專利名稱:高原病高危人群的基因篩查方法及其相關基因診斷產品的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因篩查及基因診斷領域。具體而言，本發明涉及高原肺水腫高危人群的基因篩查方法及其相關基因診斷產品。
背景技術：
1、歷史背景
2001年7月-2005年12月，我國修建世界上海拔最高的青藏鐵路格拉段，北起青海省格爾木(觀60米)至西藏自治區首府——拉薩市(3680米)。全長1142公里，其中960 公里地處海拔4000多米的青藏高原，還要通過海拔5000多米的唐古拉山。5年間，13-14 萬名鐵路建設工人在高原低氧、寒冷和氣候多變的惡劣環境下筑路。因此，保證工人身體健康和勞動能力，減少急、慢性高原病發生，是青藏鐵路建設中亟待解決三大難題中的首要問題。發明人作為經衛生部和鐵道部批準的唯一科研單位與中鐵建筑總公司合作參加了青藏鐵路建設中衛生保障工作，并開展了一系列醫學研究，完成了現場流行病學調查，收集大量有用數據和各種急、慢性高原病(肺、腦水腫)及正常對照樣本，為研究個體對急性高原病易感差異性的相關基因奠定了物質基礎。
2、急性高原肺水腫概述
2. 1急性高原肺水腫定義
急性高原肺水腫(以下簡稱為“高原肺水腫”)是常見的急性高原病之一，指健康人進入海拔2，500-3, 000以上米高原后，因高原低氧導致得以肺動脈壓升高并伴有肺泡和肺間質水腫為臨床特征的急性呼吸系統疾病，具有發病急、進展快，救治不及時，死亡率高等特點。
2. 2診斷標準
高原肺水腫(HAPE)患者的顯著臨床特征為血氧飽和度降低。
2. 2. 1發病時間進入2，500-3，000米以上高原1-6天內發病。
2. 2. 2典型癥狀靜止時呼吸困難、咳，肺部有水泡樣啰音；X-胸片顯示明顯陰影， 部分發生紫紺；非感染所致。
2. 2. 3治療方法供氧，臥床休息或移送到海拔2000米以下地區，2-3天內臨床癥狀基本消失。
2. 3青藏鐵路建設中的高原肺水腫發生率
2001年7月-2005年12月，在13萬多建筑工人中發現有明顯癥狀在工地醫院就診患者841人，其平均發病率為841/13,000 = 0. 65%，發病率隨海拔高度增高而增加。
3、高原肺水腫的研究
高原肺水腫易感個體差異性與基因多態性相關聯
現代研究已證明，不同種族、民族(如藏族與漢族)人群基因多態性，不僅具有進化和地域特點，而且與生物功能和公共衛生相關，如對疾病易感性、抗性、衰老、長壽及對特殊環境的應激能力等密切相關。高原肺水腫易感個體差異性可謂是基因多態性的表型體現。因此，基因多態型及多基因相互作用的檢測是篩查HAPE易感個體的科學而有效的技術方法。高原肺水腫發生是遺傳與環境因素相互作用引發疾病的典型范例。雖然，低氧是 HAPE發生的重要引發因素，但是，在同樣高原低氧環境下，一些人易患HAPE，而另些人則無明顯不適反應，說明HAPE發生與個人的遺傳背景相關。
4、建立高原肺水腫高危人群基因篩查技術的必要性
西部大開發戰略實施的重大需求我國是一個多山的高原國家，3000米以上高原占我國陸地面積1/4，也是西部大開發的主戰場。西部大開發戰略實施是加速我國社會主義經濟建設，維護社會安定、民族團結和鞏固國防的迫切要求，也是實現現代化建設第三步戰略目標的需要。青藏高原有豐富的資源(礦藏、水利、石油等)，亟待開發利用。然而，高原低氧引發的急性高原病，特別是急性高原肺水腫和腦水腫，是人類在高原上的主要疾病和死亡原因之一，這些疾病令人聞而生危。無疑高原低氧對人體損傷將大大影響高原建設和經濟發展，因此預防、減少急性高原病的發生顯得尤為重要。而通過基因檢測，篩除高原肺水腫等急性高原病高危人群，可減少高原病發生率，保持人體健康和勞動能力成為青藏高原建設中亟待解決，及貫徹“以人為本”的首要問題。
5、應用前景
隨著世界人口的劇增，人類生存空間將不斷向高山、海洋、太空擴展，首先遇到的問題便是低氧、低氧分壓對人類生命的威脅。高原缺氧的自然環境與其他特種環境(如航天航空、潛水、極地等)相似，均存在諸多應激源，人體對這些應激源必定產生不同應激反應，其反應可以表現在呼吸系統、神經系統及血液等系統。高原肺水腫是人體對高原缺氧的應激反應在呼吸系統的表現，也是環境和遺傳因素相互作用引發的疾病的典型范例。腦水腫是人體對高原缺氧反應產生的神經系統的表現，臨床癥狀與飛行員“暈動病”等一系列特殊疾病相似。因此，高原肺水腫易感性的基因檢測技術有廣泛的應用范圍及其他體檢技術無可比擬的優點
5. 1高原駐軍和作戰部隊的選擇我國有很長的國防線在海拔3000米以上的高原。駐守在那里的官兵，作戰部隊，特種快速反應部隊(如玉樹地震救援部隊)和到高原換防部隊，往往因初到低氧環境而引發不同程度，不同種類急性高原病，使整個部隊戰斗力下降。如果通過基因檢測，篩出高危個體，就可減少疾病發生，保證赴藏人員的體力、勞動力和戰斗力。
5. 2可作為赴高原參加建設工作人員的一項體檢指標。
5. 3作為飛行員、航天員、潛水員和地質采礦等特殊工種人才選擇的有用指標。
5. 4作長跑、登山等運動員等體育人才的選擇。
5. 5作為赴高原旅游人員的安全檢查。

發明內容
發明人發現轉鐵蛋白和解偶聯蛋白2的4種組合基因型(以S表示Sl DD-GG-AA-AA-GG，S2 =DD-AG-AG-AG-GT, S3 =DD-AG-AA-AA-GG, S4 =DD-GG-AA-AG-GG)和高原肺水腫易感強正相關；而5種組合基因型(P5 =DI-AG-AG-AG-GG, P6 DD-AG-AA-AG-GT，P7 DD-AG-AG-GG-GG，P8 =DD-AA-AA-AG-GT, P9 =DD-GG-GG-GG-GG)與高原肺水腫抗性相關，即為保護性基因型。檢測組合基因型S1-S4，可篩除35%的肺水腫易感者；而檢測組合基因型P5-P9，可選擇出98%的不易患高原肺水腫的健康人群(見表4)。
因此，本發明一方面涉及檢測發生高原肺水腫危險性的方法，該方法包括從待測個體中采集樣品如血樣，檢測樣品中解偶聯蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G的核苷酸類型，將檢測到的模式與S1-S4、P5-P9進行比較， 從而確定該個體發生高原肺水腫的危險性。
本發明還涉及檢測發生高原肺水腫危險性個體的解偶聯蛋白和轉鐵蛋白基因的組合基因型，其中所述組合基因型包含用于檢測解偶聯蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G。所述組合基因型可通過質譜分析法、AFLP, RFLP, RAPD、實時熒光PCR分析法、單鏈構象多態性分析法、異源雙鏈分析法、順序特異寡核苷酸法、序列特異性引物分析法、變性梯度凝膠電泳法、等位基因特異性寡核苷酸探針法、 PCR指紋圖法、基因芯片法或測序法檢測。
本發明另一方面涉及檢測發生高原肺水腫危險性的組合物，其中所述組合物包含用于檢測解偶聯蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A 和-35T/G的試劑。應當理解，一旦確定了需要檢測的位點，本領域技術人員熟知多種方法確定相關位點的核苷酸類型，從而制備用于檢測該位點核苷酸類型的組合物。所制備的組合物中包含檢測上述位點核苷酸類型所必需的試劑。例如，所述的試劑可包括寡核苷酸 (例如SEQ ID No 1-5的寡核苷酸)、酶如限制性酶(例如下表5中所列舉的限制性酶)、 緩沖液、PCR引物(例如SEQ IDNo :6_15的引物)等。制備檢測已知位點核苷酸類型的組合物的方法是本領域已知的。
對于多態性位點的檢測，可使用本領域已知的任何方法進行。例如可通過質譜分析法、AFLP、RFLP、RAPD、實時熒光PCR分析法、單鏈構象多態性分析法、異源雙鏈分析法、順序特異寡核苷酸法、序列特異性引物分析法、變性梯度凝膠電泳法、等位基因特異性寡核苷酸探針法、PCR指紋圖法、基因芯片法或測序法檢測解偶聯蛋白基因的-866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G。相關方法的綜述可參考例如“單核苷酸多態性檢測分析技術，高秀麗等，遺傳HEREDITAS (Beijing) 27 (1) =110-122, 2005”。因此，本發明的組合物中包含通過上述方法檢測解偶聯蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G所必需的試劑。例如，本發明的組合物包括解偶聯蛋白和轉鐵蛋白相應多核苷酸序列測序所需的試劑，從而確定上述位點的核苷酸類型。
本發明另一方面還涉及檢測發生高原肺水腫危險性的基因芯片，其中所述基因芯片包含用于檢測解偶聯蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的_740G/A、_552G/A 和-35T/G的試劑。制備檢測已知位點核苷酸多態性芯片的方法是本領域已知的。例如，可參考申請日為2005年2月19日，公開號為CN1771337A，發明名稱為“包含單核苷酸多態性且與結腸癌有關的多核苷酸、包括該多核苷酸的微陣列和診斷試劑盒以及用該多核苷酸診斷結腸癌的方法”的中國專利申請公開的方法制備基因芯片。
本發明另一方面還涉及檢測發生高原肺水腫危險性的試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測解偶聯蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的_740G/A、_552G/A和-35T/ G的試劑。本發明的試劑盒可包含上述組合物或基因芯片，并可進一步包含適合進行自動化分析的其他試劑。
本發明另一方面還涉及解偶聯蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G在制備檢測發生高原肺水腫危險性的產品中的用途。所述的產品可以是例如上述組合物、試劑盒、基因芯片。
根據發明人提供的實驗數據可對通過本發明的方法、組合物、試劑盒、基因芯片的檢測結果進行分析。如果檢測到的模式為下述模式S1-S4，則判斷受檢測個體發生高原肺水腫危險性高，如果檢測到的模式為下述模式P5-P9，則判斷受檢測個體發生高原肺水腫危險性低，其中按照組合45bp I/D/G-866A/A-740G/A-552G/G-35T的順序，模式S1-S4分別為 Sl DD-GG-AA-AA-GG，S2 =DD-AG-AG-AG-GT, S3 =DD-AG-AA-AA-GG, S4 =DD-GG-AA-AG-GG ； 模式 P5-P9 分別為 P5 =DI-AG-AG-AG-GG, P6 =DD-AG-AA-AG-GT, P7 =DD-AG-AG-GG-GG, P8 DD-AA-AA-AG-GT，P9 =DD-GG-GG-GG-GG
本發明另一方面還涉及多核苷酸組合物，其中所述多核苷酸組合物中多核苷酸包含偶聯蛋白的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、_552G/A和-35T/G。例如，所述多核苷酸序列可以為SEQ IDNo 1-5所示的序列或其互補序列的一部分或全部，或包含 SEQ IDNo :1-5所示的序列的一段更長序列。更長序列可從公共數據庫中獲得。
本發明另一方面還涉及上述多核苷酸組合物在制備檢測發生高原肺水腫危險性的產品中的用途。本發明的組合物、試劑盒、基因芯片中可包含上述多核苷酸。本領域技術人員可根據數據庫公開的序列制備(如人工合成)上述多核苷酸。
本發明另一方面還涉及SEQ ID No :6_10所示序列的引物以及該引物在制備檢測發生高原肺水腫危險性的產品中的用途。


圖1 人體內活性氧生成途徑及其相關成分。灰色框里的分子是在血管細胞中的重要活性氧分子；白色框里是本發明中涉及的分子TF 轉鐵蛋白，SOD 過氧化物歧化酶， UCPs 解偶聯蛋白，eNOS 內皮一氧化氮合成酶，GSH-Px 胱甘肽轉移酶1。
具體實施方式
高原肺水腫易感/抗性相關基因發現過程
1.研究設計
采用前瞻性隊列研究。所有參加青藏鐵路建設人員均接受二次健康查體。第一次， 在各自低海拔地區，接受常規健康體檢，排除患有高血壓、糖尿病、肺心病、哮喘、感染性疾病、肝炎等慢性病個體。第二次，上述健康個體在海拔觀60米的格爾木，習服3-6天，排除在海拔觀60米有嚴重高原反應個體，如血氧飽和度(SaO2)低于85%，心率> 100次/分，及輕度呼吸困難及高度失眠和感染性疾病的個體。此后，被選中的健康個體在進入海拔4000 米以上的建筑工地工作。
2.樣本選擇
2. 1肺水腫患者選擇(見前述“肺水腫診斷標準”)
2. 2正常健康對照樣本的選擇標準
按年齡、性別、民族、工作類型和生活環境(高度、溫度)條件相匹配原則，從其同事中選擇對照著，這些對照者至少在與患者相同的環境條件下工作三個月未患高原肺水腫和腦水腫。[0046]3.血樣本收集
在知情同意的原則下，采集外周血5ml，以2% EDTANa2抗凝。于4°C分離血漿和血球，血漿用以測定生化指標，血細胞用來分離提取基因組DNA。
4.基因多態性分析
4. 1基因組DNA分離
應用常規酚/氯仿方法，從白細胞中分離基因組DNA，其純度為A26Q/A28Q彡1.8。
4. 2候選基因選擇及多態性分析
4. 2. 1候選基因選擇
根據病例-對照組血漿生化指標和血漿蛋白質組學差異作為選擇候選基因的依據。結果表明肺水腫組血漿中轉鐵蛋白和活性氧(R0Q水平較對照組明顯升高(見表1)。 大量研究表明，活性氧生成均來自酶促或化學反應(見圖1)。因此，將轉鐵蛋白(TF)、內皮一氧化氮合成酶(eNOQ，解偶聯蛋白2，3，Mn-過氧化物歧化酶，CuZn-過氧化物歧化酶，過氧化氫酶和谷胱甘肽轉移酶作為候選基因。
表1高原肺水腫病例一對照組中血漿或紅細胞溶解液的某些活性氧水平比較
Of-士 S)
參數HAPE患者對照者P
MDA (μηιοΙ/L)*7.11 士0.455.12±0.56<0.001
GSH(pmol/L)*28.40±2.1035.61士 2.00<0.001
SOD (U/g Hb)** 34.38士7.3436.43士6.540.041
CAT (U/g Hb)**30.92±4.4228.34士7.670.003
MDA 丙二醛；GSH 谷胱甘肽；SOD 過氧化物歧酶；CAT 過氧化氫酶；
*血漿廣紅細胞溶解液；
4. 2. 2多態性位點的選擇
根據各種酶/蛋白質編碼基因多態性對ROS生成的可能影響，選擇如下位點進行多態性分析過氧化氫酶基因啟動子-262 ；CuZn過氧化物歧化酶第2外顯子(Glg41ser， Gly8Arg和GlulOOGly) ；Mn過氧化物歧化酶外顯子1 (Ala9Val)；谷胱甘肽轉移酶外顯子5， 6 (The 105Val，Ala 114Val)；內皮一氧化氮合成酶啟動子(-786)，內含子4中的27bp插入 /缺失多態性和外顯子894G/T ；解偶聯蛋白2啟動子-866G/A，外顯子4674T/C (Ala55Val) 和3'-非翻譯區45bp插入/缺失多態性；解偶聯蛋白3啟動子-55C/T ；轉鐵蛋白啟動子-740G/A，-618G/A, -552G/A 和-35G/T，共 18 個多態性位點。
4. 2. 3多態性位點等位基因的鑒定
采用聚合酶鏈反應(PCR)和PCR結合限制性內切酶分析(PCR/RFLP)，酶解產物通過3%瓊脂糖和/或10%丙烯酰凝膠電泳及EB或硝酸銀染色確定其基因型和等位基因。
實施方案
1、候選基因多態性位點A/B等位基因在病例-對照組的頻率分析
等位基因頻率由基因型頻率計數直接計算。例如AA純合型18例，AB雜合基因型 37例，BB純合基因型16例。A等位基因頻率為[(18 X 2+37) / (18 X 2+37 X 2+16 X 2) ] X 100 % =(73/142) X 100%= 51. 4%, B 等位基因頻率為 48. 6%。
2、病例-對照組間頻率差[0066]應用SAS軟件9. 13版本計算組間各等位基因頻率分布；單倍型分析應用 Haploview 3. 2軟件；應用多因子降維法(MDR)分析基因與基因間相互作用。
3、結果
3. 1單個等位基因與高原肺水腫易感相關性
8個基因的18個多態性位點分析結果，只有UCP2的三個位點-866G/A，Ala55Val 和3，-非翻譯區的45bp插入/缺失多態性及內皮一氧化氮酶基因894G/T(GlM89ASp)與高原肺水腫易感正相關(P < 0. 0001)。(見表2)
3. 2基因型與肺水腫易感相關性
在基因型水平，內皮一氧化氮合成酶的894G/T雜合子的危險性高于894T/T純合子，相對危險性分別為5. 4和1. 2。而UCP2的-866G和45bp插入/缺失多態性表現為加和效應。(見表2)
3. 3單倍型與高原肺水腫易感相關性
解偶聯蛋白2基因的-866G-55A_45bpD單倍型與肺水腫易感強相關，ρ = 0. 0002。 (見表2)
表2解偶聯蛋白2、轉鐵蛋白和內皮一氧化氮合成酶基因單倍型與高原肺水腫易感/抗性相關性
權利要求
1.一種高原肺水腫高危人群的基因篩查方法，該方法包括從待測個體中采集樣品， 檢測樣品中解偶聯蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A 和-35T/G的核苷酸類型，由此確定該個體發生高原肺水腫的危險性。
2.一種檢測發生高原肺水腫危險性個體的解偶聯蛋白和轉鐵蛋白基因的組合基因型， 其中所述組合基因型包含用于檢測解偶聯蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A 和-35T/G。
3.根據權利要求
2所述的檢測發生高原肺水腫危險性個體的解偶聯蛋白和轉鐵蛋白基因的組合基因型，其中所述組合基因型通過質譜分析法、AFLP, RFLP, RAPD、實時熒光PCR 分析法、單鏈構象多態性分析法、異源雙鏈分析法、順序特異寡核苷酸法、序列特異性引物分析法、變性梯度凝膠電泳法、等位基因特異性寡核苷酸探針法、PCR指紋圖法、基因芯片法或測序法檢測。
4.一種檢測發生高原肺水腫危險性的基因芯片，其中所述基因芯片包含用于檢測解偶聯蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G的試劑。
5.一種檢測發生高原肺水腫危險性的試劑盒，其中所述試劑盒包含用于檢測解偶聯蛋白基因的_866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G的試劑。
6.一種解偶聯蛋白基因的-866A/G、4^3PI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A 和-35T/G在制備檢測發生高原肺水腫危險性的產品中的用途。
7.根據權利要求
1所述的高原肺水腫高危人群的基因篩查方法、或根據權利要求
2或 3所述的檢測發生高原肺水腫危險性個體的解偶聯蛋白和轉鐵蛋白基因的組合基因型、或根據權利要求
4所述的檢測發生高原肺水腫危險性的基因芯片、或根據權利要求
5所述檢測發生高原肺水腫危險性的試劑盒，其中如果檢測到的模式為下述模式S1-S4，則判斷受檢測個體發生高原肺水腫危險性高，如果檢測到的模式為下述模式P5-P9，則判斷受檢測個體發生高原肺水腫危險性低，其中按照組合45bp I/D/G-866A/A-740G/A-552G/G-35T的順序，模式 S1-S4 分別為 Sl DD-GG-AA-AA-GG，S2 =DD-AG-AG-AG-GT, S3 =DD-AG-AA-AA-GG, S4 DD-GG-AA-AG-GG ；模式 P5-P9 分別為 P5 =DI-AG-AG-AG-GG, P6 =DD-AG-AA-AG-GT, P7 DD-AG-AG-GG-GG，P8 =DD-AA-AA-AG-GT, P9 =DD-GG-GG-GG-GG
8.一種多核苷酸組合物，其中所述多核苷酸組合物中多核苷酸序列分別為SEQ ID No 1-5所示的序列或其互補序列。
9.根據權利要求
8所述的多核苷酸組合物在制備檢測發生高原肺水腫危險性的產品中的用途。
10.SEQ ID No :6-10所示序列的引物在制備檢測發生高原肺水腫危險性的產品中的用途。
專利摘要
本發明涉及高原病高危人群的基因篩查方法及其相關基因診斷產品。本發明提供通過檢測解偶聯蛋白基因的-866A/G、45bpI/D和轉鐵蛋白基因的-740G/A、-552G/A和-35T/G的核苷酸類型對高原肺水腫高危人群進行基因篩查的方法。本發明還提供了檢測發生高原肺水腫危險性的組合物、基因芯片、試劑盒等。本發明的方法、組合物、基因芯片、試劑盒等特異性高，應用范圍廣泛。
文檔編號C12Q1/68GKCN102559853SQ201010594501
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月9日
發明者周文郁, 邱長春 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan