專利名稱:一種細胞因子的組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞因子的組合物。本發明還涉及該細胞因子組合物的醫藥用途。
技術背景
胚胎干細胞是一類具有自我更新和多向分化能力的細胞，主要來自囊胚期的內細胞 團。目前，已經建立了多株人類以及哺乳動物的胚胎干細胞系，并且公眾可以獲得這些 干細胞系，例如美國政府資助在威斯康辛大學建立了國家級的干細胞庫，儲存有NIH注 冊的21株人胚胎干細胞，可以為科研工作者和非盈利性機構提供良好的人胚胎干細胞 系(http:〃www.wicell.org/index,php option-com oscommerce&Itemid-130) c 而胚月臺干 細胞的常規培養也具有一套公知的操作流程，在許多知名的干細胞中心如威斯康辛干細 胞庫的網站上都有相應的操作手冊對外提供 (http:〃www.wicell.org/index.php option=com content&task=section&id=9&Itemid=200)。
研究發現胚胎干細胞在生長過程中能產生許多豐富的細胞生長因子，包括血小板源 性生長因子(PDGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖 維細胞生長因子(bFGF)等，這些細胞因子參與了創傷愈合的過程。有關生長因子在創 傷修復過程中的模式有人提出幾點設想[1]':①蛋白生長因子應該直接調節正常創傷修 復的許多關鍵步驟,包括炎性細胞趨向性遷移,成纖維細胞、角化細胞和血管內皮細胞的 分裂增殖,新生血管的形成，細胞間質成分的合成和降解。②創傷愈合的周圍環境應該含 有蛋白生長因子，在釋放全過程中含量應該變化,生長因子的作用受到抑制時,創傷修復 則遇到障礙。(D慢性創傷的周圍環境含有較低的生長因子活性。④生長因子應該促進慢 性創傷的愈合。
TOGF是在尋求血清中促細胞增值因子的過程中被發現的(Ross et al. ， 1974) [2]'， 包括PDGFA和PDGFB兩種異構體，作用包括促增值，存活，遷移，細胞外基質的沉積， 組織重構。血管的發生靠內皮細胞的發芽、分支、削枝來實現的。收縮間充質細胞包繞 這些原始的血管。兩種主要的血管外細胞是血管平滑肌細胞和血管外膜細胞。他們分泌 抑制因子抑制內皮細胞的過度增殖。在PDGFB/PDGFBR基因敲除的小鼠常在出生前死于 血管包被不全的出血。血管內皮細胞分泌PDGFB;血管平滑肌、血管外膜細胞表達PDGFBR，PDGFB誘導血管平滑肌、血管外膜細胞遷移到新生的血管外。從而促進血管的正常發育。 VEGF家族因子的顯著特征是對于內皮細胞的專一性。VEGF不是一種蛋白，而是由 許多由不同長度和氨基酸種類的多肽構成的混合物。1983年被作為血管通透性因子而被 發現[3]。 VEGF被看為是一種血管發生的動態調節因子。Kirchner等w報道局部運用VEGF 能縮短糖尿病小鼠潰瘍愈合的時間將近50X。Galeano等[5]也指出運用VEGF基因治療對 與糖尿病引起的創傷愈合障礙是一種很有前途的方法。
表皮生長因子(EGF)是Cohen在研究神經生長因子的過程中發現的，研究發現人 的EGF同小鼠EGF —樣能促進各種組織來源的上皮細胞的增殖活性。表皮生長因子家族 主要包括下列成員EGF、 TGF-a、 HB-EGF、 a卿hiregulin雙調蛋白，印iregulin, betacellulin, neuregulins、印igen，其主要與四種受體結合，EGFR/ErbBl, HER2/ErbB2， HER3/ErbB3，和HER4/ErbB4，所有的EGFR合成后都以膜錨定的方式固定在膜表面，在 蛋白酶的作用下酶解為活性方式[6]。有趣的是酶解后，跨膜結構域仍能刺激臨近細胞的 生長，說明無論是跨膜結構域還是可溶性的形式在創傷愈合過程中都發揮著作用。
FGF家族目前認為由22個成員構成"]。FGF的特征在于其能與肝素以及肝素類結合， 增加其對熱以及蛋白酶的穩定性，同時對于其發揮受體激活的活性也是必須的。FGF主 要作為多種細胞的有絲分裂原活性，同時也能調節某些細胞的遷移和分化，在某些極端 情況下還能支持細胞存活的活性，[9]。按等電點不同分為堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)和酸性成纖維細胞生長因子(aFGF) 。 bFGF的生物學活性遠大于aFGF。 bFGF是 動物和人體組織中存在的一種微量蛋白，對多種中胚層和神經外胚層來源的細胞具有廣
泛生物學活性,是一種多功能細胞因子[1°] 。 bFGF可趨化血管內膜的各類細胞,并誘導這 些細胞表達組織重建所需的血漿酶原激活劑、膠原酶和蛋白水解酶等;這些酶類通過促 使血管基底膜降解和刺激內膜各類細胞增殖與遷移,誘導血管內皮細胞長入膠原基質中 形成管腔并促進神經元及新生血管共同生長[11]。
方培耀等[12]研究發現,創面愈合延遲與生長因子及其受體低表達有一定的關系。 目前，大多數細胞因子的產品采用基因工程的方法制備[15]—[18]，因子成分種類單一。

發明內容
本發明提供的一種細胞因子的組合物是干細胞培養液。
本發明人通過研究發現，干細胞在培養過程中，能分泌各種細胞因子，這些細胞因 子進入到培養液中。以往培養胚胎干細胞后的培養基被丟棄，本研究所創造性的對胚胎 干細胞在生長過程中釋放的細胞因子加以利用，變廢為寶，節約了資源，為細胞因子用于臨床治療提供了一種具有巨大開發潛能的藥物。
根據本發明的實施例，收集到干細胞培養液中細胞因子PDGF、 VEGF、 EGF、 bFGF平 均含量依次為207.4±88. 7pg/ml、 206. 2 ±9. 6 pg/ml、 245. 9±78. 4 pg/ml、 33. 6 ±5. 3 pg/ml。
上述細胞因子組合物的制備方法是每24小時收集一次胚胎干細胞培養液，并觀 察胚胎干細胞培養狀態，收集6天。將每天收集的培養液混合即可。收集到的細胞因子 組合物最好于一8(TC下儲存。
本發明還提供了該細胞因子的組合物的醫藥用途，即用于制備促進創傷愈合的藥物。
根據本發明的實施例，上述獲得的細胞因子組合物，可以用于制備促進創傷愈合的 藥物。
藥物理想的劑型為噴霧劑。
本發明的優點在于與目前流行的各種重組細胞因子制劑相比，細胞因子種類更加 豐富，細胞因子活性更加接近天然狀態，是一種具有巨大開發潛力的生物制劑。
具體實施方式
實施例
1. Feeder細胞的準備 病原學檢測合格的人成纖維細胞經過絲裂霉素C處理后以3X 107cm2密度接種6孔
板，37°C、 5%0)2培養，24小時-72小時后用于接種ES細胞。培養液使用D/F-12培養 基。成纖維細胞株按通用的方法獲得。
2. ES細胞的培養
病原學檢測合格的ES細胞采用按文獻19—21中公開的方法獲得人胚胎干細胞株， 以40-60clone/孔的密度接種在Feeder上，37°C、 5%0)2培養，每7天傳代一次，每隔 24小時換液一次，收集每天的培養液，儲存于4'C，最后將收集的液體混合，儲存于一 80°C。
3. 培養液細胞因子含量的檢測與儲存
將6天收集的液體混合，作為一個批號的產品，取混合液0.5ml，用ELISA試劑盒 檢測生長因子的含量，其余收集的液體經過0.25um濾器過濾后分裝，并儲存于4'C冰 箱保存。
穩定性檢測結果發現30天后，在-20°C、 4°C、和25'C細胞因子的平均含量分別為PDGF， 191. 4±35. 1 pg/ml、 160. 9±23. 0 pg/ml、 149. 2±41. 4 pg/ml; VEGF, 146.1 ±43.5 pg/ml、 116. 3±20. 2 pg/ml、 112. 5±29.6 pg/ml; EGF， 226.2 ±37,7 pg/ml、 169. 9±63. 4pg/ml、 161. 1±29. 5 pg/ml; bFGF， 37. 0±16. 9 pg/ml、 27. 4±7. 0 pg/ml、 23.9±6.7 pg/ml;提示在-2(TC條件下細胞因子的穩定性最好，當儲存溫度提高時，因 子含量逐漸降低的趨勢，但經過統計學分析，PX).05,故認為在30天內，細胞因子的 含量不受儲存條件的影響。
為觀察胚胎干細胞分泌的這些生長因子對于創傷愈合的影響，在20只家兔背部制 作兩排直徑1.5cm的圓形創面(左、右各3個創面)，左側使用冰凍干燥法濃縮干燥的 胚胎干細胞培養液粉末(內含氨芐青霉素粉末)治療，右側使用氨芐青霉素粉末治療作 為對照，對兩組創口愈合的時間進行t檢驗，結果發現，胚胎干細胞培養液濃縮粉末治 療組平均愈合天數為12天，氨芐青霉素粉末對照組為14天，兩組比較t〈0. 05,有統計 學差異，胚胎干細胞培養液濃縮粉末能加速創傷的愈合。
參考文獻
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權利要求
1、一種細胞因子的組合物是干細胞培養液，其中含有細胞因子PDGF、VEGF、EGF、bFGF。
2、 根據權利要求
1所述的細胞因子組合物，其特征在于干細胞培養液中細胞因子 PDGF、 VEGF、 EGF、 bFGF平均含量依次為207. 4±88. 7pg/ml、 206.2 ±9.6pg/ml、 245. 9±78. 4 pg/ml、 33. 6±5. 3 pg/ml。
3、 根據權利要求
1或2所述的細胞因子組合物，其特征在于所說的培養液是接種后6 天內的培養液。
4、 權利要求
1至3之一所述的細胞因子組合物用于制備促進創傷愈合的藥物。
專利摘要
本發明涉及一種細胞因子的組合物。本發明還涉及該細胞因子組合物的醫藥用途。本發明提供的一種細胞因子的組合物是干細胞培養液。本發明的優點在于與目前流行的各種重組細胞因子制劑相比，細胞因子種類更加豐富，細胞因子活性更加接近天然狀態，是一種具有巨大開發潛力的生物制劑。
文檔編號C12N5/08GKCN101503672SQ200810030632
公開日2009年8月12日 申請日期2008年2月5日
發明者盧光琇, 戈 林, 建 王 申請人:湖南惠霖生命科技有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan