本發明屬于分子生物學領域，具體涉及檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒及方法。

背景技術：

目前短串聯重復序列分型是法醫學廣泛采用的分型技術，單核苷酸多態性是近些年來應用于法醫領域的遺傳標記，它對于處理降解檢材，以及推測嫌疑人個性特征有一定的優勢。目前利用法醫的常規技術手段能夠解決案件中大多數同一認定和親子關系鑒定問題，但對于同卵雙胞胎仍然很難進行區分。由于同卵雙生子是從同一個受精卵發育而來，他們擁有相同的dna序列，這就給涉及同卵雙胞胎的犯罪案件的偵破帶來很大的困難。英國的樸次茅斯市發生的汽車盜竊案，在被盜汽車上采集到嫌疑人dna，經調查發現有一對同卵雙胞胎都擁有這份dna數據，這就無法認定真正的盜竊者。法國馬賽地區發生的多次強奸案，警方通過監控鎖定了一名送貨司機，但最終查出的嫌犯是一對同卵雙胞胎兄弟，由于應用現有的技術無法區分這對兄弟，也只好把兩人無罪釋放。同卵雙胞胎違法犯罪事件同樣在國內也有發生，陜西省岐山縣公安局受理的一起強奸殺人案，dna證據直指鄰家一對同卵雙胞胎，由于他們具有相同的dna分型，從而給案件的偵破帶來了很大的困難。因此，應用分子生物學的方法對同卵雙生子進行鑒別，對案件的偵破將起到很大的作用。

技術實現要素：

針對同卵雙生子之間有著相同或極其相似的基因序列，難以區分的問題，提供檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒及方法。

為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：

檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒，包括：血液dna提取試劑盒、dna甲基化轉化試劑盒、pcr緩沖溶液、引物、焦磷酸測序試劑盒、磁珠、結合緩沖液、洗滌緩沖液、退火緩沖液和變性緩沖液；所述引物包括分別對應靶序列igs3、igs4、igs5和igs6，用于pcr擴增的上下游引物和測序引物：

（1）對于igs3靶序列：

上游引物：5’-agagggttatttgagtttagtttttt-3’，

下游引物：5’-biotin-aaaatttacaaatttccaatctactatcc-3’，

測序引物：5’-ttttttttttaattttgtaatgagt-3’；

（2）對于igs4靶序列：

上游引物：5’-gtttttggtaggaagagggaaaaat-3’，

下游引物：5’-biotin-attaaccaaaataatcttaatcacctaac-3’，

測序引物：5’-aggaagagggaaaaataatta-3’；

（3）對于igs5靶序列：

上游引物：5’-gtttttgatagggttggtttgtattg-3’，

下游引物：5’-biotin-ccactaaaaaaaacaaaaacaacctaatta-3’，

測序引物：5’-ggttggtttgtattgg-3’；

（4）對于igs6靶序列：

上游引物：5’-gttgggtttatttttgttattgttgg-3’，

下游引物：5’-biotin-actcttccaaaaaacccctaat-3’，

測序引物：5’-atttttgttattgttggaga-3’；

所述下游引物標有生物素。

本發明所述的鑒別同卵雙生子的方法，包括如下步驟：

a）利用所述血液dna提取試劑盒提取同卵雙生子dna，得到dna提取液；

b）利用所述dna甲基化轉化試劑盒對步驟a）中所提取的dna進行亞硫酸氫鹽轉化；

c）pcr擴增

在pcr緩沖溶液、上下游引物和無核酶水混合溶液中加入步驟b）中經亞硫酸氫鹽轉化后的dna進行pcr擴增；

d）分別建立相應的assay，確定每條序列噴堿基的相應順序

對于igs3的序列噴堿基順序：

atcgctgatcgtgtgactgattcgtagttgatatatatgtgtgtagtgtagagaatcgtg；

對于igs4的序列噴堿基順序：

attgactgatcgtgtgctgatcgtgtgatcgtgtattagtattgatgtcgagtgtatatgatcgag；

對于igs5的序列噴堿基順序：

atgctgatcgctagttattagtgtatgtcgtgagtatcgat；

對于igs6的序列噴堿基順序：

atatgtcagtcgctagttggagctattgatcgagtgatagtcgtattgtgtagttcgtatgatcgag；

e）對擴增產物進行單鏈分離和純化

步驟c）中所得的擴增產物加入含有結合緩沖液和磁珠的pcr板孔內，恒溫水平震蕩處理后，用樣品吸附器吸附結合在磁珠上的含生物素的pcr擴增產物，經純化處理得到純凈的單鏈dna模板；將所述單鏈dna模板轉移至含測序引物的退火緩沖液中，恒溫退火，冷卻至室溫待測序；

f）對單鏈dna模板進行焦磷酸測序反應

準備好焦磷酸測序反應所用的酶混合物、底物混合物及dntp，加入試劑艙，將步驟e)所得的單鏈dna模板放入焦磷酸測序儀，根據步驟c）中的噴堿基順序進行焦磷酸測序反應；

g）分析測序結果

焦磷酸測序儀自動對測序結果進行判讀并標記出每個甲基化位點的甲基化程度及平均甲基化水平，根據測序結果獲得的甲基化信息，對同卵雙生子進行鑒別：以焦磷酸測序儀靈敏度a為標準，若同卵雙生子之間甲基化水平差值大于a，則認為雙生子之間有差異；若同卵雙生子之間甲基化水平差值小于或等于a，則認為雙生子之間無差異。

進一步地，所述步驟e）中，pcr板孔內擴增產物、結合緩沖液、磁珠的體積比為37:40:3。

進一步地，所述恒溫水平震蕩采用恒溫混勻儀實現，所述恒溫混勻儀為thermomixer。

進一步地，所述步驟e）中，純化處理依次包括：用70%乙醇洗滌5秒，變性緩沖液中變性15秒，洗滌緩沖液中洗滌15秒。

進一步地，所述步驟e）中，含測序引物的退火緩沖液中退火緩沖液與測序引物體積比為25:1。

進一步地，所述步驟e）中，恒溫退火溫度為80℃，時間為5min。

基因序列：gs1序列(genebankaccesionnumber:xm_006726188)位于跨膜通道樣蛋白4（transmembranechannel-like4，tmc4）的外顯子區，可檢測6個cpg位點，擴增片段為85bp；gs3序列(genebankaccesionnumber:nm_001256358)位于酪氨酸蛋白激酶6（proteintyrosinekinase6,ptk6)的外顯子區，可檢測5個cpg位點，擴增片段為129bp；igs1、igs2兩條序列均位于基因間區，其染色體定位分別為chr3:22、chr3:79，其擴增片段長度分別為139bp、164bp，可分別檢測4個、3個cpg位點；line-1序列擴增片段為168bp，可檢測3個cpg位點；5條靶序列dna甲基化鑒別同卵雙生子的能力的累積效能為77.5%。

本發明中所提供的基因序列：igs3、igs4、igs5和igs6四條序列均位于基因間區，其染色體定位分別為chr1:114、chr12:67、chr11:5、chr1:56，其擴增片段長度分別為152bp、141bp、109bp、168bp，可分別檢測4個、5個、3個、4個cpg位點。

采用上述技術方案所產生的有益效果在于：

（1）本發明所提供的檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒，所包含的4條序列igs3、igs4、igs5和igs6在相應的cpg位點上甲基化水平存在明顯差異，可以有效的對同卵雙生子進行鑒別，與現有的gs1、gs3、igs1、igs2和line-1序列聯合使用，可以提高對同卵雙生子的鑒別能力，鑒別同卵雙生子的能力的累積效能，從原來的77.5%可以提升到94.2%，更好地為同卵雙生子犯罪案件的偵破提供技術支持。

（2）本發明所提供的鑒別同卵雙生子的方法，采用焦磷酸測序技術，可重復性和精確性高，成本低，可以大通量、適時、快速、直觀地進行同卵雙生子的鑒別。

附圖說明

圖1和圖2是本發明實施例中同卵雙生子個體的igs3序列甲基化代表性結果。

圖3和圖4是本發明實施例中同卵雙生子個體的igs4序列甲基化代表性結果。

圖5和圖6是本發明實施例中同卵雙生子個體的igs5序列甲基化代表性結果。

圖7和圖8是本發明實施例中同卵雙生子個體的igs6序列甲基化代表性結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細的說明。

檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒，包括：血液dna提取試劑盒、dna甲基化轉化試劑盒、pcr緩沖溶液、引物、無核酶水、焦磷酸測序試劑盒、磁珠、結合緩沖液、洗滌緩沖液、退火緩沖液和變性緩沖液；所述引物包括分別對應靶序列igs3、igs4、igs5和igs6，用于pcr擴增的上下游引物和測序引物。

血液dna提取試劑盒可以簡單、方便地從新鮮或長時間存放（超過24小時）的全血中分離高純度基因組dna；該試劑盒將硅膠膜技術的優勢與微量離心形式結合在一起，同時無需采用昂貴的樹脂、乙醇沉淀，以及諸如苯酚和氯仿等有害化學成分。

dna甲基化轉化試劑盒在3小時內完全轉化富含gc的dna，兩次加熱變性的反應步驟簡化了由未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶的過程，無dna沉淀，并且通過柱層析一步完成dna的純化和脫硫，洗脫的超純dna對于一系列的分子生物分析是非常理想的。

用于pcr擴增的上下游引物及測序引物均由上海生工生物技術有限公司合成，上游引物均采用的page純化的方法，下游標記生物素的引物則采用反向高壓液相層析（hplc）純化的方法合成，所述上下游引物的堿基序列如下表所示。

為了更好的說明本發明實施例提供的檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒及方法，下面通過實施例做進一步的舉例說明。

實施例1

本發明鑒別同卵雙生子的方法，包括如下步驟：

a)雙生子血樣dna的提取、定量、分裝及保存

應用qiagen公司的血液dna提取試劑盒提取2ml血液樣本的dna，應用核酸蛋白定量儀對所提取的dna進行檢測，并記錄下每個樣本dna的濃度與純度，分裝于-20°c保存。

b)亞硫酸氫鹽轉化

1)加入130μl的ct轉化試劑于20μldna樣品中(20μl的樣品中dna含量約500ng)；

2)顛倒混勻1)中的試劑，簡短離心并均分到2個200μl的離心管中并離心；

3)把2）中的離心管放入pcr中，98℃變性10分鐘，64℃孵育2.5小時；

4)向zymo-spinic?column純化柱中加600μl的m-bindingbuffer，并把純化柱放到收集管中；

5)將3）中轉化后的樣品轉移到zymo-spinic?column純化柱中，蓋上蓋子顛倒數次混勻；

6)室溫全速離心1分鐘，棄掉收集管中的液體，擦干柱子邊緣并放回收集管中；

7)向純化柱中加入200μl的洗滌緩沖溶液，全速離心1分鐘；

8)向純化柱中加入200μl的m-desulphonationbuffer并且在室溫下放置15-20分鐘，全速離心30秒，棄掉收集管中的液體，擦干柱子邊緣并放回收集管中；

9)加200μl的m-washbuffer到純化柱中。全速離心1分鐘；

10）重復8）步驟一次，棄掉收集管中的液體，擦干柱子邊緣并放到一個新的1.5mll的離心管內。

11)直接加10~15μl的m-elutionbuffer到純化柱底部膜上，室溫放置5分鐘，全速離心收集dna到1.5ml離心管內。

c）轉化后的dna進行pcr擴增

本實施例采用pcr進行擴增（polymerasechainreaction，聚合酶鏈式反應）。擴增體系如下表所示。

pcr擴增步驟：在abi9700pcr擴增儀中進行擴增，熱循環參數：95°c，5min；（95°c，15sec，x°c，30sec，72°c，15sec）×48，72°c，5min。5條序列的退火溫度分別為gs1序列:58°c，gs3序列:59°c，igs1序列:54°c，igs2序列:54°c，igs3序列:55°c，igs4序列:52°c，igs1序列:54°c，igs2序列:56°c，line-1序列:50°c；，最終保持在4°c，得擴增產物。

擴增產物在進行焦磷酸測序反應之前，需要用瓊脂糖凝膠電泳進行簡單驗證。通常情況下，只需要進行瓊脂糖凝膠電泳即可。如果電泳結果得到較清晰的目的條帶，且非特異性條帶較少，則不影響測序，即可進行焦磷酸測序反應。

d）確定噴堿基順序（dispensationorder）

在進行焦磷酸測序之前，需要先獲得dispensationorder。打開pyromarkid軟件，點擊newassay，將引物設計軟件中所保存的本實驗的待分析序列引入，程序即可自動生成一個dispensationorder和預期的焦磷酸序列圖（pyrogram）。設置內指控即任意選擇2個由“c”轉化過來的“t”，在其前面加噴一個“c”，作為檢測dna序列經亞硫酸氫鹽轉化是否完全的內質控，保存文件。

e）對擴增產物進行單鏈分離和純化

在pcr板孔內加入40μlbingdingbuffer，再加入步驟c）中所得的擴增產物37μl，然后震蕩磁珠（beads）使其混合均勻取3μl磁珠放到pcr板相應的孔內，把pcr板放在thermomixer上常溫水平震蕩30分鐘，使beads與含生物素的產物鏈充分結合。用samplepreptool吸附被結合在磁珠上的含生物素的單鏈pcr產物，然后進行純化（不關閉samplepreptool開關，依次用70%乙醇洗滌5秒、變性緩沖液中變性15秒，洗滌緩沖液中洗滌15秒），從而得到純凈的單鏈dna模板。把純化后的單鏈小心轉移至已準備好的測序板內，測序板每孔有40μl含1.6μl測序引物的退火緩沖液，烤箱80℃恒溫退火5min，冷卻至室溫待測序。

f）建立run文件進行焦磷酸測序反應

打開pyromarkid軟件，點擊file主菜單區下的newruns，輸入runname等反應的信息，選擇反應孔，輸入相應的樣本信息等。在tools菜單中點擊volumeinformation選項，即可顯示本次實驗需要用到的酶混合物、底物混合物和四種dntps的具體用量。向酶以及底物混合物中分別加入620μl無核酶水。將酶和底物以及四類核苷酸(a、t、c、g)按照系統顯示的量分別加入試劑艙指定位置，在軟件界面點擊運行鍵run即可進行測序。

g）讀取dna甲基化信息，分析測序結果

焦磷酸測序儀自動對測序結果進行判讀并標記出每個甲基化位點的甲基化程度及平均甲基化水平，根據測序結果獲得的甲基化信息，以焦磷酸測序儀靈敏度5%為標準，若同卵雙生子之間甲基化水平差值大于5%，則被認為雙生子之間有差異，小于或等于5%的視為無差異，對同卵雙生子進行鑒別。

基因序列：igs3、igs4、igs5和igs6四條序列均位于基因間區，其染色體定位分別為chr1:114、chr12:67、chr11:5、chr1:56，其擴增片段長度分別為152bp、141bp、109bp、168bp，可分別檢測4個、5個、3個、4個cpg位點。

如圖1和圖2所示，圖1和圖2為兩個同卵雙生子個體，igs3序列甲基化代表性結果，在cpg1、cpg2、cpg3位點上兩個體甲基化水平存在差異。

如圖3和圖4所示，圖3和圖4為兩個同卵雙生子個體，igs4序列甲基化代表性結果，在cpg1、cpg2、cpg3、cpg4、cpg5位點上兩個體甲基化水平存在差異。

如圖5和圖6所示，圖5和圖6為兩個同卵雙生子個體，igs5序列甲基化代表性結果，在cpg1、cpg2位點上兩個體甲基化水平存在差異。

如圖7和圖8所示，圖7和圖8為兩個同卵雙生子個體，igs6序列甲基化代表性結果，在cpg1、cpg2位點上兩個體甲基化水平存在差異。

由以上數據可得，本發明檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒及方法，對同卵雙生子可以進行鑒別，為同卵雙生子犯罪案件的偵破提供技術支持。

以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，本發明要求保護范圍由所附的權利要求書、說明書及其等效物界定。

序列表

<110>河北醫科大學

<120>檢測dna甲基化鑒別同卵雙生子的試劑盒及方法

<130>2017

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agagggttatttgagtttagtttttt26

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aaaatttacaaatttccaatctactatcc29

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ttttttttttaattttgtaatgagt25

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gtttttggtaggaagagggaaaaat25

<210>5

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

attaaccaaaataatcttaatcacctaac29

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

aggaagagggaaaaataatta21

<210>7

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

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<210>8

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

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<210>9

<211>16

<212>dna

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<210>10

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<212>dna

<213>人工序列

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gttgggtttatttttgttattgttgg26

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

actcttccaaaaaacccctaat22

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

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