專利名稱：：抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法
技術領域：
：本發明涉及的是一種農業
技術領域：
的鑒定方法，具體是一種抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法。技術背景黃瓜白粉病(PM，powderymildew)是由專性活體寄生的白粉菌引起，在溫室和大田都普遍發生的葉部病害；病原白粉菌主要包括瓜單囊殼(Podo印haeraxanthii)禾口二抱白粉菌(Golovinomycescichoracearum)兩禾中；中國以瓜單囊殼(P.xanthii)危害較為普遍。白粉病病原寄主廣泛，成熟孢子可隨空氣氣流傳播；干燥、涼爽季節易發生，白粉病菌可以感染黃瓜植株葉片、莖和花。根據報道，在開花期感染白粉病可減少產量2040%。噴灑殺菌劑和種植抗病品種是防御此病的主要方法。但長期使用殺菌劑會危害環境安全，且易引起病菌小種變異產生拮抗作用。推廣種植抗病品種是安全、環保和高效的控制策略。經對現有技術文獻的檢索發現，劉秀波等在《中國瓜菜》2006年第1期第10頁到13頁上發表的"南瓜白粉病病原菌鑒定及抗性鑒定方法研究"，該文中提出白粉病的孢子懸浮液噴霧接種方法，其不足在于由于黃瓜白粉病發生危害大，特別影響黃瓜果實種子的正常成熟，懸浮液噴霧接種方法只能采用鑒定第二代的抗性來推測當代材料的抗性，這不僅延緩了抗病育種的工作進程，而且加大了抗病品種選育的工作量；同時有些遺傳材料數量很少，科研有時間需要多個病菌小種對遺傳材料同時鑒定，懸浮液噴霧接種方法不能完成這樣的鑒定要求。檢索中還發現，
專利名稱：為"鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列及其鑒定方法"，公開號CN1482132。該專利技術公開了一種鑒定黃瓜白粉病抗性的引物序列及其鑒定方法，引物序列由上游引物5'-CAGTAAATGAAAGAAAAGAAG-3'，下游引物5'-ATACATAGCCATACAAAAAT_3'組成，使用該引物序列的鑒定黃瓜白粉病抗性的方法，包括如下步驟(l)提取黃瓜基因組的DNA;(2)進行PCR擴增；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析；(4)依據各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜白粉病的抗性。但是該專利技術是需要應用分子標記數據開展黃瓜種質白粉病抗病性鑒定，一般生產單位很難滿足采集分子標記數據的實驗要求，且鑒定結果與田間抗病吻合率還不高。
發明內容本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法。本發明是根據葫蘆科植物葉片大的特點在可控條件下進行抗性鑒定，并根據葉片離體葉盤的抗性表現，對整個植株的抗性進行鑒定，較原有的鑒定方法具有更適用于黃瓜白粉病抗性品種的選育工作，鑒定結果的精確性和準確性更高，拓寬了進行抗性鑒定的時間，并可以同時在一個品種材料上同時鑒定多個白粉病生理小種，更適于遺傳學的研究的特點。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括如下步驟第一步，用不銹鋼打孔器在黃瓜幼苗或成株采集取葉盤，對葉盤進行消毒；所述不銹鋼打孔器，其直徑為2cm。所述對葉盤進行消毒，具體為蒸餾水漂洗3s，2%次氯酸鈉溶液漂洗5s，75%酒精溶液漂洗5s，蒸餾水漂洗10s。第二步，采用噴霧接種法對葉盤進行接種；所述采用噴霧接種法對葉盤進行接種，是指使用壓力0.05MP/mm(兆帕/平方毫米)的壓力器，以及孢子懸浮液濃度為5-7X104孢子/毫升，接種過程在無菌操作臺上完成。第三步，接種后，將葉盤放置于放有兩層濾紙的培養皿內；所述濾紙用0.01%頭孢(質量比)溶液浸濕。第四步，將培養皿放置在光照培養箱內，每間隔4天，滴加無菌水保持濾紙濕潤。第12天開始調査葉盤發病情況，根據葉盤測量的平均發病面積做出抗病性鑒定。所述的將培養皿放置在光照培養箱內，是指將培養皿放置在溫度23'C的，光照為50u鵬l/s/m2的光照培養箱內12天。所述根據葉盤測量的平均發病面積做出抗病性鑒定，是指借助40倍解剖鏡為輔助觀察工具，按照葉盤發病面積10%為梯度，0:未發病，100%:葉盤上布滿白粉病菌絲。為遺傳分析方便，設定發病面積小于20%為抗病，大于20%為感病。一個品種可以取多個葉盤，葉盤測量的平均發病面積對應的病情梯度為該品種的病情梯度，并依此做出抗病性鑒定。本發明提供了一種黃瓜白粉病葉盤鑒定法，該方法較孢子懸浮液噴霧接種方法具有以下優點(1)更適用于黃瓜白粉病抗性品種的選育工作。由于采用了葉盤鑒定，葉盤直徑僅2cm，對植株損傷性小，植株可以繼續生長，滿足其它實驗和生產目的需要。可以當代選擇，大大加快了品種選育的進程，也減少了育種的工作量。(2)由于取葉盤進行鑒定，可以在每個單株上取多個葉盤進行重復鑒定，利用平均值作為鑒定結果與懸浮液噴霧接種的單株接種鑒定結果相比，鑒定數據統計學意義更準確。(3)可以同時在同一植株葉片上取多個葉盤，用于多個病原小種的鑒定；這對于懸浮液噴霧接種方法接種鑒定是無法實現的。(4)對同一材料在一個生長季節中可以多次分離葉盤進行抗性鑒定，較懸浮液噴霧接種的一次性鑒定增加了鑒定的次數；鑒定的時間可以保證在一年中的任何時間進行，從而拓寬了抗性鑒定的時間。(5)更適合遺傳學的研究。遺傳學需要充分利用遺傳群體中抗病材料和感病材料間存在的差異，而進行抗性鑒定的感病單株往往容易產生死苗，既無法收獲果實，也不利于采集葉片進行核酸分析，而本方法則可以很好的解決這些問題。具體實施方式下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1、申綠2號和長春密刺的接種鑒定黃瓜白粉病抗性品種申綠2號為商業黃瓜品種，購買于上海市種子公司。黃瓜白粉病感病品種長春密刺，也為商業黃瓜品種購買于上海市種子公司。抗性鑒定方法如下一、接種黃瓜材料的準備將供試黃瓜品種單獨播種于溫室穴盤中(d=12cm，基質成分為1份泥炭+1份煤渣+2份蛭石)。當幼苗長至2葉一心時(約播種后20d)，在每株第一片真葉取葉盤l-2個，進行室內無菌葉盤鑒定。7天后對取走葉盤的植株，人工噴霧接種病菌孢子懸液。二、接種鑒定葉盤接種使用直徑為2cm的不銹鋼打孔器在黃瓜幼苗或成株采集取葉盤(直徑二2cm)，對葉盤進行如下消毒過程，蒸餾水漂洗3s，2"/。次氯酸鈉溶液漂洗5s，75。/。酒精溶液漂洗5s，蒸熘水漂洗10s。使用接種方法為噴霧接種法，利用壓力0.05MP/腿(兆帕/平方毫米)的壓力器，使用菌液濃度為5-7乂104孢子/毫升；過程在無菌操作臺上完成。接種后，將葉盤放置于放有兩層濾紙的培養皿內，濾紙用0.01%頭孢溶液浸濕。培養皿放置在溫度23。C的，光照為50umol/s/m2的光照培養箱內12天，每間隔4天，滴加10ml無菌水保持濾紙濕潤。第12天開始調査葉盤發病情況，借助40倍解剖鏡為輔助觀察工具，按照葉盤發病面積10%為梯度，0:未發病，100%:葉盤上布滿白粉病菌絲。幼苗人工接種采用孢子懸浮液噴霧接種法，孢子懸浮液濃度為5-7X104孢子/毫升；溫室中白天溫度22-28。C，夜晚溫度15-18。C，日照時間17h左右，接種后24h內，用加濕器噴霧保持相對濕度在70%左右。接種12d后開始調査發病情況，病情統計方法參照(MorishitaM，JapanAgriculturalResearchQuarterly(日本農業研究季刊)，2003，37(1):714)。四、幼苗人工接種鑒定和葉盤接種鑒定結果的比較試驗結果表明對黃瓜白粉病有不同抗感反應的黃瓜品種在苗期鑒定和葉盤鑒定時抗性表現基本一致，表明該項方法可用于鑒定品種的黃瓜白粉病抗性。結果如表l所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2、申綠2號和長春密刺F2遺傳群體白粉病抗性遺傳分析黃瓜白粉病抗性品種申綠2號為商業黃瓜品種，購買于上海市種子公司。黃瓜白粉病感病品種長春密刺，也為商業黃瓜品種購買于上海市種子公司。用申綠2號作母本和長春密刺作父本雜交，構建遺傳F2群體，包括108個單株。接種鑒定方法如下一、接種黃瓜材料的準備將供試申綠2號和長春密刺組配的遺傳F2群體播種于溫室穴盤中(d=12cm，基質成分為1份泥炭+1份煤渣+2份蛭石)。當幼苗長至2葉一心時(約播種后20d)，在每株第一片真葉取葉盤l-2個，進行室內無菌葉盤鑒定。7天后對取走葉盤的植株，人工噴霧接種病菌孢子懸液。二、接種鑒定葉盤接種使用直徑為2cm的不銹鋼打孔器在黃瓜幼苗采集取葉盤(直徑=2crii)，對葉盤進行如下消毒過程，蒸餾水漂洗3s，2%次氯酸鈉溶液漂洗53，75%酒精溶液漂洗5s，蒸餾水漂洗10s。使用接種方法為噴霧接種法，利用壓力0.05MP/mm(兆帕/平方毫米)的壓力器，使用菌液濃度為5-7X104孢子/毫升；過程在無菌操作臺上完成。接種后，將葉盤放置于放有兩層濾紙的培養皿內，濾紙用O.01%頭孢溶液浸濕。培養皿放置在溫度23。C的，光照為50umol/s/m2的光照培養箱內12天，每間隔4天，滴加10ml無菌水保持濾紙濕潤。第12天開始調査葉盤發病情況，借助40倍解剖鏡為輔助觀察工具，按照葉盤發病面積10%為梯度，0:未發病，100%:葉盤上布滿白粉病菌絲。設定發病面積小于20%為抗病，大于20%為感病。統計申綠2號和長春密剌遺傳F2群體單株白粉病抗性。幼苗人工接種采用孢子懸浮液噴霧接種法，孢子懸浮液濃度為5-7X104孢子/毫升；溫室中白天溫度22-28'C，夜晚溫度15-18'C，日照時間17h左右，接種后24h內，用加濕器噴霧保持相對濕度在70%左右。接種12d后開始調查申綠2號和長春密刺遺傳F2群體單株發病情況，病情統計方法參照(MorishitaM，JapanAgriculturalResearchQuarterly(日本農業研究季刊)，2003，37(1):714)。四、幼苗人工接種鑒定和葉盤接種鑒定申綠2號和長春密刺遺傳F2群體結果的比較試驗結果表明對申綠2號和長春密刺遺傳F2群體在應用葉盤鑒定和苗期鑒定和抗性遺傳規律表現完全一致，申綠2號和長春密刺遺傳F2群體表現白粉病抗性由隱性單基因控制，其抗感分離比例為l:3。結果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求1、一種抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟第一步，用不銹鋼打孔器在黃瓜幼苗或成株采集取葉盤，對葉盤進行消毒；第二步，采用噴霧接種法對葉盤進行接種；第三步，接種后，將葉盤放置于放有兩層濾紙的培養皿內；第四步，將培養皿放置在光照培養箱內，間隔滴加無菌水保持濾紙濕潤，第12天開始調查葉盤發病情況，根據葉盤測量的平均發病面積做出抗病性鑒定。2、根據權利要求l所述的抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法，其特征是，第一步中，所述不銹鋼打孔器，其直徑為2cm。3、根據權利要求1或2所述的抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法，其特征是，第一步中，所述對葉盤進行消毒，具體為蒸餾水漂洗3s，2%次氯酸鈉溶液漂洗5s，75y。酒精溶液漂洗5s，蒸餾水漂洗10s。4、根據權利要求1所述的抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法，其特征是，第二步中，所述采用噴霧接種法對葉盤進行接種，是指使用壓力0.05MP/mm的壓力器，以及孢子懸浮液濃度為5-7乂104孢子/毫升，接種在無菌操作臺上完成。5、根據權利要求l所述的抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法，其特征是，第三步中，所述濾紙用質量百分比為0.01%的頭孢溶液浸濕。6、根據權利要求l所述的抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法，其特征是，第四步中，所述的將培養皿放置在光照培養箱內，是指將培養皿放置在溫度23°C的，光照為50mnol/s/m2的光照培養箱內12天。7、根據權利要求1或6所述的抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法，其特征是，第四步中，所述間隔，是指每間隔4天。8、根據權利要求1或6所述的抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法，其特征是，第四步中，所述根據葉盤測量的平均發病面積做出抗病性鑒定，是指借助40倍解剖鏡為輔助觀察工具，按照葉盤發病面積10%為梯度，0:未發病，100%:葉盤上布滿白粉病菌絲，設定發病面積小于20%為抗病，大于20%為感病，一個品種可取多個葉盤，葉盤測量的平均發病面積對應的病情梯度為該品種的病情梯度，并依此做出抗病性鑒定。全文摘要本發明公開了一種農業
技術領域：
的抗白粉病黃瓜品種的鑒定方法。步驟為第一步，使用不銹鋼打孔器在黃瓜幼苗或成株采集取葉盤，對葉盤進行消毒；第二步，采用噴霧接種法對葉盤進行接種；第三步，接種后，將葉盤放置于放有兩層濾紙的培養皿內；第四步，將培養皿放置在光照培養箱內，間隔滴加無菌水保持濾紙濕潤，第12天開始調查葉盤發病情況，根據葉盤測量的平均發病面積做出抗病性鑒定。本發明鑒定結果的精確性和準確性更高，拓寬了進行抗性鑒定的時間，并可以同時在一個品種材料上同時鑒定多個白粉病生理小種，更適于遺傳學的研究的特點。文檔編號G01N33/48GK101236196SQ20081003399公開日2008年8月6日申請日期2008年2月28日優先權日2008年2月28日發明者何歡樂,劉龍洲,馳張,潘俊松,潤蔡申請人:上海交通大學