本發明涉及診斷學，具體涉及一種基于母體的胎兒外膜滋養層細胞的胎兒遺傳檢測方法。

背景技術：

胎兒dna的獲得主要有兩種方式：一是傳統的侵入性方法，包括羊膜穿刺術(amniocentesis)，絨毛膜取樣(chorionicvillussampling，cvs)，臍血取樣等，這些方法雖能準確地診斷，但可能造成胎兒損傷，導致產婦流產等不良后果，而且在孕期較晚時間(8～20周，或者更晚)才能檢測；二是非侵入性方法，非侵入性方法獲取胎兒dna的是從母體血漿和循環的胎兒細胞，在懷孕的早期，可在母體的血液中檢測到胎兒的遺傳物質的一種基于無細胞的胎兒游離dna(cfdna)開發的非侵入性診斷策略，然而，根據研究分析，在妊娠的早期和妊娠晚期，cfdna分別僅占總血漿dna的大約3.4％和6.2％，而且，其含量受到孕婦的年齡，體重，懷孕的時間影響，此外，cfdna是短片段的dna，這對精確的分析來說是很大的挑戰。另外一種技術是基于母體血液的胎兒有核紅細胞，以及評估獲取細胞的核苷酸序列。

在母體樣本中富集胎兒有核紅細胞的方法中：首先，通過密度梯度離心，去除母體血液中多種無核的細胞，之后通過親和力的原理富集與純化胎兒有核紅細胞；例如，有核紅細胞的前體細胞表面大量表達半乳糖分子，其可被凝集素捕獲；此外，可利用細胞表面特異性的抗原，富集胎兒有核紅細胞；例如，胎兒有核紅細胞大量表達基質金屬蛋白酶14前體或轉鐵蛋白前體。但該細胞在血液中的含量非常稀少，在10⁶～10⁷的母體細胞中可能只含有1個胎兒的有核紅細胞，這對于分離來說，是非常困難，而且這些方法只能在孕期較晚時間(12～26周)才能檢測，存在局限性。評估獲取細胞的核苷酸序列方法中：評估富集胎兒細胞的核苷酸序列的包括：靶核苷酸測序方法和基因組dna測序、使用特定的檢測探針與感興趣的序列雜交、細胞里某些基因rna表達水平的評估等。

目前廣泛使用的三種檢測方法存在局限性：羊水穿刺術和絨毛膜絨毛取樣(cvs)技術具有侵入性，而且在孕期較晚時間(8～20周，或者更晚)才能檢測；胎兒游離dna(cfdna)檢測存在胎兒dna含量過低的問題，而且在孕期較晚時間(12～26周)才能檢測。此外，基于母體血液的胎兒有核紅細胞的方法，但該細胞在血液中的含量非常稀少，在10⁶～10⁷的母體細胞中可能只含有1個胎兒的有核紅細胞，這對于分離來說，是非常困難。

在胚胎發育成桑椹胚后，桑椹胚進一步發育，細胞開始出現分化。聚集在胚胎的一端，個體較大的細胞，稱為內細胞團(innercellmass，icm)，將來發育成胎兒的各種組織，而沿透明帶內壁擴展和排列的，個體較小的細胞，稱為滋養層細胞，它們將來發育成胎膜和胎盤。滋養層細胞有囊胚外圍的滋養外胚層發育分化而來，覆蓋于絨毛的表面，內層為細胞滋養層細胞，外層為合體滋養層細胞。在胚胎發育過程中，絨毛表面的細胞滋養層細胞不斷增加，逐步發育成胎膜和胎盤。近年來，科學家發現有少量的滋養層細胞會遷移到孕婦的子宮頸口。這類細胞保持與胎兒相同的dna序列，可用于胎兒診斷，但現有技術中的流程需要將hla-g的抗體與磁珠上的二抗過夜孵育，流程繁瑣，耗時，且存在磁珠表面的二抗與樣本里面的細胞非特異性結合，降低檢測的準確性。

技術實現要素：

本發明目的是提供一種基于母體的胎兒外膜滋養層細胞的胎兒遺傳檢測方法。本發明所述方法簡便、快速、特異性高。

為實現上述目的，本發明所采用的技術手段為：

一種基于母體的胎兒外膜滋養層細胞的胎兒遺傳檢測方法，包括如下步驟：

1)提供含有胎兒滋養層細胞的樣本；

2)將樣品固定，加冰醋酸消化，離心，緩沖液重懸，胰酶消化，緩沖液重懸；

3)加入磁性納米顆粒偶聯的hla-g單克隆抗體，孵育；

4)磁力架收集，緩沖液沖洗離心，純化磁性納米顆粒捕獲的細胞；

5)dna酶處理，挑取單個細胞，進行單細胞基因組擴增，對基因組dna進行打斷建庫；

6)測序分析。

本發明還提供一種胎兒外膜滋養層細胞的純化方法，包括以下步驟：

1)提供含有胎兒滋養層細胞的樣本；

2)將樣品固定，加冰醋酸消化，離心，緩沖液重懸，胰酶消化，緩沖液重懸；

3)加入磁性納米顆粒偶聯的hla-g單克隆抗體，孵育；

4)磁力架收集，緩沖液沖洗離心，純化磁性納米顆粒捕獲的細胞。

本發明還提供所述胎兒外膜滋養層細胞的純化方法在胎兒遺傳中的應用。

本發明步驟1)所述的樣品，妊娠5周或5周以上即可獲得，可以通過巴氏涂片獲得含有完整的胎兒滋養層細胞的母體(孕婦)宮頸管的樣本；更具體的，可以將細胞刷深入到宮頸內管大約2cm，并旋轉360度；如果第一次沒有得到宮頸黏液，可再次采集樣本。盡量減少與宮頸壁接觸，以減少母親的細胞的污染。

本發明步驟2)樣品固定可以用本領域常用的細胞固定液，如：95％的乙醇、甲醇、5％的冰醋酸、carnoy固定液(配方：無水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml)、丙酮、4％的多聚甲醛溶液、10％的甲醛溶液等；優選carnoy固定液，carnoy固定液能固定胞漿和胞核，尤其適宜于染色體等。

本發明步驟2)所采用的具體方法可以為：將采集到的樣品轉移到固定液中，加入冰醋酸，室溫放置4-6min；離心去上清，緩沖液清洗，離心去上清，緩沖液重懸，加入胰酶35-38℃消化10-20min，離心去上清，緩沖液重懸。

本發明步驟2)中離心選用的條件優選為1000-2000rpm離心4-6min；緩沖液優選pbs。步驟2)中加冰醋酸可以消化樣本的黏液，同時使紅細胞膨脹而破碎。加胰酶的處理有利于消化成單個細胞，便于后面的質控以及細胞捕獲實驗。

本發明步驟3)中的hla-g單克隆抗體為兔源hla-g單克隆抗體。

本發明步驟4)純化磁性納米顆粒捕獲的細胞之后，可以取部分細胞，質控富集細胞的純度。質控方法可以為本領域常用的方法，如：取部分富集細胞轉移到載玻片上，38-42℃處理樣本4-6min，按照免疫熒光的方法，用cy3偶鏈的hcg的抗體檢測細胞是否表達hcg(正常情況下，凡是表達hla-g的細胞都會表達hcg)，質控富集細胞的純度。

本發明步驟5)dna酶處理可以消化外源的母體dna，避免母體細胞dna的影響，具體方法可以為：dna酶室溫處理4-6min。

本發明的步驟5)挑取單個細胞，裂解細胞，之后用dna聚合酶擴增基因組。優選高保真的dna聚合酶。可以是耐熱的高保真dna聚合酶，也可以是常溫的dna聚合酶。

本發明一種更為具體的基于母體的胎兒外膜滋養層細胞的胎兒遺傳檢測方法，包括以下步驟：

1)妊娠5周或5周以上的孕婦，利用巴氏涂片捕獲得含有完整的胎兒滋養層細胞的孕婦宮頸管的樣本；

2)將步驟1)捕獲的細胞轉移到細胞固定液中，3-5℃保存；向樣本中加入冰醋酸，室溫放置4-6min，1000-2000rpm離心4-6min收集細胞樣本；

3)緩沖液重懸細胞樣本，離心，去上清，重復3次；

4)緩沖液重懸細胞樣本，加入胰酶35-37℃消化處理細胞10-20min，1000-2000rpm離心4-6min收集細胞樣本；

5)緩沖液重懸細胞樣本，離心，去上清，重復3次；

6)加入磁性納米顆粒偶聯的hla-g單克隆抗體，3-5℃孵育過夜；

7)磁力架收集之后再用冷的緩沖液重懸，重復收集-重懸3次，純化磁性納米顆粒捕獲的細胞；

8)取一部分細胞，轉移到載玻片上，38-42℃處理樣本4-6min，按照免疫熒光的方法，用cy3偶鏈的hcg的抗體檢測細胞是否表達hcg；

9)剩余細胞用dna酶室溫處理4-6min，離心收集細胞，加入緩沖液，再離心，反復洗3次，進一步洗掉磁珠和母體dna；

10)挑取單個的細胞，進行單細胞基因組擴增，對基因組dna進行打斷建庫；

11)測序分析。

本發明所述技術方案的有益效果：

1)滋養層細胞發育形成胎盤，它們攜帶有與發育的胚胎和胎兒相同的基因組。因此，檢測巴氏涂片上滋養層細胞中的dna，可以提供與其他檢測方法相同的信息，而且檢測時間更早，侵入性更小；本發明所述方法可以在妊娠更早期(5周)進行的可靠檢測；它是非侵入性的，可以讓很多患者更放心；

2)本發明選用兔源hla-g單克隆抗體，結合本發明捕獲方法的改進，相對于傳統的方法，使抗體的親和力提高100-1000倍，顯著性的提高捕獲的效率，提高靈敏度、準確度；

3)另外一方面，將hla-g單克隆抗體偶聯在磁珠上，減少二抗的非特異性結合，進一步提高結果的準確度；

4)直接用捕獲的細胞做單細胞擴增，避免了現有技術中把細胞貼在載玻片上，分離細胞核，去除粘附的母源dna，裂解滋養層細胞的細胞核，釋放出的胎兒dna等繁瑣的步驟，操作更簡便，不需要極高的技術要求，時間更短。

附圖說明

圖1是hla-g陽性細胞捕獲的流程圖；

圖2是捕獲細胞的質控與單細胞建庫分析；

圖3是實施例1捕獲細胞的質控結果；

圖4是實施例2捕獲細胞的質控結果；

圖5是實施例1和實施例2樣品中捕獲的陽性細胞與對比例的比例對比；

圖6是實施例3和對比例的流程示意圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步說明，下面實施例未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領域的公知手段。

實施例1臨床樣本的采集和處理

1.1樣本收集：樣本孕婦選擇孕期超過5周女性，利用巴氏涂片捕獲得含有完整的胎兒滋養層細胞的孕婦宮頸管的樣本，具體的操作包括將細胞刷(購買于hologic公司)深入到宮頸內管大約2cm，并旋轉360度；如果第一次沒有得到宮頸黏液，可再次采集樣本。盡量減少與宮頸壁接觸，以減少母親的細胞的污染。

1.2樣本保存：將細胞刷在20ml的固定液(購買于hologic公司)中涮洗，將剛才采集到的細胞轉移到固定液中，4度保存。

1.3向上述的細胞樣本中加入500ul的冰醋酸，室溫放置5分鐘，用以消化樣本的黏液，同時使紅細胞膨脹而破碎。離心收集細胞樣本，離心條件可以選擇1000rpm5分鐘。

1.4去上清，將沉淀重懸在20ml的pbs的緩沖液中，離心，去上清。重復3次。離心步驟1000rpm5分鐘，選擇在4度的條件下進行；

1.5之后用1.5mlpbs重懸細胞，加入1.5毫升胰酶(購買于thermofisher公司)消化處理細胞15分鐘，在37度的條件下進行。用胰酶的處理有利于消化成單個細胞，便于后面的質控以及細胞捕獲實驗。離心步驟1000-2000rpm5分鐘，選擇在4度的條件下進行；將沉淀重懸在1.5ml的pbs的緩沖液中，離心，去上清。重復3次.

實施例2模擬樣本的采集和處理

1.1將移液器和移液槍、15ml離心管、離心管架、100cm2新的細胞培養皿放于生物安全柜中，按照生物安全柜的標準操作規程，將生物安全柜的紫外開啟半小時。

1.2將含10％胎牛血清(購買于thermofisher公司)和100u/ml雙抗(購買于thermofisher公司)的mem((購買于thermofisher公司)，添加nahco31.5g/l，sodiumpyruvate0.11g/l)及pbs放于37℃水浴鍋中預熱。

1.3將已長到80％-90％的人絨毛膜細胞株jeg-3細胞(購買于中國科學院細胞庫)，培養皿從37℃，5％的co2培養箱中取出，先用75％的酒精噴灑于瓶表面，將細胞培養瓶旋轉放于生物安全柜中，用無菌的移液管吸凈其中的培養基，加5ml的預熱的pbs洗滌一次，吸凈pbs。同時，將已長到80％-90％的子宮頸癌細胞的細胞系hela細胞(購買于中國科學院細胞庫)培養皿從37℃，5％的co2培養箱中取出，先用75％的酒精噴灑于瓶表面，將細胞培養皿旋轉放于生物安全柜中，用無菌的移液管吸凈其中的培養基，加5ml的預熱的pbs洗滌一次，吸凈pbs。

1.4將含edta-0.25％tyption(購買于thermofisher公司)用pbs稀釋兩陪到五倍，向該100cm2培養皿中加入3ml稀釋好的edta-0.25％tyption，讓其充分平鋪于細胞表面。蓋好瓶蓋，將細胞瓶放在顯微鏡下觀察，直到細胞變圓，加含10％胎牛血清的mem培養基到15ml無菌的離心管中，1000rpm離心3分鐘。

1.5將離心上清吸棄掉，用手指輕輕拍打離心管底將底部細胞分散開，再加3ml

carnoy固定液(配方：無水乙醇60ml，購買于國藥，氯仿30ml，購買于國藥，冰醋酸10ml，購買于國藥)將分散的細胞重懸稀釋開，室溫固定5分鐘。

1.6將上述樣本離心1000rpm，室溫3分鐘，去上清，加入5mlpbs重懸，再離心，去上清，反復洗三次，最后用10ml的pbs重懸該細胞。取一定量的細胞液進行10倍稀釋后計數，按照細胞計數標準操作規程進行。計數方法：按圖計算計數板的四角大方格(每個大方格又分16個小方格)內的細胞數。計數時，只計數完整的細胞，若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數。在一個大方格中，如果有細胞位于線上，一般計下線細胞不計上線細胞，計左線細胞不計右線細胞。二次重復計數誤差不應超過±5％。鏡下觀察，凡折光性強而不著色者為活細胞，染上藍色者為死細胞。計數的換算：計完數后，需換算出每ml懸液中的細胞數。由于計數板中每一方格的面積為0.01cm²，高為0.01cm，這樣它的體積為0.0001cm³，即0.1mm³。由于1ml＝1000mm³，所以每一大方格內細胞數×10000＝細胞數/ml，故可按下式計算：細胞懸液細胞數/ml＝4個大格細胞總數/4×10000，如計數前已稀釋，可再乘稀釋倍數。

1.7計數好之后細胞，在1.5ml的pbs加入200000個hela細胞和200個jeg-3細胞，模擬臨床的樣本。

實施例3基于母體的胎兒外膜滋養層細胞的胎兒遺傳檢測方法

如圖1、圖2和圖6所示，包括如下步驟：

1)選擇實施例1或實施例2采集或處理后的細胞；

2)將兔源hla-g(hla-g是滋養層和胎盤細胞特有的人類白細胞抗原)單克隆抗體(公司自產的)連接到磁性納米顆粒表面；

3)在步驟1)中的樣本中，加入偶聯兔源hla-g抗體的磁珠，4度孵育過夜，如圖1所示；

4)用磁力架收集磁珠之后在用冷的pbs重懸，用磁力架收集，再加入pbs，重復3次，去掉未結合的母體細胞；純化磁珠捕獲下來的細胞；如圖1所示，用磁力架回收hla-g的陽性細胞，用pbs洗掉hla-g的陰性細胞；

5)取一小部分細胞，轉移到載玻片上，40度處理樣本5分鐘。按照免疫熒光的方法，用cy3偶鏈的hcg的抗體(購買于thermofisher公司)檢測細胞是否表達hcg(正常情況下，凡是表達hla-g的細胞都會表達hcg)，質控富集的hcg細胞的認純度，如圖2所示。

免疫熒光的步驟：①pbs浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干pbs，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；②吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的cy3偶鏈的hcg一抗(1:300購買于thermofisher公司)并放入濕盒，4℃孵育過夜；后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行；③pbst浸洗3次，每次3min，吸水紙吸干玻片上多余液體后滴加dapi(購買于sigma公司)，避光孵育5min，對標本進行染核，pbst5min×4次洗去多余的dapi；④用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

6)剩余的細胞樣本用dna酶室溫處理5分鐘，離心收集細胞，加入pbs緩沖液，再離心，反復洗3次，進一步洗掉磁珠和母體dna。

7)挑取單個的細胞，利用本公司的單細胞擴增試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號n602)進行單細胞基因組擴增，具體方法參見產品說明書，如圖2所示。

8)擴增純化的基因組dna(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號nd602)，利用本公司的nd604試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號nd604)建庫，具體方法參見產品說明書；

9)上機測序，利用二代測序的技術，對胎兒dna進行分析。

對比實驗：如圖6所示，包括以下步驟：

1)同樣選擇實施例1或實施例2采集或處理后的細胞樣品；加入5ug的鼠源hla-g抗體與樣本4度過夜孵育；

2)加入偶聯有羊抗鼠二抗抗體的磁珠加上到樣本中，4度孵育6小時；

3)用磁力架收集磁珠之后在用冷的pbs重懸，用磁力架收集，再加入pbs，重復3次，去掉未結合的母體細胞；純化磁珠捕獲下來的細胞；

4)取一小部分細胞，轉移到載玻片上，40度處理樣本5分鐘。按照免疫熒光的方法，用cy3偶鏈的hcg的抗體(購買于thermofisher公司)檢測細胞是否表達hcg(正常情況下，凡是表達hla-g的細胞都會表達hcg)，質控富集的hcg細胞的認純度，如圖2所示。

5)剩余的hla-g陽性的細胞轉移到載玻片上，40度處理樣本5分鐘。

6)用胃蛋白酶溶液(0.01g胃蛋白酶溶解在100ml0.1n的鹽酸)處理11分鐘，裂解細胞。pbs溶液洗3次，去掉細胞膜和母體dna。

7)用dna酶室溫處理5分鐘，用pbs緩沖液洗3次，進一步洗掉磁珠和母體dna。

8)加dna裂解液，65度過夜處理，裂解細胞核。95度30分鐘，失活。

9)最終，收集滋養層細胞釋放出的胎兒dna。

10)上機測序，利用二代測序的技術，對胎兒dna進行分析。

實驗結果：

1)實施例3方法中純化的胎兒外膜滋養層細胞的質控結果

實施例1樣品捕獲細胞的質控結果如圖3所示，用標記cy3的hla-g抗體檢測表達hcg的細胞，用dapi染色統計總的細胞數目，利用熒光顯微鏡統計細胞總數與hcg的陽性細胞的數目，可以看到在富集之前，樣本中有大量的細胞，其中hcg的陽性細胞非常的少，幾乎看不到，在富集之后，所有的細胞都是hcg陽性的細胞。

實施例2樣品捕獲細胞的質控結果如圖4所示，用標記cy3的hla-g抗體檢測表達hcg的細胞，用dapi染色統計總的細胞數目，利用熒光顯微鏡統計細胞總數與hcg的陽性細胞的數目；可以看到在富集之前，樣本中有大量的細胞，其中hcg的陽性細胞非常的少，幾乎看不到。在富集之后，所有的細胞都是hcg陽性的細胞。

結果表明，本發明所述方法，純化效果好，幾乎可以實現100％純化。

2)實施例1和實施例2的樣品經過實施例3或對比實驗的檢測方法，捕獲的陽性細胞的比例如圖5所示。雖然實施例3中利用1μg兔源的hla-g抗體而對比實驗中用了5μg鼠源的hla-g抗體，但結果顯示通過實施例3所述方法用1ug的兔源的hla-g抗體捕獲的效果比對比實驗中5ug鼠源的hla-g抗體捕獲的陽性率高，且構成顯著性差異。因此，本發明所述方法特異性更好，靈敏度更高，同時使用的抗體少，成本低。

3)實施例3所用方法相對于對比實驗流程更簡便，時間更短，從拿到樣本到提取樣本的基因組dna，現在的方法在13.5小時便可以完成，其中動手時間在1.5小時左右；而對比實驗流程需要長達33小時才能完成流程，其中動手時間需要2小時以上。