本發明涉(she)及生物化學(xue)，具體涉(she)及尿液總rna提(ti)取方(fang)法。

背景技術：

1、尿(niao)液(ye)(ye)(ye)中(zhong)包含多種(zhong)不同類型rna，包括(kuo)微小(xiao)rna?(mirna)、脫(tuo)落細(xi)胞rna、游(you)離循(xun)環rna(cfrna)、長鏈非編碼rna?(lncrna)?和(he)mrna片(pian)段(duan)等。其(qi)(qi)中(zhong)，mirna一(yi)般(ban)為(wei)22個核(he)苷酸形(xing)成的(de)(de)(de)(de)非編碼rna，其(qi)(qi)主(zhu)要(yao)通(tong)過(guo)抑(yi)制特定mrna的(de)(de)(de)(de)翻(fan)譯或(huo)促進(jin)其(qi)(qi)降解(jie)來調控基因表(biao)(biao)達。在(zai)尿(niao)液(ye)(ye)(ye)中(zhong)檢測特定的(de)(de)(de)(de)mirna模式(shi)對于(yu)診斷(duan)(duan)和(he)監控疾(ji)病(bing)(bing)(bing)，如(ru)癌(ai)癥或(huo)心(xin)血管疾(ji)病(bing)(bing)(bing)有重要(yao)意義(yi)。脫(tuo)落細(xi)胞rna來自尿(niao)液(ye)(ye)(ye)中(zhong)自然(ran)脫(tuo)落的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞的(de)(de)(de)(de)rna，可(ke)反映(ying)泌尿(niao)系統和(he)腎臟健康狀況(kuang)(kuang)信(xin)息(xi)，有助于(yu)診斷(duan)(duan)泌尿(niao)系統疾(ji)病(bing)(bing)(bing)和(he)腎功能障礙。cfrna是(shi)在(zai)細(xi)胞死(si)亡過(guo)程中(zhong)釋放(fang)到體(ti)(ti)液(ye)(ye)(ye)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)rna片(pian)段(duan)，包括(kuo)線狀和(he)環狀rna，可(ke)反映(ying)機體(ti)(ti)內生(sheng)理或(huo)病(bing)(bing)(bing)理過(guo)程，作為(wei)疾(ji)病(bing)(bing)(bing)活動的(de)(de)(de)(de)標志物(wu)。lncrna一(yi)般(ban)為(wei)長度超過(guo)200個核(he)苷酸的(de)(de)(de)(de)非編碼rna，它們(men)在(zai)x染色(se)體(ti)(ti)靜(jing)默、基因調控、染色(se)體(ti)(ti)改造(zao)等多種(zhong)生(sheng)物(wu)過(guo)程中(zhong)發(fa)揮作用。尿(niao)液(ye)(ye)(ye)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)mrna通(tong)常呈現為(wei)片(pian)段(duan)形(xing)式(shi)，有助于(yu)了解(jie)特定基因在(zai)疾(ji)病(bing)(bing)(bing)過(guo)程中(zhong)的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)達情況(kuang)(kuang)。

2、獲得尿(niao)液(ye)中總rna對(dui)(dui)早期疾病檢測、病因研究和治(zhi)療效果監測具有重要意義(yi)。盡管當前(qian)市面上存在(zai)通用(yong)rna提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)(he)，但這些試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)(he)更(geng)適用(yong)于(yu)(yu)(yu)rna含(han)(han)量高(gao)（>100ng/ml）的(de)(de)體液(ye)或組織樣本(ben)類(lei)型，而常規(gui)尿(niao)液(ye)樣本(ben)中rna含(han)(han)量普(pu)遍低(di)于(yu)(yu)(yu)10ng/ml，利用(yong)常規(gui)通用(yong)型rna提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)(he)在(zai)提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)尿(niao)液(ye)樣本(ben)時(shi)通常無(wu)法提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)到核酸。目(mu)前(qian)沒有專門針對(dui)(dui)尿(niao)液(ye)rna，即包括cfrna，mirna、lncrna等在(zai)內的(de)(de)尿(niao)液(ye)總rna國(guo)產提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)(he)，僅有的(de)(de)對(dui)(dui)尿(niao)液(ye)中總rna提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)的(de)(de)商用(yong)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)(he)為norgen的(de)(de)尿(niao)液(ye)總rna提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)(he)（us?6177278?b1），其對(dui)(dui)于(yu)(yu)(yu)尿(niao)液(ye)中總rna提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)采(cai)用(yong)一(yi)種碳化硅柱提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)方式(shi)，相比于(yu)(yu)(yu)傳統吸附柱提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)成本(ben)更(geng)高(gao)，且操作更(geng)繁瑣，而利用(yong)傳統吸附柱法提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)尿(niao)液(ye)中rna時(shi)，獲得的(de)(de)rna含(han)(han)量偏(pian)低(di)，且抑制物含(han)(han)量高(gao)，不利于(yu)(yu)(yu)下游建庫測序檢測等。因此需要一(yi)款能(neng)夠針對(dui)(dui)這類(lei)低(di)含(han)(han)量rna樣本(ben)提(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)的(de)(de)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)(he)。

技術實現思路

1、針對現有技術中存在的問題，本發明提(ti)供了尿液(ye)總rna提(ti)取(qu)方(fang)法。

2、本發(fa)明(ming)解決其技術問題所采用的(de)技術方案是：

3、尿液總rna提取方法，包括以下步驟：

4、s1、配(pei)制尿液rna提取試劑；

5、s2、使用尿液(ye)rna保(bao)存管采集晨尿，作(zuo)為樣本；

6、s3、依次向離心(xin)管中加(jia)入(ru)(ru)125μl蛋白酶k混合液、5ml步驟(zou)s2中采集的樣(yang)本、5ml裂解結合液1并混合均勻(yun)，將離心(xin)管放入(ru)(ru)60℃水浴鍋(guo)內恒(heng)溫水浴20min，每隔5min渦旋振(zhen)蕩(dang)20s；

7、s4、加熱完成后，向上(shang)一(yi)步(bu)中(zhong)的離(li)心管(guan)內加入15-25ml裂解結合液2，將離(li)心管(guan)置(zhi)于冰(bing)上(shang)靜置(zhi)5min；

8、s5、向s4中的離心(xin)管內加入60μl核酸結合磁(ci)(ci)珠，渦旋10min，形成磁(ci)(ci)珠懸液；

9、s6、利用負壓(ya)過柱漂(piao)洗(xi)，獲(huo)得尿液rna洗(xi)脫液。

10、進一步地，所述步驟s1中提(ti)取試劑的組分及(ji)其含量為(wei)：

11、蛋白酶(mei)k溶液(ye)：蛋白酶(mei)k干粉(fen)、buffer；

12、裂解結合液1：50mm?tris-hcl、4m?異(yi)硫氰酸胍、1m?nacl、5mm?edta、體積百分比為2%的十二(er)烷基肌氨酸鈉(na)、體積百分比為1%的?dmso、無菌(jun)水；

13、裂解結合液2：0.1m?kh2po4、4m?異硫氰酸胍、1m?nacl、體(ti)積百分比為5%?的triton-100、3m?尿素(su)、無菌水；

14、dna酶：1u/μl?dnase?i；

15、漂洗液1：0.15m?tris-hcl、0.8m?nacl、5m?鹽(yan)酸胍、0.01m?edta、體積(ji)百分比(bi)為(wei)55%的(de)無(wu)水乙醇、無(wu)菌水；

16、漂洗(xi)液2：0.15m?tris-hcl、體(ti)積百分(fen)比(bi)為80%的無水乙醇、無菌水；

17、核酸結合磁(ci)珠為硅基修飾的磁(ci)珠；

18、洗脫液的(de)成份：無酶水。

19、進一(yi)步地，所(suo)述(shu)步驟s6中利用負壓過(guo)柱漂洗，包括以下步驟：

20、s611、進(jin)行負壓裝置氣密性檢測，無誤(wu)后進(jin)行下一步操作；

21、s612、將連(lian)接(jie)管、吸(xi)附柱、延(yan)(yan)長管正(zheng)確(que)連(lian)接(jie)至負(fu)壓裝置(zhi)上，將步驟s5中的(de)磁珠(zhu)懸液(ye)倒入延(yan)(yan)長管內，啟動負(fu)壓裝置(zhi)開始(shi)對(dui)磁珠(zhu)懸液(ye)進行過濾；

22、s613、過(guo)濾完成后(hou)，向吸附柱中加入80μl的dna酶，靜置10min后(hou)啟動負壓裝置進行過(guo)柱；

23、s614、向s613的吸附(fu)柱中(zhong)加入總(zong)體積2%-5%的漂洗液(ye)1，啟(qi)動負壓裝(zhuang)置對其進(jin)行(xing)過(guo)柱，棄廢液(ye)；

24、s615、向s614的吸(xi)附柱中加入(ru)總體積2%-5%的漂(piao)洗液(ye)2，啟動負壓裝(zhuang)置對其進行(xing)過柱，棄廢液(ye)；

25、s616、向(xiang)s615的(de)吸附柱中(zhong)加(jia)入總體(ti)積(ji)2%-5%的(de)無水(shui)乙醇，啟動負壓裝置對(dui)其進行過柱，棄廢(fei)液；

26、s617、從(cong)負壓裝置上(shang)取下吸附柱，4000g離心2min，室溫靜(jing)置3min，棄廢(fei)液；

27、s618、向s617的(de)吸附(fu)柱(zhu)中加入30-100μl洗(xi)脫液(ye)，室溫(wen)靜置2min后4000g離心2min，獲(huo)得(de)尿液(ye)rna洗(xi)脫液(ye)。

28、進一步(bu)地，所述(shu)步(bu)驟s6還可以利用離心過柱漂(piao)洗，包括以下步(bu)驟：

29、s621、將(jiang)步驟s5中裝有磁(ci)珠懸液(ye)的離心(xin)(xin)管置(zhi)于臺(tai)式離心(xin)(xin)機中，3000g離心(xin)(xin)2min，將(jiang)上清液(ye)小心(xin)(xin)棄去，保(bao)留磁(ci)珠沉(chen)淀(dian)；

30、s622、向s621中的(de)(de)離心管內(nei)加入80μl的(de)(de)dna酶，并將其與磁珠(zhu)(zhu)混勻，靜置10min，將磁珠(zhu)(zhu)混合液轉移至(zhi)新的(de)(de)吸附柱(zhu)內(nei)；

31、s623、對(dui)s622中的吸附柱進行2000g離心1min，棄廢液；

32、s624、向(xiang)s623中(zhong)的吸(xi)附柱內加(jia)入總(zong)體積(ji)2%-5%的漂(piao)洗液1并離心過(guo)柱，棄廢(fei)液；

33、s625、向s624的(de)吸附(fu)柱中加入(ru)總體積(ji)2%-5%的(de)漂洗液(ye)2并離心(xin)過(guo)柱，棄廢液(ye)；

34、s626、向s625的吸附(fu)柱(zhu)中加入總體積2%-5%的無水乙(yi)醇并離心過柱(zhu)，棄廢(fei)液；

35、s627、將s626的吸(xi)附柱4000g離心2min后晾干3min，棄廢液；

36、s628、向s627中(zhong)的吸附柱中(zhong)加入30-100μl洗脫液，室溫靜(jing)置2min后3000g離心2min，獲得尿液rna洗脫液。

37、與現(xian)有(you)(you)(you)技術相比，本(ben)發明(ming)具(ju)有(you)(you)(you)以下(xia)有(you)(you)(you)益效果(guo)：

38、通(tong)過本發明的方法獲得的尿液總rna濃度高(gao)，抑(yi)制(zhi)物含量少(shao)，更有利于下游rna建庫測(ce)序(xu)等疾病檢測(ce)。

39、本發明的(de)提取試劑和相關(guan)耗材容易獲得，不用trizon等有(you)毒有(you)害(hai)物質，綠色、安全。

技術特征：

1.尿液(ye)總rna提取方(fang)法，其特(te)征(zheng)在于，包括以下步驟：

2.根據(ju)權利要求1所述的(de)(de)一種(zhong)尿液總rna提取方法，其(qi)特(te)征(zheng)在于，所述步驟s1中提取試劑的(de)(de)組分及(ji)其(qi)含量為：

3.根據權利要(yao)求(qiu)1所述的一種尿液總(zong)rna提(ti)取方法，其特征在于，所述步(bu)驟(zou)s6中利用負壓(ya)過柱漂洗，包括以下步(bu)驟(zou)：

4.根據權利要求1所述的(de)一(yi)種尿液(ye)總(zong)rna提取(qu)方法，其特征在(zai)于，所述步驟(zou)(zou)s6還可以利用(yong)離(li)心過柱漂洗，包括以下步驟(zou)(zou)：

技術總結
本發明提供了尿液總RNA提取方法，核心是利用磁珠將尿液樣本中的DNA與RNA進行結合，利用負壓或離心裝置對磁珠混合液進行吸附柱過濾，使結合核酸的磁珠覆在吸附柱膜上，再利用DNA酶對核酸中的DNA進行消化，隨后經過磁珠漂洗及洗脫最后獲得RNA。本發明通過結合磁珠法與柱式法提取方案能夠更高效的獲得核酸。利用該提取方法獲得的尿液總RNA濃度高，且抑制物含量少，更有利于下游RNA建庫測序等疾病檢測。

技術研發人員：毛豐,肖歡,顏虹,龔波,曾祥,殷劍峰,王春香
受保護的技術使用者：江蘇康為世紀生物科技股份有限公司
技術研發日：
技術公布日：2024/9/19