封閉液10mMPB,100mMNaCl，1.5%(w/v)PEG，1%(w/v)BSA，pH7.4納米酶儲備液10mMPB，O.lMNaCl，l%(w/v)BSA，0.01(w/v)%硫柳汞，pH7.437pL雜交液，2,5jxLof10%(w/v)BSA,0.773一spacerDNA，6納米酶工作液以納米金計濃度為10nM的納米酶熒光底物反應液0.1MTris-HCl，0.05%(w/v)HPPA，0.0075%(v/v)H202，pH8.51MPBS100mMPB，1MNaCl，pH7.40.1MPBS_lOmMPB，O.lMNaCl,pH7.4_實施例l納米酶的制備納米酶1制備的方法為將100濃度為1%(w/v)HRP(購自Sigma公司)溶液加入到5mL納米金溶液中(HRP:納米金摩爾比為1250:1)，用NaOH溶液調節pH為9.0。然后37。C溫育30分鐘，溫育的同時輕輕振蕩(350rpm)。然后用離心法(13,000rpm，30min，4°C)濃縮到1mL(納米金濃度約為10nM)。然后加入巰基修飾的DNA2溶液(終濃度1.5pM,巰基修飾的信號探針摩爾數為納米金的300倍)，室溫溫育16小時。然后逐次加入一定量1MPBS至NaCl終濃度為0.1M，室溫靜置過夜。之后再加入100濃度為10%(w/v)BSA溶液封閉金顆粒表面的空余位點，室溫封閉30分鐘。然后將此混合物離心、洗滌，以去除游離的DNA，HRP和BSA，洗滌液為0.1MPBS。重復三次，最后用等體積的納米酶儲備液重新懸浮，然后用其配置納米酶工作液。納米酶2制備的方法為將200pL濃度為1%(w/v)HRP溶液加入到5mL納米金溶液中(HRP:納米金摩爾比為2500:1)，用NaOH溶液調節pH為7.0。然后37"C溫育30分鐘，溫育的同時輕輕振蕩(350rpm)。然后用離心法(13,000rpm，30min，4°C)濃縮到1mL。然后加入巰基修飾的DNA2溶液(終濃度0.5^M，巰基修飾的信號探針摩爾數為納米金的IOO倍)，室溫溫育16小時。然后逐次加入一定量1MPBS至NaCl終濃度為0.1M，室溫靜置過夜。之后再加入100濃度為10%(w/v)BSA溶液封閉金顆粒表面的空余位點，室溫封閉60分鐘。然后將此混合物離心、洗滌，以去除游離的DNA，HRP和BSA，洗滌液為0.1MPBS。重復三次，最后用等體積的納米酶儲備液重新懸浮，4TM諸存備用。納米酶3制備的方法為將100pL濃度為1%(w/v)HRP溶液加入到5mL納米金溶液中(HRP:納米金摩爾比為1250:1)，用NaOH溶液調節pH為9.0。然后37"C溫育30分鐘，溫育的同時輕輕振蕩G50rpm)。然后用離心法(13,000rpm，30min，4°C)濃縮到1mL。然后加入巰基修飾的DNA2溶液(終濃度2.5^M，巰基修飾的信號探針摩爾數為納米金的500倍)，室溫溫育16小時。然后逐次加入一定量lMPBS至NaCl終濃度為0.1M，室溫靜置過夜。之后再加入100濃度為10%(w/v)BSA溶液封閉金顆粒表面的空余位點，室溫封閉30分鐘。然后將此混合物離心、洗滌，以去除游離的DNA，HRP和BSA，洗滌液為0.1MPBS。重復三次，最后用等體積的納米酶儲備液重新懸浮，4'C儲存備用。以上制備的三種納米酶，通過實驗過程中觀察納米酶的顏色、離心時的沉淀速度、聚集狀態、穩定性等因素評價納米酶的優劣。納米金的顏色為酒紅色，若制備的納米酶與納米金相比顏色基本不變，也為酒紅色，說明制備的納米酶較好，穩定性和分散性都較好。若納米酶的顏色有偏紫甚至偏蘭的傾向，則表明納米酶的穩定性很差，容易發生聚集，基本不能使用。本實施例考察納米酶制備的適用條件和優選條件。結果表明，制備的納米酶l性能最好，顏色與納米金的顏色完全一致，仍然為酒紅色，可于4°。冰箱保存3周以上仍無明顯變化。納米酶2和3性能稍差，新鮮制備的樣品顏色為酒紅色，性能較好，但是4。C放置2周以上就出現極少量聚集、肉眼可見紫色的顆粒，不宜再使用。實施例2本發明反應溫度對靶基因檢測的影響按產品說明書要求，MMPs在使用前首先用0.5xSSC緩沖液洗滌3次，然后將biotin(生物素)標記的捕獲探針DNA1加入到含有TTL緩沖液的MMPs中，輕輕混合約10分鐘。捕獲探針的表面密度約為46x1011鏈/cm2。然后將MMPs和捕獲探針的復合物(MMPs-captureprobe，記為MMPs-cp)用TTA緩沖液洗兩次，懸浮于雜交液中，4'C冷藏備用。將50MMPs-cp加入到1.5mL離心管中，磁性分離棄上清，然后加入lmL雜交緩沖液，同時加入濃度025nM之間的特異性靶向DNA3，分別在25°C，37'C和42'C的溫度下，800rpm，反應1小時。然后加入50納米酶工作液，37"C再反應1小時。最后，磁性分離去除游離納米酶，接著用雜交液洗2—3次。然后加入底物反應液，室溫反應30分鐘，磁性分離收集上清，進行熒光測定。其工作原理如圖l所示。本實施例考察反應溫度對耙基因檢測的影響，結果見圖2。結果表明，反應溫度較高(42°C)時，有利于低濃度靶DNA的雜交，但是不利于較高濃度耙DNA的雜交，這可能是因為在高濃度靶DNA體系中，部分三明治結構(磁性顆粒一靶一納米酶的復合物)發生了解鏈的緣故。反應溫度較低(25°C)時，又會大大降低低濃度靶DNA的雜交效率。相比之下，反應溫度為37'C時，完全能滿足對各種濃度靶DNA進行檢測的需要。實施例3本發明對DNA檢測的特異性參照實施例2中的條件進行實驗，反應溫度為37°C，分析本發明檢測方法對DNA檢測的特異性。分別對濃度為250pM的特異性靶向序列DNA3和濃度為250nM的非同源序列DNA4進行了檢測。結果如圖3所示。可以看出，即使是濃度高達1000倍的非同源序列，也可以與特異性靶顯著區分，表明該方法具有較高的特異性。實施例4本發明DNA的檢測靈敏度參照實施例2中的條件進行反應，分別對濃度為025000pM的靶向序列DNA3進行檢測。本實施例分析該檢測方法的靈敏度，結果如圖4所示。由圖可知，采用這種磁性顆粒輔助的納米酶放大的熒光檢測方法，可靈敏檢測2.5pM~25nM范圍內的靶基因，在該范圍內，熒光信號與靶濃度的關系符合Sigmoid曲線。與本發明人曾經報道的基于共軛高分子的放大方法相比(H.Xu，H.Wu,F.Huang,S.Song，W.Li,Y.CaoC.Fan,iVwc/.」c/dsW&s.2004，33,e83)，靈敏度提高了近三個數量級。與Mirkin等報道的基于納米金的bio-bar-code放大方法相比，具有無需對信號進行分離即可實現檢測的優點。權利要求1、一種用于DNA檢測的納米金信號探針，其為表面組裝有信號探針DNA的納米金顆粒，其特征是該納米金顆粒表面還同時組裝了可以產生顯色或熒光信號的蛋白質，所述的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質為能催化底物生成具有顏色或熒光信號的產物的酶，或具有自發光性能的熒光蛋白。2、根據權利要求1所述的納米金信號探針，其特征是所述的能催化底物生成具有顏色或熒光信號的產物的酶是辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、P—半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或熒光素酶；所述的具有自發光性能的熒光蛋白是綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋或藻紅熒光蛋白。3、根據權利要求1所述的納米金信號探針，其特征是所述的納米金顆粒的粒徑是1020nrn。4、一種如權利要求13任一項所述的納米金信號探針的制備方法，其特征是其包括下列步驟1)將可以產生顯色或熒光信號的蛋白質溶液加入到納米金溶液中，調節pH，振蕩溫育，然后離心濃縮；2)加入巰基修飾的信號探針DNA溶液，室溫溫育組裝；3)加入封閉液封閉金顆粒表面的空余的結合位點，然后將此混合物離心、用洗滌液洗滌。5、根據權利要求4所述的制備方法，其特征是步驟l)中所述的加入的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質的摩爾量是納米金的1250~2500倍，所述的pH為79;步驟2)中所述的加入的巰基修飾的信號探針摩爾數為納米金的100~500倍。6、根據權利要求5所述的制備方法，其特征是步驟l)中所述的加入的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質的摩爾量是納米金的1250倍，所述的pH為9;步驟2)中所述的加入的巰基修飾的信號探針摩爾數為納米金的300倍。7、根據權利要求4所述的制備方法，其特征是步驟3)中所述的封閉液為10mMPB，100mMNaCl，1.5w/v%PEG，lw/v%BSA，pH7.4的PBS緩沖溶液；所述的洗滌液為10mMPB，O.lMNaCl，pH7.4的PBS緩沖溶液；步驟l)或步驟3)所述的離心條件均為13,000rpm，30min，4°C。8、根據權利要求4所述的制備方法，其特征是步驟3)洗滌后的納米金信號探針用等體積的儲備液重新懸浮，4'C儲存備用，所說的儲備液為含有10mMPB，O.lMNaCl,lw/v%BSA，0.01w/v。/。硫柳汞，pH7.4的PBS。9、一種DNA的檢測方法，其特征是其包括以下步驟1)通過固定于磁性顆粒上的捕獲探針將靶向DNA連接在固相載體表面；2)加入權利要求1~3任一項所述的納米金信號探針，通過DNA之間的雜交形成固相載體一靶向DNA—納米金信號探針的三明治復合物；3)然后使該納米金信號探針上的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質催化底物生成具有一定顏色或熒光的產物并進行顯色或熒光測定，或直接測定熒光蛋白自身的熒光信號。10、根據權利要求9所述的檢測方法，其特征是步驟2)所述納米金信號探針的溶液中包含間隔DNA分子；步驟3)中所述的可以產生顯色或熒光信號的蛋白質為辣根過氧化酶時，加入其熒光底物3-(4-羥基苯丙酸)和&02進行反應，采用熒光法進行檢測。專利摘要本發明公開了一種用于DNA檢測的納米金信號探針及其制備方法和DNA檢測的方法，該納米金信號探針為表面同時組裝了可以產生顯色或熒光信號的蛋白質以及巰基修飾的信號探針DNA的納米金顆粒溶液。在DNA的檢測中利用固相載體，通過DNA的雜交形成固相載體-靶DNA-納米金信號探針的三明治復合物。由于一個納米金顆粒表面可以連接多個可以產生顯色或熒光信號的蛋白質，一個可以產生顯色或熒光信號的蛋白質特別是酶催化劑又可以催化多個底物發生化學反應，從而可以放大反應信號，因此可以顯著提高檢測的靈敏度。故本發明在生物檢測、疾病的早期診斷和治療中有著重要的意義。文檔編號C12Q1/66GKCN101245387SQ200810032870公開日2008年8月20日申請日期2008年1月22日發明者劉興奮,宋世平,樊春海,王麗華申請人:中國科學院上海應用物理研究所導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan