專利名稱：來源于西印度櫻桃果實的果膠和其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及來源于西印度櫻桃(acerola)果實的果膠，其用作口服的抗氧化劑或皮膚增白劑。

背景技術：
由于在空氣中的氧造成的脂肪和油成份等等的氧化或氧化過度，在脂肪和油、含有它們的物品、食品、化妝品、藥物制劑等等的存儲、保存和加工步驟中是最麻煩的因素。尤其是，包含在脂肪和油中的不飽和脂肪酸例如亞油酸或亞麻酸容易被氧過度氧化，除了產生致癌物質之外，還產生過度氧化的脂質或自由基(Shokuhin-no-hoso(FoodPackaging)，vol.17，p.106(1986))。當氧化或氧化過度發生時，不但發生失去光澤、褪色、變性、異臭和營養價值的效果降低，而且產生毒物等，導致產品質量變壞。
通常使用各種抗氧化劑，通過抑制不飽和脂肪酸的氧化來預防產品質量的變壞。這些抗氧化劑具有對氧化時產生的過氧化物自由基起作用的效果，使得鏈式氧化反應終止，或作用于自由基，使得氧化反應終止。作為抗氧化劑、通常使用合成抗氧化劑例如丁基羥基茴香醚(BHA)和丁基羥基甲苯(BHT)。然而，由于使用這些合成抗氧化劑的機會增加，其安全性已經成為了問題。消費者的負面反應越強、這種抗氧化劑的消耗越少。此外，由于這些油溶性的抗氧化劑在水溶液中溶解性不夠，它們也是有問題的。
因此，對于具有高安全性的、來源于天然產物的抗氧化劑的期望逐漸變得顯著起來。
通常已知的天然抗氧化劑是例如維生素E(α-生育酚)和維生素C(抗壞血酸)。然而，維生素E具有高脂質溶解性，維生素C具有高水溶性，使得它們在食品工業中不適于抑制脂質氧化。這是因為由于應該抑制脂質氧化的加工的產品(例如魚、家畜肉和谷物)、鹽腌的食品、含有脂肪和油類的作料等等，各自通常形成含有脂肪和油以及水基組分的混合系統，這些具有過度脂質溶解性或水溶性的抗氧化劑的應用受到了限制。此外，維生素E是有問題的，這是由于它在食品中具有其固有的不利味道，使得其加入數量和其應用受到了限制。維生素E和維生素C也是有問題的，這是由于它們的抗氧化活性不能以穩定的方式持續很久。
通過各種方法從植物中分離的果膠，已知其在特定條件下可以對于脂質產生抗氧化活性。然而，認為這種抗氧化活性非常弱，使得這種果膠不能用作常規的抗氧化劑。例如，已知從豆腐廢物(大豆)分離的膠質和其酶處理的產品具有預防脂質氧化的效果(FOOD SCIENCE，VOL.36，NO.11，pp.93-102(1994))，但它們的抗氧化活性不足。此外，果膠是存在于各種植物中的多糖，由半乳糖醛酸、其甲基酯、其它中性糖等等組成。中性糖的例子包括鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖，但根據所涉及的植物，已知其類型和組合比例相互顯著地不同(Takaaki Manabe，第一版，“Science and Food Texture of Pectin，”Saiwai Shobo，pp.8-22(2001))。
同時，通常主要將皮膚增白劑開發用于化妝品和準藥物。由此，已經發現了許多活性組分例如熊果苷和抗壞血酸衍生物。然而，大部分這些活性組分用作外用皮膚制劑。目前，用于抑制斑點、曬斑等等產生的色素淀積的口服藥物制劑例子，是含有抗壞血酸(維生素C)作為主要活性組分與半胱氨酸(其是氨基酸)和復合維生素B的產品，預計其可以相互混配產生協同效應。具體地說，認為抗壞血酸是通過口服攝取的、可以預計安全地產生色素淀積抑制效果的最合適的成份。
作為富含抗壞血酸的果實，西印度櫻桃(學名Malpighia emarginataDC)為大家所熟知。這種西印度櫻桃作為皮膚增白劑活性組分的用途，描述在JP專利No.3513871中。西印度櫻桃的應用限于外用皮膚制劑，例如化妝品。而且，作為皮膚增白劑組合物的用途，描述在JP專利No.3076787中，其中組合物基本上不包含抗壞血酸，并且通過西印度櫻桃的發酵來獲得。沒有一種使用西印度櫻桃制造的皮膚增白劑是由抗壞血酸及其它成份組成的，并且沒有發現其口服效果。
也報道了關于來源于果漿中所包含的果膠的組份與皮膚增白效果之間的關系。據JP專利No.3596953報道，在動物細胞試驗中，低聚半乳糖醛酸可以引起抑制黑色素產生的效果。本文中，“低聚半乳糖醛酸”是通過大約2至10個半乳糖醛酸結合形成的。此外，在Shokuhin-no-hoso(Food Packaging)，vol.17，p.106(1986)中，說明來源于番茄汁的果膠降解產物具有抑制黑色素產生的效果。在該文獻中，也描述了還沒有證實半乳糖醛酸和多聚半乳糖醛酸具有抑制黑色素的效果。人們認為，JP專利No.3596953中的結果與Shokuhin-no-hoso(Food Packaging)，vol.17，p.106(1986)中的結果不一致。這可能因為相關的植物源在果膠結構和性質方面彼此非常不同。在JP專利No.3596953和Eiji Naru等人，Fragrance Journal，Vol.32，No.32，No.8，pp.24-30(2004)中，僅僅檢驗了針對動物細胞的效果。通過來源于果膠的組份及其它組分的組合來產生皮膚增白效果，還從來沒有進行過報道。


發明內容
本發明要實現的目的 本發明一個目的是提供從自然界分離出來的水溶性抗氧化劑，和制備這種抗氧化劑的方法。
本發明的另一個目的是提供從自然界分離的口服的皮膚增白劑，和制備這種皮膚增白劑的方法。
實現目的的方法 本申請包括下列發明。
(1)來源于西印度櫻桃果實的果膠或其水解物，包括果膠骨架和由下列化學式代表的多酚化合物形成的復合物
(2)制備按照(1)的果膠的方法，包括從西印度櫻桃果實或其加工的產品分離或濃縮果膠的步驟。
(3)制備按照(1)的果膠水解物的方法，包括從西印度櫻桃果實或其加工的產品分離或濃縮果膠的步驟、和將果膠水解的步驟。
(4)按照(3)的方法，包括下列步驟通過用果膠酶處理果泥而將由西印度櫻桃果實制備的果泥中的果膠水解的步驟，和由前面步驟中的加工產品的上清液來分離或濃縮水解的果膠的步驟。
(5)按照(2)至(4)的任一項的方法，其中分離或濃縮果膠的步驟是使用乙醇沉淀果膠的步驟。
(6)按照(2)至(4)的任一項的方法，其中分離或濃縮果膠的步驟是使用分離膜進行分離或濃縮果膠的步驟。
(7)按照(6)的方法，其中分離膜是超濾膜。
(8)按照(7)的方法，其中超濾膜具有從10,000至100,000的分子量分離點。
(9)含有來源于西印度櫻桃果實的果膠的材料，其是通過一種方法制備的，該方法包括從西印度櫻桃果實或其加工的產品中分離或濃縮果膠的步驟。
(10)含有來源于西印度櫻桃果實的果膠水解物的材料，其是通過一種方法制備的，該方法包括從西印度櫻桃果實或其加工的產品中分離或濃縮果膠的步驟、和將果膠水解的步驟。
(11)按照(10)的材料，其是通過一種方法制備的，該方法包括通過用果膠酶處理濃果汁、將由西印度櫻桃果實制備的濃果汁中的果膠水解的步驟，和從前面步驟中產生的加工產品的上清液中來分離或濃縮水解的果膠的步驟。
(12)按照(9)至(11)的任一項的材料，其中分離或濃縮果膠的步驟是使用乙醇沉淀果膠的步驟。
(13)按照(9)至(11)的任一項的材料，其中分離或濃縮果膠的步驟是使用分離膜來分離或濃縮果膠的步驟。
(14)按照(13)的材料，其中分離膜是超濾膜。
(15)按照(14)的材料，其中超濾膜具有從10,000至100,000的分子量分離點。
(16)一種抗氧化劑，含有按照(1)的果膠或其水解物作為活性組分。
(17)一種抗氧化劑，含有按照(9)至(15)的任一項的材料作為活性組分。
(18)一種脂質的抗氧化劑，含有西印度櫻桃果實的加工產品(不包括西印度櫻桃籽的加工產品)作為活性組分。
(19)按照(18)的抗氧化劑，其中西印度櫻桃果實的加工產品含有多酚和/或抗壞血酸。
(20)具有抗氧化效果的食品，向其中加入按照(16)至(19)的任一項的抗氧化劑。
(21)制備食品的方法，包括使用按照(16)至(19)的任一項的抗氧化劑來增加食品氧化穩定性的步驟。
(22)一種口服皮膚-增白劑，含有按照(1)的果膠或其水解物作為活性組分。
(23)一種口服皮膚-增白劑，含有按照(9)至(15)的任一項的材料作為活性組分。
(24)按照(22)或(23)的口服皮膚-增白劑，進一步含有抗壞血酸。
(25)具有皮膚-增白效果的食品，向其中加入按照(22)至(24)的任一項的口服皮膚-增白劑。
(26)制備口服皮膚-增白劑的方法，包括下列步驟將包含在西印度櫻桃果實的果肉渣中的、或含有抗壞血酸和這種果肉渣的西印度櫻桃果實的加工產品中的果膠水解的步驟，以使半乳糖醛酸的量相對于抗壞血酸的量是5％重量或更多。
(27)按照(26)的方法，進一步包括基本上除去葡萄糖和果糖的步驟。
在本發明中的術語“含有預定組份作為活性組分的抗氧化劑(對于脂質)”，表示兩種組合物其中在自然條件下含有預定組份的、具有抗氧化活性(對于脂質)的組合物，和向其中人工加入預定組份的、具有抗氧化活性(對于脂質)的組合物。
在本發明中的術語“含有預定組份作為活性組分的口服皮膚-增白劑”，表示兩種組合物其中在自然條件下含有預定組份的、具有皮膚-增白效果的組合物，和向其中人工加入預定組份的、具有皮膚-增白效果的組合物。
在上面(20)中的術語“向其中加入抗氧化劑、具有抗氧化效果的食品”，是指向其中人工加入預定抗氧化劑、具有抗氧化效果的食品。
在上面(25)中的術語“向其中加入口服皮膚-增白劑、具有皮膚-增白效果的食品”，是指向其中人工加入預定的口服皮膚-增白劑、具有皮膚-增白效果的食品。
本發明的效果 按照本發明的來源于西印度櫻桃果實的果膠，包括多酚的復合物形式，用作抗氧化劑以及用作口服皮膚-增白劑。
此說明書包括日本專利申請No.2005-53479和2005-88860的說明書和/或附圖中公開的部分或全部內容，其是本申請的優先權文件。
附圖的簡要說明

圖1表示從來源于西印度櫻桃果實的果膠中所提取樣品的色譜，通過分析HPLC進行分析。
圖2表示從來源于西印度櫻桃果實的果膠中所提取樣品的色譜，通過制備HPLC進行分析。
圖3表示將通過制備HPLC級分得到的組分進行分析HPLC所獲得的色譜。
圖4A表示圖3色譜中所示的22.4分鐘處的峰的波譜數據。
圖4B表示Aceronidin的波譜數據。
圖5表示Aceronidin1H NMR波譜(上面的圖形)與從來源于西印度櫻桃果實的果膠中分離的多酚的1H NMR波譜(下面的圖形)的比較。
圖6A表示Aceronidin的總離子色譜。
圖6B表示Aceronidin的高分辨率ESI質譜。
圖7表示Aceronidin的1H NMR波譜。
圖8表示Aceronidin的13C NMR波譜。
圖9表示Aceronidin的DEPT波譜。
圖1 0表示Aceronidin的DQF-COSY波譜。
圖11表示Aceronidin的HSQC波譜。
圖12表示Aceronidin的HMBC波譜。
圖13表示Aceronidin的NOESY波譜。
圖14表示測定抑制BHA、濃縮西印度櫻桃果汁和西印度櫻桃粉末的亞油酸的自動氧化能力的結果。
圖15表示測定維生素C抑制亞油酸自動氧化能力的結果。
圖16表示測定來源于西印度櫻桃的C18柱-吸附的組分、已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末、和西印度櫻桃粉末抑制亞油酸自動氧化能力的結果。
圖17表示測定已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末、和已經除去C18柱吸附組分與維生素C的西印度櫻桃粉末抑制亞油酸自動氧化能力的結果。
圖18表示測定用酸處理的來源于西印度櫻桃的果膠(分子量2,000,000)和用酶處理的果膠(分子量20,000或更小)抑制亞油酸自動氧化能力的結果。
圖19表示顯示在熒光照明條件下存儲之后、加入西印度櫻桃的鹽腌鮭魚樣品的試驗組的照片，和鹽腌鮭魚樣品的對照試驗組的照片。
圖20顯示了鹽腌鮭魚樣品在熒光照明條件下存儲期間的“a”值的躍遷，其中樣品已經用含有西印度櫻桃粉末的浸液處理。
圖21說明了使用褐色豚鼠進行色素淀積抑制試驗的結果。
本發明的優選實施方案 1.來源于西印度櫻桃果實的果膠 用于本發明中的西印度櫻桃(學名Malpighia emarginata DC)果實的產品地域或種類沒有特別限制。產品地域的例子包括沖繩、日本、巴西和越南。
本發明中的西印度櫻桃果實可以指的是所有果實部分，包括籽，或進行常規處理例如除去籽、剝皮等等的西印度櫻桃果實。
對于西印度櫻桃果實，可以使用成熟果實或未成熟的果實。優選使用未成熟的果實。“未成熟的果實”是已經充分成長的果實，以便可以從這種果實中榨取果汁，但具有綠色至黃色，因為果實(不成熟的果實)是在其變成足夠紅色的成熟之前的階段。
除了西印度櫻桃果實本身之外，在本發明中可以使用西印度櫻桃果實的各種形式的加工產物，只要它們含有果膠。例如，可以使用由西印度櫻桃果實、粉碎或研磨的西印度櫻桃果實的產品、或西印度櫻桃果實提取物制備的果泥、果汁或果肉渣。作為按照本發明果膠產品的起始原料，優選由西印度櫻桃果實制備的果泥、果汁或果肉渣。特別優選果泥。
可以按照傳統方法、通過壓榨西印度櫻桃果實獲得果汁。壓榨果實收集果汁之后獲得的殘余物被稱為“果肉渣”。
可以使用混合器等等，通過將西印度櫻桃果實的可食部分和籽、或已經除去籽的西印度櫻桃果實的可食部分粉碎來獲得西印度櫻桃果實的粉碎產品。此外，還可以使用進行處理例如提取或冷凍干燥的這種粉碎產品。
使用水、有機溶劑等等來提取西印度櫻桃果實，可以獲得西印度櫻桃果實提取物。對于提取條件沒有特別限制，只要在這種條件下不失去果膠。
不僅是來源于西印度櫻桃果實的果膠、而且是常規“果膠”都具有下列結構，其中由多聚半乳糖醛酸(由α-(1→4)-連接的半乳糖醛酸形成)組成的聚半乳糖醛酸苷(homogalacturonan)和由半乳糖醛酸與鼠李糖組成的鼠李聚糖半乳糖醛酸苷(rhamnogalacturonan)彼此重復連接，形成主鏈；從鼠李糖分支出半乳聚糖和阿拉伯聚糖等的側鏈例。半乳糖醛酸的羧基以不同比例被甲基-酯化或乙酰基-酯化。此外，通過與多價陽離子例如鈣或鎂結合，果膠被認為具有交聯結構。
在本發明中，由包括聚半乳糖醛酸苷和鼠李聚糖半乳糖醛酸苷的主鏈與從主鏈分出的側鏈組成的果膠的糖鏈結構，被稱為“果膠骨架”。
本發明人意外地發現，包含在西印度櫻桃果實中的果膠是果膠骨架和由下列化學式代表的多酚化合物的絡合物
該多酚化合物是本發明人第一次分離的化合物，并且命名為Aceronidin。關于這種化合物的專利是于2004年12月22日、在JP專利申請No.中申請的。
本發明中的“包括果膠骨架和多酚化合物的絡合物”是指Aceronidin和果膠骨架以某種方式共存，以使它們通過果膠的常規分離或濃縮法例如乙醇沉淀法或膜濾法(例如超濾)相互不可分離。沒有說明Aceronidin-果膠骨架復合物的具體結構。其合適的結構可能是例如其中一部分Aceronidin和一部分果膠骨架通過共有結合(例如酯鍵或苷連接基)連接的結構，其中它們通過氫鍵連接的結構，或其中它們通過疏水鍵連接的結構。此外，在Aceronidin-果膠骨架絡合物中的Aceronidin與果膠骨架的定量比例沒有特別限制。本發明中的“來源于西印度櫻桃果實的果膠”是指由果膠骨架和Aceronidin形成的絡合物，除非特別限制。此外，“分離或濃縮果膠”是指分離或濃縮果膠骨架和Aceronidin的絡合物形式的果膠。此外，按照本發明的果膠可以表示為“抗氧化果膠”，是指“具有抗氧化效能的果膠”。
本發明中的“來源于西印度櫻桃果實的果膠的水解物”是指通過果膠骨架(包括來源于西印度櫻桃果實的果膠的主鏈和側鏈)中的組分糖之間連接基、特別是主鏈中的組分糖之間連接基的化學或酶水解獲得的產品。按照本發明人進行的研究，即使用果膠酶(其將主鏈水解)將果膠骨架水解之后，通過對于分離或濃縮的果膠進行處理，例如乙醇沉淀法或超濾法，Aceronidin和果膠骨架的水解物(認為主要由側鏈組成)仍是不可分離的。具體地說，“來源于西印度櫻桃果實的果膠的水解物”也包括果膠骨架的水解物與Aceronidin的絡合物。本發明人進行的進一步研究顯示，具有分子量大約2,000,000的來源于西印度櫻桃果實的果膠，與具有分子量20,000或更小分子量的來源于西印度櫻桃果實的果膠的水解物兩者都具有抗氧化活性。由此，用于本發明中的來源于西印度櫻桃果實的果膠的分子量或其水解物的分子量沒有特別限制。
按照本發明的來源于西印度櫻桃果實的果膠是通過將西印度櫻桃果實或其加工產品分離或濃縮來制備的。分離或濃縮這種果膠方法的例子包括將乙醇加入到含有果膠的樣品中來沉淀果膠的方法，和借助于分離膜將果膠分離或濃縮的方法。這些方法之中，許多相同類型或不同類型的方法可以組合。使用乙醇沉淀果膠的步驟的重復，可以除去水溶性的抗壞血酸、或易溶于醇中的有機酸或多酚。對于分離膜，優選超濾膜。超濾膜是可以阻斷微粒或聚合物通路的膜，所述微粒或聚合物大小通常從0.1μm至2nm(分子量幾百到數百萬)。優選這種超濾膜具有公稱分子量1,000或更高的分離點，且更優選公稱分子量從10,000至100,000的分離點。
當由西印度櫻桃果實或含有果肉渣例如西印度櫻桃果肉渣和西印度櫻桃果泥的西印度櫻桃果實的加工產品分離或濃縮果膠時，將強酸例如鹽酸或硝酸加入到含有果肉渣的樣品中，而后進行上述最后段落中描述的方法，以使酸溶性的組分也可以溶解。
通過膜濾法獲得的果膠濃縮液可以直接用作抗氧化劑或皮膚增白劑的活性組分。還可以將這種果膠濃縮液制成粉末，而后使用。可以通過冷凍干燥法或噴霧干燥法制備果膠濃縮液的粉末。當利用膜濾法時，可以選擇濃縮的任一濃縮程度，優選，濃縮液中的果膠的固體含量是10％(W/W)或更高、優選20％(W/W)或更高時的濃縮程度。對于這種濃縮液的粉末，可能需要通過使用酵母等等進行脫糖來除去濃縮液中的葡萄糖和果糖。當濃縮程度在上述范圍之內時，可以很容易地進行脫糖。此外，適當地選擇超濾膜的分子量分離和濃縮條件，而后通過膜濾法來從濃縮液中除去葡萄糖和果糖，使得當將濃縮液粉末化時不需要進行脫糖。
按照本發明的來源于西印度櫻桃果實的果膠的水解物，是通過包括上述分離或濃縮果膠的步驟和將果膠水解的步驟的方法制備的。水解步驟既可以在前者步驟之前、也可以在前者步驟之后進行。果膠水解是指將來源于西印度櫻桃果實的果膠骨架中的組成糖之間的連接、尤其是主鏈中的組成糖之間的連接進行化學或酶催水解。優選使用果膠酶進行水解。當使用果膠酶時，對于果膠酶的類型沒有特別限制。例如，可以使用具有體內-多聚半乳糖醛酸酶活性的果膠酶。對于果膠酶的來源沒有特別限制。果膠酶的例子是來源于曲霉屬的微生物(例如A.Pulverulentus或A.niger)。使用來源于西印度櫻桃果實的果膠的果膠酶制備的水解物含有游離半乳糖醛酸，其是主鏈的水解液。為了從由此獲得的水解物中分離出與Aceronidin形成絡合物的唯一一種組份，可將這種組份吸附到疏水性柱(例如C18柱)上，而后可以通過洗脫收集吸附的組份。由此收集的組份也是按照本發明果膠的水解物的一個實施方案。
在最優選實施方案中，按照本發明的來源于西印度櫻桃果實的果膠水解物的制備方法包括通過使用果膠酶處理、將由西印度櫻桃果實制備的果泥中的果膠水解的步驟，和將前面步驟中所處理產品的上清液中的水解果膠分離或濃縮的步驟。在該實施方案中，優選，將上清液通過優選的0.2-μm過濾器過濾，而后將水解的果膠分離或濃縮。同樣，在該實施方案中，優選使用超濾膜將水解的果膠濃縮。優選，將通過超濾法獲得的濃縮液進一步粉末化。由此獲得的粉末可以容易地進行最后的碾壓，并且具有高流動性和低吸濕性。
2.來源于西印度櫻桃果實的果膠的應用 按照本發明的來源于西印度櫻桃果實的果膠或其水解物，具有抑制脂質的自動氧化的效果、和清除自由基的效果，使得它可以用作抗氧化劑的活性組分。
按照本發明的來源于西印度櫻桃果實的果膠或其水解物，也具有通過口服產生的皮膚增白效果，使得它可以用作這種皮膚增白劑的活性組分。
3.含有西印度櫻桃果實的加工產品作為活性組分的脂質抗氧化劑 本發明人意外地發現，吸附到疏水性柱的組分(含有多酚化合物)和包含在西印度櫻桃果實中的抗壞血酸也可以用作脂質的抗氧化劑。具體地說，本發明進一步涉及脂質的抗氧化劑，其含有西印度櫻桃果實的加工產品作為活性組分。
優選，這種西印度櫻桃果實的加工產品是水溶性的，因為它通常可以特別在食品工業中使用。
在本發明的實施方案中，這種西印度櫻桃果實的加工產品可以用作脂質的抗氧化劑的活性組分，只要它含有來源于西印度櫻桃果實的多酚化合物和抗壞血酸中的至少一種即可，優選兩種。然而，在本發明的這個實施方案中，這種西印度櫻桃加工產品來源于非西印度櫻桃籽部分，例如西印度櫻桃果肉和果皮。
這種來源于西印度櫻桃果實的化合物的具體例子包括Aceronidin，花色素苷色素例如花青素-3-鼠李糖苷和花葵素-3-鼠李糖苷，櫟精苷例如櫟素(櫟精-3-鼠李糖苷)，異櫟素(櫟精-3-糖苷)和金絲桃甙(hyperoside)(櫟精-3-半乳糖苷)，和落新婦苷(astilbin)。這些多酚可以以混合物的形式使用，混合物包括大量多酚化合物，或可以以單獨化合物的形式使用。可以分離或制備這些多酚化合物，使其具有更高的濃度，而后使用。對于分離多酚化合物的方法和制備更高濃度多酚化合物的方法沒有特別限制。這種方法的例子包括HPLC、合成吸附色譜、離子交換色譜法和凝膠過濾。尤其是，優選合成吸附色譜。
作為含有來源于西印度櫻桃果實的多酚化合物的西印度櫻桃果實的加工產品、由西印度櫻桃果汁等等通過上述各種形式色譜中的一種分餾的含有這種多酚化合物的餾份，可以適當地用于本發明。具體地說，從西印度櫻桃果汁等等處獲得的C18柱(疏水性柱)-吸附的餾份，優選用于本發明中。含有來源于西印度櫻桃果實的多酚的餾份例如C18柱吸附的餾份的例子包括洗脫液、其濃縮物和其干制品。
通常，認為多酚化合物高度不溶于水。用于本發明中的西印度櫻桃加工產品含有處于容易溶于水狀態的多酚。
通常，抗壞血酸不能單獨充當脂質的抗氧化劑(參見實施例2中的實驗2.7)，這是由于其具有高水溶性。然而，人們認為，在西印度櫻桃加工的產品中，抗壞血酸起脂質的抗氧化劑的作用(參見實施例2中的實驗2.9)。
4.按照本發明的抗氧化劑的使用方法 如上所述，來源于西印度櫻桃果實的(a)果膠或其水解物，(b)C18柱吸附的組份和(c)抗壞血酸，用作抗氧化劑活性組分。
優選，本發明的抗氧化劑含有至少一種、更優選含有2種、最優選含有組分(a)(b)和(c)的全部。
在實施例2的實驗2.1中，通過從西印度櫻桃果汁中除去葡萄糖和果糖、而后將生成物粉末化制備的這種物質，含有組分(a)、(b)和(c)，并且具有出色的抗氧化活性。該物質是本發明的抗氧化劑(具體地說，脂質的抗氧化劑)的優選實施方案。
本發明的抗氧化劑是水溶性的。由此，當生產加工的產品例如魚、家畜肉、和谷物(這些常常形成脂肪和油以及水基組分的混合系統)、鹽腌食品和含有脂肪和油的作料時，該抗氧化劑可以適當地用作脂質的抗氧化劑。此外，當在相同條件下比較時，在實施例2的實驗2.1中制備的西印度櫻桃粉末具有優于α-生育酚(維生素E)的抗氧化活性(對于脂質)，被稱為脂質-可溶性抗氧化劑(參見實施例2中的實驗2.6)。
本發明進一步涉及含有上述說明的抗氧化劑、具有增加的氧化穩定性的食品，和制備這種食品的方法。本發明的抗氧化劑可以在含有脂質(具體地說，容易氧化的脂質)的食品生產中用作添加劑。這種食品的例子包括含有不飽和脂肪酸例如亞油酸和亞麻酸的加工的產品，例如魚、家畜肉和谷物、鹽腌的食品和作料(例如調味品)。對于加入這種添加劑的方法沒有具體的限制。例如，當生產加工的食品時，可以將這種添加劑加入到腌汁溶液、作料或食品原料中。
本發明的抗氧化劑不但可以以食品添加劑的形式使用，而且可以以充當體內抗氧化劑的食品或藥物制劑的形式使用。此外，可以按照傳統方法、以合適的食品或制劑形式制備抗氧化劑，如果需要的話，可以使用合適的載體、賦形劑等等。
這種形式的食品可以是飲料、固體食品或半固體食品。飲料的具體例子包括天然果汁飲料、軟飲料和酒精飲料。另外，在攝取之前，飲料也可以是用水稀釋的形式，等等。固體或半固體食品的例子包括片劑，糖衣片，顆粒，粉末狀食品例如粉末飲料和粉末湯，塊狀糖食例如餅干，膠囊，和凝膠劑。根據需要，通常用于食品加工中的各種添加劑還可以是復合的。這種添加劑的例子包括穩定劑，pH值調節劑，糖，甜味劑，香料，各種維生素，礦物質，抗氧化劑，賦形劑，增溶劑，結合劑，潤滑劑，懸浮液，濕潤劑，成膜物質，味道矯正劑，香味矯正劑，色料，和防腐劑。
可以按照傳統方法，以制劑的形式制備本發明的抗氧化劑。在這種情況下，可以從常規物質之中充分選擇載體、賦形劑、結合劑、防腐劑、氧化穩定劑、崩解劑、潤滑劑、味道矯正劑或稀釋劑。對于這種制劑的形式沒有具體限制，可以根據需要充分地選擇。通常可以將本發明的抗氧化劑配制為口服制劑，包括片劑，膠囊，顆粒，微粒劑，粉末，丸劑，液體，糖漿劑，懸浮液，乳狀液，酏劑，等等，或腸胃外的制劑，包括注射劑，滴劑，栓劑，吸入劑，透皮吸附藥，轉化粘液質吸附藥，經鼻制劑，腸內制劑，粘附劑，油膏，等等。
5.按照本發明的口服皮膚增白劑的使用方法 如上面2中所述，來源于西印度櫻桃果實的果膠或其水解物用作口服皮膚增白劑的活性組分。
同時，眾所周知，在西印度櫻桃果實中富含的抗壞血酸也可以用作口服皮膚增白劑的活性組分。
更優選，除了來源于西印度櫻桃果實的果膠或其水解物之外，本發明的口服皮膚增白劑還含有抗壞血酸。
含有來源于西印度櫻桃果實的果膠的水解物和抗壞血酸的口服皮膚增白劑，可以使用各自獨立制備的來源于西印度櫻桃果實的果膠的水解物和抗壞血酸來制備。另外，還可以通過下列方法制備皮膚增白劑。具體地說，這種方法包括將西印度櫻桃果實或含有抗壞血酸和果肉渣的西印度櫻桃果實的加工產品水解的步驟。具體地說，在此步驟中，將果肉渣中的果膠水解，使得相對于抗壞血酸的半乳糖醛酸的量是5％重量或更多。本文中，“果肉渣”是指包含在果實中的纖維性組份。這種果肉渣通常含有纖維骨架例如果膠或纖維素作為主要成分，并且具有一定結構，以使其它組分與骨架以各種模式結合。當果膠被水解時，可以提高游離半乳糖醛酸的量。由此，產生的半乳糖醛酸的量可以是果膠水解進展的一個指標。在本發明的實施方案中，優選進行果膠水解，以使相對于抗壞血酸的半乳糖醛酸的量是5％重量或更多，且更優選10％重量。對于水解程度沒有具體的上限。這種水解的典型程度，是相對于抗壞血酸的半乳糖醛酸的量是20％重量或更小。此外，可以通過滴定試驗來定量抗壞血酸，在滴定試驗中，藍色的0.02％2，6-二氯靛酚水溶液轉變為無色，這是由于抗壞血酸的還原效果。半乳糖醛酸可以通過3，5-二甲苯酚方法進行定量，如實施例3所述。
優選，按照本發明的口服皮膚增白劑是基本上除去葡萄糖和果糖的藥劑。當基本上除去這些糖時，加工(粉末化)的產品具有更低的吸濕性。由此，這種藥劑具有以下優點它能夠允許加入較低數量的賦形劑等等，并由此能夠增加活性組分的比例。此外，按照本發明的皮膚增白劑是口服攝取的。由此，由于除去糖的結果，該藥劑具有更低的卡路里，這也是適宜的。表述“基本上除去葡萄糖和果糖”，是指當將加工的產品粉末化時，將葡萄糖和果糖除去到一定程度，以使吸濕性充分降低。
可以通過例如使用酵母發酵的方法除去葡萄糖和果糖。在發酵中，葡萄糖和果糖轉變為二氧化碳氣和乙醇，而后除去。因為皮膚增白劑的有用組分例如抗壞血酸沒有失去，通過發酵除去糖的這種步驟是有利的。降解果肉渣的步驟和除去糖的步驟可以以這種順序進行，反之亦然，或可以同時進行這兩個步驟。
本發明的口服皮膚增白劑可以獨自使用，或與其它組分以食品或飲料組合物或藥物組合物的形式組合使用。舉例來說，希望皮膚增白劑不但有助于皮膚增白，而且可以產生預防皮膚老化或預防或治療皮膚癌的效果。
食品或飲料組合物形式的例子包括飲料、固體食品和半固體食品。這種組合物也可以是用于特定健康用途的營養增補劑或食品的形式。飲料的具體例子包括果汁飲料、軟飲料和酒精飲料。另外，在攝取之前，食品飲料組合物可以是用水稀釋的形式，等等。固體食品可以是各種形式。這種形式的例子包括片劑例如糖果和錠劑，糖衣片，顆粒，粉末例如粉末飲料和粉末湯，塊狀糖食例如餅干，膠囊，和凝膠劑。半固體食品形式的例子包括膏劑例如果醬和膠質例如口香糖。除了本發明的皮膚增白劑之外，這些食品或飲料組合物還可以與通常用作食品起始原料的各種成份在使得本發明的最佳效果沒有退化的范圍之內混合。這種成份的例子包括水、醇、甜味劑、酸化劑、色料、防腐劑、芳香劑和賦形劑。這些成份可以單獨使用或兩種或多種組合使用。
對于藥物組合物的形式沒有具體限制，只要該形式是口服制劑。可能形式的例子包括粉末、片劑、顆粒、微粒劑、液體、膠囊、丸劑、錠劑、內服使用的液劑、懸浮液、乳狀液、糖漿液和酏劑。根據癥狀，制劑的這些形式可以單獨使用或兩種或多種組合使用。可按照傳統方法制備出這些制劑形式中的每種制劑。在這種情況下，可以從慣用的物質之中充分選擇使用的載體、賦形劑、結合劑、防腐劑、氧化穩定劑、崩解劑、潤滑劑、味道矯正劑或稀釋劑等等。例如，當進行粉末化時，可以使用貝殼鈣增加流動性。
可以按照癥狀和目的適當地選擇按照本發明的口服皮膚增白劑的劑量。當藥劑用作抑制色素淀積(由于斑點或曬斑)的藥物制劑時，優選，攝取按照本發明的口服皮膚增白劑的劑量，可以使抗壞血酸的攝取劑量在每天300毫克至600毫克的范圍。
實施例1 實驗1.1.從果汁中收集抗氧化果膠 實驗1.1.1.從桃汁、葡萄柚汁、檸檬汁和葡萄汁中收集果膠 使用切刀從用作樣品的果實中除去果皮和籽，以便只獲得食用部分。緊接著，使用榨汁器粉碎可食部分。在4950rpm和20℃條件下，將粉碎產品離心60分鐘。使用0.2μm過濾器，將各個上清液過濾，由此收集純的果汁溶液。將乙醇加入到果汁溶液中，加入量為溶液重量的3倍。然后攪拌混合物，在室溫下靜置過夜，而后在20℃、在4950 rpm下離心20分鐘，由此收集沉淀。該沉淀是來源于果汁樣品的果膠。此外，為了增加果膠的純化度，將沉淀溶于凈化水中，凈化水的數量大于沉淀10或更多倍。將乙醇加入到溶液中，加入數量是總重量的兩倍。攪拌該溶液，在室溫下靜置30分鐘，而后在20℃、在4950 rpm下離心20分鐘，由此收集沉淀。將沉淀通過冷凍干燥進行干燥，以便收集來源于果汁樣品的果膠。在各個實驗中所使用的樣品數量和收集的果膠數量列于表1中。
表1 實驗1.1.2.從綠色西印度櫻桃果汁中收集果膠 使用果肉渣精軋機，從不成熟的綠色西印度櫻桃果實(當它們形成紅色時，在成熟之前是綠色至黃色)除去籽，由此制備果泥。將18337克果泥在4200rpm、在20℃下離心45分鐘，而后收集上清液。使用0.2μm過濾器過濾上清液，以便收集13632克純的果汁溶液。由于溶液的量是過量的，使用真空蒸餾設備將溶液濃縮。由此，收集4258克溶液。將乙醇加入到果汁溶液中，加入量為溶液重量的3倍。然后攪拌該混合物，而后在室溫下放置過夜。使用不銹鋼網收集固體。為了增加果膠的純化度，將沉淀溶于凈化水中，將乙醇加入到溶液中，加入數量是總重量的兩倍，而后攪拌該混合物。將生成物在室溫下靜置30分鐘，而后在20℃、在4200rpm下離心30分鐘，由此收集沉淀。為了進一步提高果膠的純化度，將沉淀溶于凈化水中，將乙醇加入到溶液中，加入量為溶液重量的3倍，而后攪拌該混合物。將生成物在室溫下靜置30分鐘，而后在20℃、在4200rpm下離心30分鐘，由此收集沉淀。總計進行3次乙醇沉淀法。將沉淀通過冷凍干燥進行干燥，由此收集19.7克來源于綠色西印度櫻桃果汁的果膠。
實驗1.1.3.抗氧化效能的評價 通過試驗方法1中描述的有關抑制β-胡蘿卜素褪色的試驗、和試驗方法2中描述的DPPH自由基清除活性試驗來評價5種來源于果汁的果膠。表2顯示了結果。一種結果是所有種類的果膠產生抑制β-胡蘿卜素褪色的效果，其是抗氧化的效果。然而，只有在來源于西印度櫻桃果汁的果膠中觀察到強烈的DPPH自由基清除活性。這種來源于西印度櫻桃果汁的果膠具有DPPH自由基清除效果，因此預計其可以具有針對許多目標的抗氧化效能。如上所述，顯示了抗氧化果膠可以通過進行乙醇沉淀法、由沒有失去抗氧化活性的西印度櫻桃果汁產生。
表2 來源于果汁的果膠的抗氧化活性 實驗1.2.從果肉渣中收集抗氧化果膠 實驗1.2.1.從桃子果肉渣、葡萄柚果肉渣、檸檬果肉渣和葡萄果肉渣中收集果膠 使用切刀從用作樣品的果實中除去果皮和籽，以便只獲得食用部分。緊接著，使用榨汁器粉碎可食部分。在4950rpm和20℃條件下，將粉碎產品離心60分鐘，由此收集沉淀。沉淀是來源于果實的果肉渣。將果肉渣量3.5至8倍的凈化水加入到果肉渣中，以便能夠攪拌。攪拌生成物，而后加入濃鹽酸，調節生成物pH值至2.0。將生成物在80℃加熱2小時，同時攪拌生成物，而后在室溫下過夜攪拌。在4950rpm和20℃條件下，將該溶液離心60分鐘，由此收集上清液。使用0.2μm過濾器過濾上清液，以便收集純的果膠提取物。將乙醇加入到提取物中，加入數量是提取物重量的兩倍。然后攪拌混合物，在室溫下靜置過夜，而后在20℃、在4950rpm下離心20分鐘，由此收集沉淀。該沉淀是來源于果肉渣樣品的果膠。此外，為了增加果膠的純化度，將沉淀溶于凈化水中，凈化水的數量大于沉淀10或更多倍。加入乙醇，加入數量是總重量的兩倍，而后攪拌生成物。將生成物在室溫下靜置30分鐘，而后在20℃、在4950rpm下離心20分鐘，由此收集沉淀。將沉淀通過冷凍干燥進行干燥，以便收集來源于果肉渣樣品的果膠。在各個實驗中所使用的樣品數量和收集的果膠數量列于表3中。
表3 實驗1.2.2從綠色西印度櫻桃果肉渣中收集果膠 使用果肉渣精軋機，從不成熟的綠色西印度櫻桃果實(當它們形成紅色時，在成熟之前是綠色至黃色)除去籽，由此制備果泥。將18337克果泥在4200rpm、在20℃下離心45分鐘，而后收集3386克沉淀。沉淀是西印度櫻桃果肉渣。將果肉渣量5倍的凈化水加入到果肉渣中，以便能夠攪拌。然后攪拌該混合物。加入濃鹽酸，調節生成物pH值至2.0。將生成物在80℃加熱2小時，同時攪拌生成物，而后在室溫下過夜攪拌。在4200rpm和20℃條件下，將該溶液離心30分鐘，由此收集上清液。使用0.2μm過濾器過濾上清液，以便收集純的果膠提取物。將乙醇加入到溶液中，加入數量是溶液重量的兩倍，而后攪拌該混合物。將混合物在室溫下放置過夜，而后使用不銹鋼網收集固體。為了增加果膠的純化度，將沉淀溶于凈化水中，將乙醇加入到溶液中，加入數量是總重量的兩倍，而后攪拌該混合物。將混合物在室溫下靜置30分鐘，而后在20℃、在4200rpm下離心30分鐘，由此收集沉淀。為了進一步提高果膠的純化度，將沉淀溶于凈化水中，將乙醇加入到溶液中，加入數量是總重量的兩倍，而后攪拌該混合物。將混合物在室溫下靜置30分鐘，而后在20℃、在4200 rpm下離心30分鐘，由此收集沉淀。總計進行3次乙醇沉淀法。將沉淀通過冷凍干燥進行干燥，由此收集38.63克來源于綠色西印度櫻桃果肉渣的果膠。
實驗1.2.3.抗氧化效能的評價 通過試驗方法1中描述的有關抑制β-胡蘿卜素褪色試驗和試驗方法2中描述的DPPH自由基清除活性試驗，評價5種來源于果肉渣的果膠的抗氧化效能。表4顯示了結果。結果是，所有種類的果膠都產生抑制β-胡蘿卜素褪色的效果，其是一種抗氧化效果。然而，只有在來源于西印度櫻桃果肉渣的果膠中觀察到強烈的DPPH自由基清除活性。這種來源于西印度櫻桃果肉渣的果膠具有DPPH自由基清除效果，因此預計其可以具有針對許多目標氧化的抗氧化效能。如上所述，顯示了這種抗氧化果膠可以通過使用酸進行熱處理和乙醇沉淀法、由沒有失去抗氧化活性的西印度櫻桃果肉渣產生。
表4 來源于果肉渣的果膠的抗氧化活性 實驗1.3.來源于不同成熟度的西印度櫻桃果實的抗氧化果膠的評價 通過DPPH自由基50％清除活性試驗(參見試驗方法2)，評價來源于綠色-果實-果汁的果膠和來源于綠色-果實-果肉渣的果膠(由綠色西印度櫻桃果實獲得，按照上面的1.1和1.2制備)的抗氧化活性。此外，利用相同試驗，評價由已經充分成熟、形成紅色的成熟西印度櫻桃果實、通過下列方法制備的果膠的抗氧化活性。
實驗1.3.1.從成熟西印度櫻桃的果汁中采集果膠 使用果肉渣精軋機，從已經充分成熟、形成紅色的成熟西印度櫻桃果實中除去籽，由此制備果泥。將21861克果泥在4200rpm、在20℃下離心45分鐘，而后收集上清液。使用0.2μm過濾器過濾上清液，以便收集15324克純的果汁溶液。由于溶液的量是過量的，使用真空蒸餾設備將溶液濃縮。由此，收集5618克濃縮液。將乙醇加入到果汁溶液中，加入數量大于溶液重量3倍。然后攪拌該混合物，而后在室溫下放置過夜。使用不銹鋼網收集固體。為了增加果膠的純化度，將沉淀溶于凈化水中，將乙醇加入到溶液中，加入數量是總重量的兩倍，而后攪拌該混合物。將混合物在室溫下靜置30分鐘，而后在20℃、在4200rpm下離心30分鐘，由此收集沉淀。為了進一步提高果膠的純化度，將沉淀溶于凈化水中，將乙醇加入到溶液中，加入數量大于總重量的3倍，而后攪拌該混合物。將混合物在室溫下靜置30分鐘，而后在20℃、在4200rpm下離心30分鐘，由此收集沉淀。總計進行3次乙醇沉淀法。將沉淀通過冷凍干燥進行干燥，由此收集39克來源于成熟西印度櫻桃果汁的果膠。
實驗1.3.2.從成熟西印度櫻桃果實的果肉渣中采集果膠 使用果肉渣精軋機，從已經充分成熟、形成紅色的成熟西印度櫻桃果實中除去籽，由此制備果泥。將21861克果泥在4200rpm、在20℃下離心45分鐘，而后收集5022克沉淀。這些沉淀物是西印度櫻桃果肉渣。將凈化水加入到果肉渣中，數量大于果肉渣5倍，以便能夠攪拌。然后攪拌該混合物。加入濃鹽酸，調節生成物pH值至2.0。將生成物在80℃加熱2小時，同時攪拌，而后在室溫下過夜攪拌。在4200rpm和20℃條件下，將該溶液離心30分鐘，由此收集上清液。使用0.2μm過濾器過濾上清液，以便收集純的果膠提取物。由于溶液的量是過量的，通過真空蒸餾將溶液濃縮。由此，收集9159克溶液。將乙醇加入到溶液中，加入數量是溶液重量的兩倍。然后攪拌該混合物，而后在室溫下放置過夜。使用不銹鋼網收集固體。為了增加果膠的純化度，將沉淀溶于凈化水中，將乙醇加入到溶液中，加入數量是總重量的兩倍，而后攪拌該混合物。將混合物在室溫下靜置30分鐘，而后在20℃、在4200rpm下離心30分鐘，由此收集沉淀。為了進一步提高果膠的純化度，將沉淀溶于凈化水中，將乙醇加入到溶液中，加入數量是總重量的兩倍，而后攪拌該混合物。將混合物在室溫下靜置30分鐘，而后在20℃、在4200rpm下離心30分鐘，由此收集沉淀。總計進行3次乙醇沉淀法。將沉淀通過冷凍干燥進行干燥，由此收集26克來源于成熟西印度櫻桃果實的果肉渣的果膠。
實驗1.3.3.抗氧化效能的評價 通過DPPH自由基50％清除活性試驗，評價4種來源于西印度櫻桃的果膠的抗氧化活性。表5顯示了結果。各個試驗結果說明了需要清除50％DPPH自由基的樣品的濃度。它表示，樣品的濃度越低、相關果膠的抗氧化效能越強。結果是，在所有種類的果膠中，觀察到了足夠的抗氧化效能。然而，來源于綠色果實的果膠的抗氧化效能，比來源于成熟果實的果膠的抗氧化效能更強。因此，可以斷定，綠色西印度櫻桃果實更適宜作為抗氧化果膠提取物的原料。
表5 具有不同成熟度的西印度櫻桃果實果膠的抗氧化效能 實驗1.4.通過果膠酶處理來制備抗氧化果膠的方法 使用果肉渣精軋機(將果汁和果肉渣與籽分離的裝置)，用綠色西印度櫻桃果實制備西印度櫻桃果泥，而后冷凍保存。將西印度櫻桃果泥解凍。將19899克解凍的西印度櫻桃果泥升溫至室溫。將0.1％(W/W)果膠酶(果膠酶A“Amano”，Amano Enzyme Inc.)加入到生成物中，而后在50℃攪拌2小時。在室溫下繼續攪拌，直到第二天為止。將酶處理的果泥離心(4950rpm和30分鐘)，由此收集上清液。為了除去不能溶解的組分，將上清液過濾幾次，而后最終用0.2μm過濾器過濾。由此，通過過濾收集17420克果汁。然后使用真空蒸餾和濃縮裝置將溶液濃縮，以便收集2981克濃縮液。將乙醇加入到濃縮液中，加入量為濃縮液重量的4倍。在室溫下將溶液靜置1或更多天，而后離心(4950rpm和5分鐘)，由此收集600克(含水)乙醇沉淀物(第一次)。將凈化水加入到乙醇沉淀物中，加入量為沉淀物重量的20倍，以便將沉淀溶解。將乙醇進一步加入到沉淀中，加入數量是沉淀重量的兩倍，而后將生成物冷藏1或更多天。使用玻璃纖維過濾器過濾溶液。收集544克殘留在濾紙上的第二次乙醇沉淀物(含水)。將凈化水加入到沉淀中，然后將沉淀溶解。將乙醇加入到溶液中，相對于溶液，加入數量相等，而后將生成物冷藏1或更多天。使用玻璃纖維過濾器過濾溶液。收集434克殘留在濾紙上的第三次乙醇沉淀物(含水)。將沉淀在-80℃冷凍。沉淀完全冷凍后，進行冷凍干燥。由此，收集78克來源于西印度櫻桃的果膠粉。
由此獲得的來源于西印度櫻桃的果膠的抗氧化效能，可與來源于綠色-果實-果汁的果膠和來源于綠色-果實-果肉渣的果膠(從綠色西印度櫻桃果實處獲得，按照實驗1.1和1.2制備)相比較。
通過DPPH自由基50％清除效能試驗(試驗方法2)，評價各個果膠的抗氧化效能。表6顯示了結果。
表6 抗氧化果膠的收集比例(％)和抗氧化活性 *得自于綠色果汁的果膠和得自于綠色果實果肉渣的果膠，是用相同果泥制備的。
當果泥分離為果汁和果肉渣、且從其各自中收集果膠時，全部果膠收集比例(％)是0.32％(＝0.11％+0.21％)。同時，說明可以獲得更高的收集比例(％)，以使該實驗中的果膠酶處理的果膠的收集比例(％)是0.39％。此外，果膠酶處理的果膠(在該實驗中獲得)也具有足夠的抗氧化活性。
實驗1.5.通過超濾法制備抗氧化果膠溶液的方法 使用果肉渣精軋機(將果汁和果肉渣與籽分離的裝置)，用綠色西印度櫻桃果實制備西印度櫻桃果泥，而后冷凍保存。將西印度櫻桃果泥解凍。將55000克解凍的西印度櫻桃果泥升溫至室溫。將0.1％(W/W)果膠酶(果膠酶A“Amano”，Amano Enzyme Inc.)加入到生成物中，而后在50℃攪拌2小時。在室溫下繼續攪拌，直到第二天為止。將酶處理的果泥離心(4950rpm和30分鐘)，由此收集上清液。為了除去不能溶解的組分，將上清液過濾幾次，而后最終用0.2μm過濾器過濾。由此，收集47130克果汁。使用具有分子量分離點為10,000的超濾膜(Hydrosart 10K，SARTORIUS K.K.)，對收集的產品進行超濾法。由此，收集8730克濃縮液。
濃縮液中的固體濃度是11.77％(蒸發后殘余物的濃度)。對濃縮液進行乙醇沉淀法，以便收集抗氧化果膠。從500克濃縮液中收集16.87克抗氧化果膠。證明濃縮液中的抗氧化果膠含量是3.374％。基于這種濃度，計算濃縮液中的果膠重量是294.2克。基于果泥的重量，計算所收集果膠的百分比是0.53％。顯示這種收集比例(％)比在實驗1.4中所使用制備方法的條件下的收集比例(％)好。此外，在該實驗中，按照抗氧化果膠溶液中的總固形物含量的百分比，抗氧化果膠含量是28.7％。在超濾法的情況下，可以通過改變儲備溶液量與最終濃縮液量的比例來調節這種含量。
實驗1.6.用實驗1.5制備的溶液來制備西印度櫻桃粉末的方法 將實驗1.5中制備的來源于西印度櫻桃的抗氧化果膠的600克濃縮液冷凍，而后將生成物通過冰凍干燥法進行冷凍干燥。結果，收集63克粉末。濃縮液中的固體的濃度是11.77％。由此，理論上的固體含量是70.62克，收集比例(％)是89.2％。粉末中的抗壞血酸的濃度是21.06％，通過靛酚法測定。基于濃縮液中的抗氧化果膠含量，計算粉末中的抗氧化果膠濃度是28.7％。冷凍干燥后，可以在良好的條件下將由此獲得的粉末精細地研磨，表現出不顯著的吸濕性，并且流動性極好。人們認為，抗氧化果膠充當了賦形劑。
實驗1.7.來源于西印度櫻桃的抗氫化果膠中的多酚的檢驗(1) 將實驗1.4中制備的10克來源于西印度櫻桃的抗氧化果膠粉溶于500毫升2N氫氧化鈉水溶液中，而后使用恒溫振動器、在40℃水解16小時。為了進一步提高酸性多酚的溶解度，加入濃鹽酸，調節溶液的pH值至2.0。為了除去源于果膠的游離糖含量，將乙醇加入到溶液中，數量大于溶液重量的4倍。在冷藏室中，將溶液靜置1或更多天，以便進行乙醇沉淀法。在與果膠收集所應用的相同條件下進行該方法，以便只有通過強堿水解的產物保持未沉淀，并且以游離狀態存在于上清液之中。將已經加入乙醇的溶液離心(4200rpm和30分鐘)，以便引起固體內含物沉淀，收集上清液。使用0.45μm過濾器過濾上清液，由此完全除去固體內含物。通過真空蒸餾來濃縮濾液，收集250毫升濃縮液。將可以吸收多酚的兩個C18柱(Sep-Pak Vac 35 cc(10g)C18柱體，WatersCorporation)的每一個裝載一半數量的濃縮液。將未被吸收的組分用凈化水洗滌后，使用25％甲醇水溶液洗脫被吸收的組分。干燥洗脫液，而后使用真空蒸餾設備固化。將生成物溶于5毫升100％甲醇中，由此制備果膠提取物樣品。使用分析HPLC柱(4.6mm×250mm，ODS-3，GLSciences Inc.)和0.01N鹽酸水溶液與甲醇的線性梯度來分析樣品中的組分。圖1說明了結果。
通過該分析，證明在22.4分鐘處存在主要組分。緊接著，使用制備柱，對4.5毫升果膠提取物樣品進行制備分離。ODS-3(20mm×250mm，GL Sciences Inc.)用作這種制備柱。使用0.01N鹽酸水溶液和甲醇的梯度、流速12毫升/分鐘，進行制備分離。圖2說明了制備分離的結果。
收集圖2中的33.46分鐘峰值處的物質，干燥并使用真空蒸餾設備固化，溶于凈化水中，而后在冷藏室放置過夜。將由此產生的沉淀離心，由此收集28毫克沉淀。此外，將沉淀溶于甲醇中。然后使用配有光二極管矩陣檢測器、分析HPLC柱(4.6mm×250mm，ODS-3，GL SciencesInc.)的HPLC系統，和已經加入0.05％TFA的0.05％TFA水溶液和甲醇的線性梯度，分析樣品的組分。圖3說明了結果。結果證明，上述沉淀是果膠提取物樣品的主要組分。
此外，證明了圖3所示22.4分鐘處的峰值的波譜數據(圖4A)。由此，顯示了數據幾乎與Aceronidin(參考實施例1)的波譜數據(圖4B)一致。此外，使用包括HPLC裝置(本文中使用的裝置是LC-2010CHT(ShimadzuCorporation))(帶有包括在其中的光二極管矩陣檢測器(PDA；本文中使用的檢測器是SPD-M20A(Shimadzu Corporation)))收集示于圖4A和B中的波譜數據。
結果顯示，基于以上所述HPLC洗脫時間和波譜數據，包含在來源于西印度櫻桃的抗氧化果膠中的多酚很可能是Aceronidin。
實驗1.8.來源于西印度櫻桃的抗氧化果膠中的多酚的檢驗(2) 通過ESI-MS測定和NMR測定，進一步分析從來源于西印度櫻桃的抗氧化果膠中提取的多酚的結構。當使用LCT質譜儀(Micromass)分析分子量時，以類似于Aceronidin情況下的方式觀察m/z 473(鈉加合離子(M+Na)+)。由此證明，該多酚與具有450分子量的Aceronidin相同。此外，作為1H NMR測定的結果，在3.3ppm和4.8ppm附近觀察源于溶劑的峰值(圖5中的下面的圖)。其顯示這些峰值與Aceronidin峰值(圖5中的上面的圖)符合很好。
如上所述，證明從來源于西印度櫻桃的抗氧化果膠中提取的多酚是Aceronidin。
實驗1.9.來源于西印度櫻桃的、C18柱結合的果膠的制備 將在實驗1.4中制備的50克來源于西印度櫻桃的果膠溶于5000毫升1％六偏磷酸鈉水溶液中。使用0.2μm過濾器過濾生成物。將濾液裝載到二十個C18柱(Sep-Pak Vac 35cc(10g)C18柱體，WatersCorporation)上。將未被吸收的組分用凈化水洗滌，而后使用50％甲醇水溶液洗脫被吸收的組分。干燥洗脫液，而后使用真空蒸餾設備固化。將生成物溶于凈化水中，而后使用0.2μm過濾器除去不溶物質。然后將生成物冷凍并冷凍干燥，由此獲得6.24克冷凍干燥的粉末。
對實驗1.4中制備的來源于西印度櫻桃的果膠(樣品1)和在該實驗中制備的來源于西印度櫻桃的C18柱結合果膠(樣品2)的多酚濃度、DPPH自由基清除活性、酪氨酸酶抑制活性和糖組成，進行各自分析。通過Folin-Denis方法，使用兒茶素作為標準物質，測定多酚濃度。通過試驗方法2分析DPPH自由基清除活性，通過試驗方法3進行酪氨酸酶-抑制活性試驗，通過試驗方法4分析糖組成。
表7 多酚的含量和活性、來源于西印度櫻桃的抗氧化果膠的因素 表8 糖組成(糖組成百分比(％)) 基于表7和8中的結果，人們認為來源于西印度櫻桃的抗氧化果膠由主鏈和側鏈組成，其中主鏈主要由多聚半乳糖醛酸組成，側鏈主要由中性糖組成。基于分析C18樹脂結合組分的結果，人們認為多酚可能主要存在于側鏈中。具有高多酚含量的樣品2也具有強烈的抗氧化活性和強烈的皮膚增白效果。由此，認為這種抗氧化活性和皮膚增白效果是由于Aceronidin的效果。然而，在Aceronidin中，幾乎觀察不到皮膚增白效果(抑制酪氨酸酶的效果)。因此，顯示皮膚增白效果表現了來源于西印度櫻桃的抗氧化果膠的獨特活性。
試驗方法1.1.與抑制β-胡蘿卜素褪色有關的試驗 該方法是測定試驗物質如何抑制亞油酸的過氧化物引起β-胡蘿卜素褪色的效果的方法。在該實驗中，將0.48毫升10％(W/V)亞油酸/氯仿溶液、1.2毫升0.01％(W/V)β-胡蘿卜素/氯仿溶液和2.4毫升20％(W/V)tween 40/氯仿溶液放進200毫升依氏燒瓶中，而后混合。將混合物用氮氣吹掃，以除去氯仿。然后混合108毫升凈化水和12毫升0.2M磷酸鈉緩沖液(pH值6.8)。將由此制備的溶液用作亞油酸溶液。將稀釋至適宜濃度的0.1毫升樣品加入到4.9毫升亞油酸溶液中，然后將生成物混合。在470納米處測定吸光度，測定值表示0分鐘時的值。測定后，在50℃恒溫槽中立即加熱生成物。120分鐘以后，在470納米處測定吸光度。測定值表示120分鐘時的值。使用凈化水(用其稀釋樣品)代替樣品來測定空白試驗值。通過下列方程式計算β-胡蘿卜素褪色抑制比(％)。
β-胡蘿卜素褪色抑制比(％) ＝100-(1-(0分鐘時的樣品值-120分鐘時的樣品值)/((0分鐘時的空白試驗值-120分鐘時的空白試驗值))×100 試驗方法1.2.DPPH自由基清除活性試驗 使用穩定的diphenyl-p-picrylhydradil(DPPH)的乙醇溶液評價抗氧化活性。將1200μl乙醇和400μl樣品(調節至任一濃度)與1600μl的250mM乙酸鹽緩沖液(pH值＝5.5)混合，而后在30℃預培育5分鐘。將800μl的500μM DPPH/乙醇溶液加入到該溶液中，并與其混合，然后在30℃將生成物靜置30分鐘。在517納米處測量吸光度。對于α-生育酚也進行類似的方法，而后將該結果用作陽性對照。本文中使用的對照物是使用溶劑代替樣品溶液、通過進行類似的方法來制備的。通過下列方程式、使用由此測定的吸光度來計算自由基清除比例。
清除比例(％)＝(1-[樣品的吸光度]/[對照物的吸光度])×100 得到清除比例的上述測定是通過逐步改變溶液中的樣品濃度來測定的。發現引起50％DPPH自由基清除比例的樣品溶液的濃度，并指示需要清除50％DPPH自由基所需要的濃度。由此，可以說數字值越低、自由基清除能力越高。
試驗方法1.3.抑制酪氨酸酶的效果(皮膚增白活性) 通過下列方法進行與抑制酪氨酸酶的活性有關的試驗，酪氨酸酶是產生黑色素的酶。
(1)將*4毫升L-DOPA水溶液、**4毫升以不同濃度稀釋的各個樣品、和2毫升0.2 M磷酸鹽緩沖液(pH值6.8)混合。將混合物在37℃恒溫槽中加熱。將此加熱的混合物作為樣品混合物。
*L-DOPA水溶液將L-β-(3，4-二羥苯基)丙氨酸(Wako PureChemical Industries，Ltd)溶于0.2 M磷酸鹽緩沖液(pH值6.8)中，濃度為3mM 使用0.2 M磷酸鹽緩沖液將**樣品全部稀釋，并溶解。
(2)將在37℃加熱的2.5毫升樣品混合物和*0.5毫升酪氨酸酶溶液放進吸收分光計的小池中，而后在475納米處測定。使用kinetics軟件進行測定。從開始至結尾每隔0.1秒鐘自動測定吸光度的變化，進行20秒鐘。開始測定后，計算4秒鐘和10秒鐘之間的吸光度的升高速度。*酪氨酸酶溶液將來源于蘑菇的酪氨酸酶(SIGMA)溶解在0.2M磷酸鹽緩沖液(pH值6.8)中，濃度為300單位/毫升，而后使用0.2μm過濾器進行過濾，獲得溶液 (3)為了獲得空白試驗值，使用0.2M磷酸鹽緩沖液代替樣品進行測定，而后通過下面的方程式計算酪氨酸酶-抑制活性。此外，將不能溶于磷酸鹽緩沖液的物質溶于二甲亞砜(DMSO)中，用磷酸鹽緩沖液稀釋，而后測定。使用含有相同濃度DMSO的空白試驗的測量結果進行計算。
酪氨酸酶活性抑制比率(％) ＝100-((樣品的吸光度升高速度)/(空白試驗的吸光度升高速度))×100 試驗方法1.4.糖組成分析 如下進行分析。將2N三氟乙酸加入到各個樣品中，而后在100℃進行水解6小時。使用凈化水收集由此水解的中性糖和糖醛酸，而后進行HPLC方法。分析條件如下。
中性糖分析條件 檢測器熒光分光光度計 柱TSK-gel Suger AXG 4.6mm×150mm(TOSOH Corporation) 流動相0.5M硼酸鉀緩沖液，pH值8.7 流動相流速0.4mL/min 柱后標記反應試劑1％精氨酸/3％硼酸 反應試劑流速0.5mL/min 反應溫度150℃ 檢測波長EX.320nm，EM.430nm 糖醛酸分析條件 檢測器熒光分光光度計 柱Shimpack ISA07 4.6mm×250mm(Shimadzu Corporation) 流動相1.0M硼酸鉀緩沖液，pH值8.7 流動相流速0.8mL/min 柱后標記反應試劑1％精氨酸/3％硼酸 反應試劑流速0.8mL/min 反應溫度150℃ 檢測波長EX.320nm，EM.430nm 作出中性糖和糖醛酸的校準曲線，而后基于該曲線測定樣品的糖含量。在該分析中，不是所有的糖鏈都能夠水解，部分糖可能被水解，但未被檢測出。
參考實施例Aceronidin的分離和鑒定 (1)Aceronidin的分離 用于制備Aceronidin的原料是西印度櫻桃粉末(NichireiCorporation，Nichirei西印度櫻桃粉末VC30)，該西印度櫻桃粉末是使用酵母將濃縮西印度櫻桃果汁發酵、除去葡萄糖和果糖、將賦形劑食用纖維和氧化鈣溶解于其中、而后粉末化來制備的。
將400克西印度櫻桃粉末溶于凈化水中，由此制備20％(W/W)水溶液(2000克)。將乙酸乙酯加入到水溶液中，加入體積是溶液的一半(基于體積)，而后攪拌該溶液。使用分液漏斗進行液-液分離，以便收集水層級份。將丁醇加入到水層級份中，加入體積是級份的一半(基于體積)，而后攪拌該生成物。使用分液漏斗進行液-液分離，以便收集丁醇層級份。以適宜的數量將凈化水加入到丁醇層級份中。然后進行真空蒸餾，干燥和固化，由此收集24克固體。
將上述固體溶于50毫升凈化水中。使用C18柱(Sep-Pak Vac 35cc(10g)C18柱體，Waters Corporation)對生成物進行部分純化。具體地說，將樣品裝載到柱上，而后用凈化水和10％甲醇水溶液洗滌，而后用20％甲醇水溶液洗脫。收集由此洗脫的餾份。使用真空蒸餾設備將餾份蒸干，由此收集0.8克固體。
將固體溶于10毫升20％甲醇水溶液中。通過高效液相色譜法對樣品進行高純度純化。對于制備柱，使用Inertsil ODS-35μm 4.6×250mm(GL-science)。通過用0.5毫升每個制備分離的樣品來裝載柱，進行制備分離，用10％甲醇水溶液洗滌柱，用10％至50％甲醇濃度梯度洗脫，而后收集含有多酚苷的峰值處的物質。這種制備分離重復20次。
使用真空蒸餾設備，將通過上述方法純化的含有多酚-苷的甲醇水溶液干燥并固化。將生成物懸浮在凈化水中。通過離心法從上清液中分離不溶物質，而后收集。將不溶物質再次溶于甲醇中。使用真空蒸餾設備將溶液蒸干，而后再次懸浮在凈化水中，由此收集不溶物質。收集不溶物質，而后使用冷凍干燥器從其中除去水，由此獲得10毫克多酚苷。
(2)Aceronidin的鑒定 使用各種型式的波譜測量，測定通過上述方法分離的多酚苷的結構。
表9說明了各個測定條件。
表9 測定條件 高分辨率ESI-MS 裝置 LCT質譜儀(Micromass) 流動相 甲醇(0.1毫升/分鐘) 注射樣品溶液的體積 5μl 測定的離子 陽離子 進樣 脈沖注射 霧化電壓 3,000V 錐電壓 30V Ext.錐電壓 2V 脫溶劑(desolvation)單元溫度150℃ 離子源溫度 120℃ Rf透鏡 200單位 脫溶劑(desolvation)氣體氮氣(大約700L/hr) 掃描范圍 m/z 150至1,000(1秒) 掃描間隔 0.1秒 內標物質 亮氨酸腦啡肽 NMR 裝置 UNITY INOVA 500(Varian) 觀測頻率 1H499.8 MHz，13C125.7 MHz 溶劑 CD3OD 濃度 6.3mg/0.65mL 標準 TMS 溫度 25℃ 1H NMR測定 觀察寬度5KHz 數據點 64K 脈沖角度30° 脈沖重復周期10sec 累計次數16次 13C NMR測定 觀察寬度30KHz 數據點 64K 脈沖角度45° 脈沖重復周期3sec 累計次數2,400次 DEPT測定(具有正信號的CH和CH3的測定和具有負信號的CH2的測定) 觀察寬度30KHz 數據點 64K 脈沖重復周期3sec 累計次數800次 DQF-COSY測定 觀察寬度t2軸5KHz t1軸5KHz 數據點 t2軸2048 t1軸256×2(zerofilling to 2048) 脈沖等待時間3sec 累計次數16次 HSQC測定 觀察寬度t2軸20KHz t1軸5KHz 數據點 t2軸2048 t1軸256×2(zerofilling to 2048) 脈沖等待時間2.5sec 累計次數16次 HMBC測定 觀察寬度t2軸25KHz t1軸5KHz 數據點 t2軸2048 t1軸512(zerofilling to 2048) 脈沖等待時間2.5sec 累計次數32次 NOESY測定 觀察寬度t2軸5KHz t1軸5KHz 數據點 t2軸2048 t1軸256×2(zerofilling to 2048) 混合時間1sec 脈沖等待時間3.446sec 累計次數16次 縮寫 DEPTDistortionless Enhancement by Polarization Transfer (測定碳種類(在CH3、CH2、CH和C之間辨別)的方法) DQF-COSYDouble Quantum Filtered Correlation Spectroscopy (1H-1H COSY的方法) NOESYNuclear Overhauser Effect SpectroscopyY HSQCHeteronuclear Single Quantum Coherence (1H-13C COSY的方法) HMBCHeteronuclear Multiple Bond Correlation (遠程1H-13C COSY的方法) 高分辨率ESI-MS 圖6A說明了全部離子色譜，圖6B說明了高分辨率ESI質譜。在這種測定中，強烈地觀察到具有m/z 473的鈉加合離子(M+Na)+，而后使用其精確的質量(實際測定值)計算化學組成，m/z 473.1064。C、H、O、和Na元素各自用于化學組成計算。結果，測定的組成式是C21H22O11Na。理論的精確質量是m/z 473.1060，具有0.4 mDa的誤差。在該測定中，由于已經加入鈉的這種離子的存在，Aceronidin的組成式是C21H22O11，分子量是450。
NMR測定 從高磁場側(右側)，指定符號“a”至“o”為1H NMR信號，指定“A”至“U”為13C NMR信號，而后進行分析。
1H NMR 圖7說明了1H NMR波譜，表10顯示了信號的列表。
表10 1H NMR波譜說明存在1，2，4-三取代的苯(“o”，“n”，“m”信號)和1，2，4，5-四取代的苯(“l”或“k”信號)的部分結構。此外，基于化學位移值，“a”至“j”信號歸位是CHn-O(n＝1或2)。
13CNMR 圖8顯示了13C NMR波譜，表11顯示了信號的列表。
表11 在13C NMR波譜的情況下，觀察到21個信號，結果與MS測量結果一致。沒有觀察到酮羰基的信號。
DEPT 圖9表示DEPT波譜。基于該波譜，確定了各個信號的碳歸屬(參見表12)。
DQF-COSY 圖10表示DQF-COSY波譜。下列部分結構從該波譜得出。
(1)j(5.31ppm)-g(4.25ppm)-I(4.87ppm) -CH(j)-CH(g)-CH(i)- (2)h(4.63ppm)-a(3.27ppm)-d(3.58ppm)-b(3.35ppm)或c f(3.81ppm)-e(3.62ppm)-c(3.36ppm)或b HSQC 圖11表示HSQC波譜。由HSQC波譜測定在1J(1H，13C)處偶合的1H和13C。表12顯示了該結果的概述。
表12 13C的類型、13C的化學位移、 與13C鍵合的1H的化學位移和自旋偶合常數
HMBC 圖12表示HMBC波譜。表13顯示了在HMBC波譜中所觀察到的遠程相關信號。
表13 a-B，C，E，I b-A，E，G c-C，E d-C，H，I e，f-C，G g-B，D，I，P h-E，G，H i-D，F，H，L，S，T j-B，F，M，O，P，S k-K，L，S，U l-J，L，T，U m-P，Q，R n-D，M，R o-D，O，R 本發明化合物的平面結構源自于該結果。
NOESY測定 圖13表示NOESY波譜。如NOESY波譜所示，觀察到質子之間的下列相關信號。

Jh，a＝7.9Hz、Ja，d＝9.5Hz和Jd，b＝8.4Hz的自旋偶合常數是糖的特征，表示其為Axial-Axial型。
在“h”和“c”質子之間觀察到NOE，表示在Axial位置存在“c”質子。因此，確定糖組份是β-葡萄糖。
其中葡萄糖的1位OH和2位OH為如上所述進行偶合的結構，是從“g”質子和“I”碳、“i”質子和“H”碳、“a”質子和“B”碳之間的HMBC相關信號推斷的。
從“A”和“i”、“h”和“j”、“g”和“i”質子之間的NOE，如上所述推斷“j”、“g”和“i”質子的相對構型。
Ji，g＝11.0Hz和Jg，i＝3.4Hz表示上述相對構型。
表14是歸屬列表的概述，其中將原子加以編號。
表14 NMR歸屬表
基于上述結果，確定新的多酚苷具有下面結構式表示的結構
本發明人將新的多酚苷命名為Aceronidin。
實施例2 實驗2.1.西印度櫻桃粉末的制備 將1400千克濃縮西印度櫻桃果汁(在Brazil制備)用凈化水稀釋，以便制備具有31％Brix值的溶液。將1％重量酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))加入到該溶液中。在30℃進行發酵20小時，以便除去葡萄糖和果糖。發酵后，進行離心和過濾。由此，獲得2297千克已經除去葡萄糖和果糖的加工和濃縮的西印度櫻桃果汁。將4.0％(W/W)食用纖維(食用纖維相對于果汁的固體含量(重量)比例)和1.5％(W/W)貝殼鈣(鈣相對于果汁的固體含量(重量)比例)作為賦形劑和加工試劑，分別溶解在加工和濃縮的西印度櫻桃果汁中。通過噴霧-干燥法將溶液粉末化，由此獲得806千克西印度櫻桃粉末。該西印度櫻桃粉末含有35.3％(W/W)維生素C和1.5％(W/W)多酚。
通過下列方法測定西印度櫻桃粉末中的多酚含量。將西印度櫻桃粉末以20％的濃度(W/W)溶于凈化水中。將C18柱(Sep-Pak Vac 35 cc(10g)C18柱體，Waters Corporation)裝載上50克溶液，用凈化水洗滌柱，而后收集用甲醇洗脫的餾份。使用兒茶素((+)-兒茶素水合物，Sigma-Aldrich Corporation)作為標準物質，通過Folin-Denis方法測定甲醇-洗脫餾份中的多酚的數量。使用西印度櫻桃粉末的重量(用于裝載柱的重量)、收集的甲醇洗脫液的量和測定的多酚的量，計算西印度櫻桃粉末中的多酚含量。此外，借助于該測定方法，與果膠骨架形成復合物的Aceronidin可以不必測量為“多酚”。
人們認為，C18柱吸附的組分含有多酚。由此，在該實施例中，使用C18柱吸附組分的量作為指標來測定多酚的量。
實驗2.2.已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末水溶液的制備 將實驗2.1中制備的西印度櫻桃粉末溶于凈化水中，濃度20％(W/W)，由此制備50毫升水溶液。將C18柱(Sep-Pak Vac 35cc C18柱體，Waters Corporation)裝載上溶液，而后將含有游離多酚等等的C18柱吸附組分吸附到該柱中。將已經通過該柱的餾份進行收集，以便制備已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末的水溶液。發現溶液中的固體的濃度是15.3％(W/W)。通過高效液相色譜法(C18柱ODS-34.6mm×250mm GL Sciences Inc.)測定水溶液中的多酚的量。由此獲得樣品中的多酚的峰面積，可與除去C18柱吸附的組分前的通過分析西印度櫻桃粉末水溶液獲得的多酚的峰面積(多酚濃度0.3％(W/W))相比較。當比較后計算比例時，證明樣品中的多酚濃度是與其比較的產物的1％或更小(具體地說，多酚濃度0.003％(W/W)或更小)。具體地說，基于固體含量，已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末中的多酚含量是0.02％(W/W)或更小。
在下面實驗中使用由此獲得的水溶液。在說明書中，該水溶液被稱為“已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末的水溶液”。此外，包含在水溶液中的固體可以稱為“已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末”。
實驗2.3.已經除去C18柱吸附組分和維生素C的西印度櫻桃粉末水溶液的制備 將已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末的水溶液(在實驗2.2中制備)用凈化水稀釋，固體濃度0.1％(W/W)。將100μl抗壞血酸氧化酶(TOYOBO Co.，Ltd.)溶液加入到5毫升該水溶液中，產生30U的酶活性。此外，將400μl的10mM磷酸氫二鈉水溶液加入到該溶液中，而后在30℃、在恒溫槽中反應過夜。反應完畢后，在120℃進行熱處理10分鐘，由此使酶失活。通過高效液相色譜法測定維生素C的殘留量，確定該數量相當于酶處理前的1％或更少。此外，在酶處理之前，基于固體含量，發現維生素C含量是35.3％(W/W)。因此，基于固體含量，除去維生素C后的西印度櫻桃粉末中的維生素C含量是0.35％(W/W)或更小。
在下面實驗中使用由此獲得的水溶液。在說明書中，該水溶液被稱為“已經除去C18柱吸附組分和維生素C的西印度櫻桃粉末的水溶液”。此外，包含在水溶液中的固體可以稱為“已經除去C18柱吸附組分和維生素C的西印度櫻桃粉末”。
實驗2.4.來源于西印度櫻桃的、C18柱吸附組分的制備 將實驗2.1中制備的西印度櫻桃粉末溶于凈化水中，濃度20％(W/W)，由此制備40毫升水溶液。將C18柱(Sep-Pak Vac 35cc C18柱體，WatersCorporation)裝載上溶液，而后將含有游離多酚等等的C18柱吸附組分吸附到該柱中。用凈化水洗滌該柱，用甲醇進行洗脫，而后使用真空蒸餾設備干燥并固化洗脫液。由此，收集0.17克C18柱吸附的組分。
抗氧化活性的試驗方法 實驗背景 亞油酸也是在人體內富含的不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸特征為當靜置時，其自身氧化，形成脂類過氧化物。在該實驗中，將亞油酸與樣品混合，將混合物在40℃靜置，而后基于從亞油酸純化的脂類氧化物數量的增加，評價抗氧化活性。
試驗方法2.1 使用亞油酸測定抗氧化活性(硫氰苯胺-鐵方法) 將2毫升的99.5％乙醇和2毫升蒸餾水(樣品已經預先溶于99.5％乙醇或蒸餾水的任何一個中)的混合物加入到2毫升2.5％(w/v)亞油酸(99.5％乙醇溶液)和4毫升0.05 M磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)的混合物中。將得到的混合物放進褐色螺帽瓶中，以便制備10毫升反應溶液。當樣品是不溶于水的組份時，將樣品溶于上述99.5％乙醇中，以便制備反應溶液。當樣品是水溶性的組份時，將樣品溶于上述蒸餾水中，以便制備反應溶液。此外，在該試驗方法中，術語“樣品濃度”表示在2毫升99.5％乙醇或2毫升蒸餾水中的樣品濃度。因此，在各個反應溶液中的各個樣品的最后濃度是預定濃度的五分之一。
此外，對于抗氧化活性呈陽性的樣品BHA，進行使其在反應溶液中含有適宜量的類似操作。以此作為陽性對照樣品。本文中使用的對照物是通過將2毫升99.5％乙醇和2毫升蒸餾水單獨加入到反應溶液中制備的。將在40℃保存在黑暗中的這種反應溶液用于主要的試驗，并且將存儲在4℃的這種反應溶液用于空白試驗。將試驗物質定時加以取樣，而后按照如下所述進行測定。試驗進行2周或更多周 將0.1毫升2×10-2M氯化亞鐵(3.5％鹽酸溶液)加入到0.1毫升試驗物質、9.7毫升75％乙醇和0.1毫升30％硫氰酸銨水溶液的混合物中。加入后正好3分鐘，在500納米處測量吸光度。在空白試驗中類似地測量吸光度Δ吸光度＝[主要試驗的吸光度]-[空白試驗的吸光度]。吸光度越高、氧化脂質的量越高。該結果表示相關樣品的弱抗氧化活性。此外，當樣品的氧化起始時，吸光度提高。吸光度達到峰值后，吸光度隨著樣品氧化量的降低而降低。因此可以說，吸光度達到峰值越快、抗氧化活性越弱。
此外，根據氧化率(％)，比較樣品的抗氧化活性。使用對照物的氧化(吸光度)作為100％，通過下式獲得氧化率(％)。
[式1] 氧化率(％)＝([Δ樣品的吸光度]/[Δ對照物的吸光度])×100 因此可以說，氧化率(％)越高、抗氧化活性越低。
實驗2.5.濃縮西印度櫻桃果汁和西印度櫻桃粉末的水溶液對于脂質的抗氧化活性 基于固體含量、用0.02％(W/W)的樣品濃度、通過試驗方法2.1測定實驗2.1中制備的濃縮西印度櫻桃果汁(Brix52.2，維生素C濃度18.4％(W/W)，基于固體含量(重量))和西印度櫻桃粉末樣品的抗氧化活性。圖14說明了結果。圖14中的Y軸是指吸光度。它表示，數字值越高、亞油酸的氧化越多。即使28天后，濃縮西印度櫻桃果汁和西印度櫻桃粉末也產生足夠的抗氧化活性。尤其是，西印度櫻桃粉末產生的抗氧化活性，達到了相當于BHA產生的抗氧化活性水平，BHA是具有相同濃度的合成抗氧化劑。
實驗2.6西印度櫻桃粉末和α-生育酚的抗氧化活性的比較 使用試驗方法2.1比較α-生育酚(維生素E)和西印度櫻桃粉末的抑制亞油酸自動氧化的效果。α-生育酚是源于自然界的已知的脂質可溶性抗氧化劑。
在該實驗中，使用α-生育酚((±)-α-生育酚Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.，一級試劑)、合成抗氧化劑BHA(3(2)-叔丁基-4-羥基苯甲醚Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，特級試劑)和實驗2.1中制備的西印度櫻桃粉末。對于所有的樣品濃度，在各個樣品的固體含量(濃度)是0.02％(W/W)的條件下進行實驗。表15顯示了試驗結果。
在實驗1中，α-生育酚與BHA(陽性對照)的比較，顯示BHA產生的抗氧化活性優于α-生育酚的抗氧化活性。在實驗2中，當BHA與西印度櫻桃粉末相比較時，西印度櫻桃粉末產生的抗氧化活性水平相當于BHA的抗氧化活性或甚至比其更高。基于該兩個試驗結果，顯示西印度櫻桃粉末比α-生育酚(維生素E)更強烈地抑制亞油酸的自動氧化。
表15 通過α-生育酚和西印度櫻桃粉末抑制亞油酸自動氧化的有關試驗 實驗2.7.維生素C(抗壞血酸)對于脂質的抗氧化活性 基于固體含量(重量)，通過試驗方法1測定0.02％(W/W)和0.04％(W/W)濃度的維生素C(抗壞血酸，特級試劑，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)樣品的抗氧化活性。圖15顯示了結果。圖15中的Y軸是指吸光度，表示數字值越高、亞油酸的氧化越高級。0.02％(W/W)和0.04％(W/W)的維生素C樣品根本沒有產生抗氧化活性。反而，開始實驗后，從實驗開始到7天期間，0.02％(W/W)濃度的維生素C樣品引起亞油酸氧化，比對照物引起的亞油酸氧化更早。
實驗2.8.按照抗氧化效能，西印度櫻桃粉末、已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末、和來源于西印度櫻桃的C18柱吸附組分的比較 具有不同樣品濃度(W/W)的實驗2.1中制備的西印度櫻桃粉末和實驗2.4中制備的C18柱吸附組分(來源于西印度櫻桃)，在該實驗中用作樣品。此外，將實驗2.2中制備的已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末水溶液的固體成分(固體濃度15.3％(W/W))稀釋為不同的濃度(W/W)。將由此稀釋的樣品在該實驗中使用。將這些樣品在40℃存儲28天，而后按照試驗方法2.1測定對于亞油酸的抗氧化效果。圖16顯示了結果。測定值通過亞油酸的氧化率(％)(參見上面式1)表示，表明氧化率(％)越高、樣品的抗氧化效能越弱。
100％的氧化率(％)是指亞油酸氧化物的量與對照物的相同。橫軸是指在該試驗中使用的樣品濃度。由進行評價抗氧化劑試驗的經驗可以斷定，在相同條件下，當氧化率(％)是20％或小于對照物的氧化率(％)時，抗氧化劑顯著地抑制氧化。由此，基于圖16中的結果，可以斷定，各個樣品的有效濃度是在來源于西印度櫻桃的C18柱吸附組份的固體含量(濃度)情況下，0.005％(W/W)或更大；在西印度櫻桃粉末樣品情況下，0.015％(W/W)或更大；和在已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末樣品的情況下，0.0175％(W/W)或更大。
很清楚，分離的來源于西印度櫻桃的C18柱吸附組分的抗氧化活性最高。此外，已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末也具有足夠的抗氧化活性。由此可以推斷，非C18柱吸附組分的組分也有助于抗氧化活性。基于溶液，在具有有效西印度櫻桃粉末濃度(固體含量濃度0.015％(W/W))的溶液中的多酚成分極低，是0.000225％(W/W)。由于西印度櫻桃粉末比已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末具有稍高水平的抗氧化活性，可以推斷，這種少量的C18柱吸附組分有助于抗氧化活性。由此可以斷定，西印度櫻桃粉末抑制亞油酸自動氧化的效果，是通過C18柱吸附組分及其它組分組合產生的。
實驗2.9.使用已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末水溶液、和已經除去C18柱吸附組分和維生素C的西印度櫻桃粉末水溶液進行脂質的抗氧化試驗 通過試驗方法1，基于固體含量(重量)，使用0.02％(W/W)的樣品濃度，測定在實驗2.2中制備的、已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末水溶液樣品的抗氧化活性，和在實驗2.3中制備的、已經除去C18柱吸附組分和維生素C的西印度櫻桃粉末水溶液樣品的抗氧化活性。圖17顯示了結果。證明已經除去C18柱吸附組分和維生素C的西印度櫻桃粉末的水溶液對于脂質具有足夠的抗氧化活性。此溶液比具有相同濃度的、已經除去C18柱吸附組分的西印度櫻桃粉末所具有的抗氧化活性低的原因，可能由于除去了維生素C。另一方面，如實驗2.7所示，維生素C不能單獨充當脂質的抗氧化劑(圖15)。由此，該實驗的結果說明，在與非C18柱吸附組分的西印度櫻桃組分的聯合中，西印度櫻桃之中的維生素C對于脂質發揮抗氧化活性。
實驗2.10.酸溶性的西印度櫻桃果膠的制備 使用韋林氏攪拌器將西印度櫻桃果實粉碎，同時將3千克凈化水加入到3千克西印度櫻桃果實中，以便制備粉碎的西印度櫻桃產品。將乙醇加入到該產品中，直到占30％重量為止。將生成物在室溫下攪拌過夜，以便提取水和乙醇可溶的組分。在4200rpm條件下，將提取物離心30分鐘，由此分離固體成分。收集1500克的固體成分。
將5200克凈化水加入到1500克固體成分中，制備懸浮液。將濃鹽酸加入到懸浮液中，調節生成物pH值至2.2。使用片式加熱器，在80℃至90℃進行熱處理2小時，同時攪拌該懸浮液。將懸浮液靜置，降溫至室溫，而后在4200rpm下離心30分鐘。由此，將生成物分離為固體成分和上清液，而后收集上清液。使用0.2μm過濾器過濾上清液，除去不能溶解的組分，由此獲得純的提取物。
將乙醇加入到提取物中，加入數量大于提取物重量3倍，以便將乙醇不能溶解的果膠組份沉淀。使用不銹鋼網收集沉淀的果膠組份。此外，為了除去乙醇和水溶性的組分，將生成物用90％乙醇水溶液洗滌兩次，收集，而后使用冷凍干燥器干燥。由此，收集6.24克酸溶性的西印度櫻桃果膠。
實驗2.11.用果膠酶處理的西印度櫻桃果膠的制備 使用韋林氏攪拌器將西印度櫻桃果實粉碎，同時將2千克凈化水加入到2千克西印度櫻桃果實中，以便制備粉碎的西印度櫻桃產品。將乙醇加入到該產品中，直到占40％重量為止。將生成物在室溫下攪拌過夜，以便提取水和乙醇可溶的組分。在4200rpm條件下，將提取物離心30分鐘，由此分離固體成分。收集1000克的固體成分。
將1000克固體成分與3000克凈化水混合，而后與4克果膠酶粉末(果膠酶“AMANO A”，AMANO ENZYME INC.混合。將混合物在45℃下靜置過夜。在4200 rpm條件下，將混合物離心30分鐘，以便混合物分離為固體成分和上清液。收集上清液。使用0.2μm過濾器過濾上清液，除去不能溶解的組分，由此獲得純的提取物。
將乙醇加入到提取物中，加入數量大于提取物重量3倍，以便將乙醇不能溶解的果膠組份沉淀。在4200rpm條件下，將沉淀的果膠組份離心30分鐘，以便收集固體成分形式的組份。將固體成分進一步用90％乙醇水溶液洗滌，而后使用冷凍干燥器干燥。由此收集12.6克干固體成分。將干固體成分指定為果膠酶處理的果膠。由于該果膠組份幾乎沒有果膠水溶液的粘性特征，人們認為該果膠組份是果膠水解物。
實驗2.12.來源于西印度櫻桃的果膠的分子量測定 通過凝膠過濾色譜法，測定用酸處理的果膠(在實驗2.10中制備)、和已經用酸處理而后用果膠酶處理的果膠產品的分子量。
將用酸處理的果膠溶于凈化水中，濃度0.5％(W/W)。由此制備20毫升水溶液，使用0.2μm過濾器過濾，而后使用。已經用酸處理、而后用果膠酶處理的果膠產品制備如下。將用酸處理的果膠(在實驗2.10中制備)溶于凈化水中，濃度0.3％(W/W)，以便制備20毫升水溶液。將6毫克果膠酶粉末(果膠酶“AMANO A”，AMANO ENZYME INC.)加入到該溶液中，而后在50℃反應過夜。反應完畢后，在120℃進行熱處理15分鐘，使酶失活。使用0.2μm過濾器過濾生成物。使用真空蒸餾設備，將過濾生成物濃縮至2毫升，而后使用0.2μm過濾器將濃縮產品過濾。用Sephacryl S-300 High Solution(Amersham Biosciences)作為凝膠過濾的載體。將柱用載體裝載，而后進行凝膠過濾測定。PBS(Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水)用作緩沖液。在分子量的測定中，本文中使用認為適合該測定的分子量標記。這些分子量標記是藍色右旋糖酐2000，催化酶，Alubmin和胰凝乳蛋白酶原A，在HMW凝膠過濾標準試劑盒(AmershamBiosciences)和LMW凝膠過濾標準試劑盒(Amersham Biosciences)中。
作為該測定的結果，發現用酸處理的果膠(在實驗2.10中制備)的分子量幾乎與使用藍色右旋糖酐2000測定的分子量相同。由此顯示，用酸處理的果膠(在實驗2.10中制備)是具有大約2,000,000分子量的分子。此外，在用酸處理、而后用果膠酶處理的果膠產品的情況下觀察到大量峰值。證明所有的分子量比具有分子量20.4 kDa的胰凝乳蛋白酶原A的分子量低。因此推斷，用酶處理的果膠是各自具有20,000分子量或更小分子量的分子的混合物。
實驗2.13.根據抗氧化效能，來源于西印度櫻桃的果膠樣品的比較 通過試驗方法2.1，基于固體含量(重量)，使用0.1％(W/W)的樣品濃度，測定用酸處理的來源于西印度櫻桃的果膠(在實驗2.10中制備)的抗氧化活性，和用果膠酶處理的來源于西印度櫻桃的果膠(在實驗2.11中制備)的抗氧化活性。圖18顯示了結果。兩種樣品對于脂質都顯示了足夠的抗氧化活性。由此顯示，兩種類型的果膠可有效作為脂質的抗氧化劑。如實驗2.12所述，盡管用酸處理的西印度櫻桃果膠和用酶處理的果膠在分子量方面相互完全不同，但前者果膠表現的脂質抗氧化活性與后者果膠產生的脂質抗氧化活性水平相等。可以推斷，通過其它酶等等水解的來源于西印度櫻桃的果膠，對于脂質也具有抗氧化活性，水平相當于其它果膠的抗氧化活性。
實驗2.14 通過DPPH自由基清除活性試驗，評價來源于西印度櫻桃的果膠的抗氧化活性。
使用穩定的diphenyl-p-picrylhydradil(DPPH)的乙醇溶液評價抗氧化活性。將1600μl的250 mM乙酸鹽緩沖液(pH值＝5.5)與1200μl的乙醇和400μl的樣品(在預定濃度下調節)混合，而后在30℃預培育5分鐘。將800μl的500μM DPPH/乙醇溶液加入到該溶液中，而后將溶液混合。在30℃，將溶液靜置30分鐘，而后在517納米處測定吸光度。本文中使用的對照物是使用凈化水代替樣品溶液、通過類似的方法來制備的。本文中使用的樣品是用酸處理的來源于西印度櫻桃的果膠(在實驗2.10中制備)和用酶處理的來源于西印度櫻桃的果膠(在實驗2.11中制備)。用于比較的樣品是通過將來源于蘋果的果膠(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.，reagent)和來源于柑桔的果膠(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.，reagent)分別以0.3％(W/W)和0.1％(W/W)的濃度用凈化水溶解來制備的溶液。通過下式、使用由此測定的吸光度來計算自由基清除比例。
[式2] 清除比例(％)＝(1-[樣品的吸光度]/[對照物的吸光度])×100 表16顯示了結果。這些結果顯示，與其它果膠不同，用酸處理的來源于西印度櫻桃的果膠或用酶處理的果膠是具有自由基清除活性的抗氧化物質。此外也顯示，通過果膠酶(酶)處理，抗氧化活性增加了大約2倍。
表16 實驗2.15 將鮭魚的一半身體浸在含有西印度櫻桃粉末的鹽溶液中，以便制備鹽腌的鮭魚樣品。在熒光照明條件下，在存儲前后，測定外觀、感覺性、顏色(Hunter Lab)、酸值和過氧化值方面的變化。基于這些變化，確定西印度櫻桃粉末對于脂質的抗氧化效果。
如下制備西印度櫻桃粉末。將1400千克濃縮西印度櫻桃果汁(在Brazil制備)用凈化水稀釋，而后將Brix值調節至31％。將1％重量酵母(Saccharomyces cerevisiae)加入到該溶液中，而后在30℃進行發酵20小時，以便除去葡萄糖和果糖。發酵后，進行離心和過濾。由此，獲得2297千克已經除去葡萄糖和果糖的加工和濃縮的西印度櫻桃果汁。緊接著，將400克作為賦形劑的糊精、150克食用纖維、50克加工的淀粉溶于含有來源于西印度櫻桃的固體成分的400克加工和濃縮的西印度櫻桃果汁中。通過噴霧-干燥法將溶液粉末化，以便獲得780克用于食品加工的西印度櫻桃粉末。這種西印度櫻桃粉末含有0.5％至1.0％多酚。這種西印度櫻桃粉末不同于實驗2.1中獲得的西印度櫻桃粉末，因為它不包含苦味組份貝殼鈣，以便西印度櫻桃粉末可以用于廣泛的食品加工中。
作為用于西印度櫻桃加入試驗中的浸液，制備含有上述西印度櫻桃粉末(5％重量)、食鹽(20％重量)和碳酸氫鈉(5％重量)的水溶液。此外，作為用于對照試驗的浸液，制備含有食鹽(20％重量)的水溶液。
將冷凍原料魚(銀鮭(適當處理))解凍，用鹽水洗滌，以洗掉粘性的表面，而后切成肉片。從肉片中除去腹部的骨頭，以便制備該實驗的樣品。將一條鮭魚的一半身體浸在含有西印度櫻桃粉末的浸液中。另一半身體浸在對照試驗的浸液中。過夜浸泡后，將肉片排水，真空包裝，而后冷凍保存，直到對肉片進行下列熒光照明實驗為止。
通過下列方法進行熒光照明實驗。首先，將上述鹽腌鮭魚樣品解凍，切成合適的規格，而后放進泡沫聚苯乙烯托盤中。將該托盤完全用包裝材料(Shin-etsu Polymer Co.，Ltd.，“Polymawrap”)包裹，放入陳列柜中，而后在10℃對其進行48小時的1500lux.熒光照明。
觀察熒光照明前后外觀方面的變化。在光照之前，與對照試驗組的樣品相比較，已經加入西印度櫻桃的樣品組呈略微暗的顏色，但它們相互之間沒有太多不同。熒光光照實驗后，與光照之前樣品相比較，已經加入西印度櫻桃的樣品組呈略微暗和深色，但保持紅色。相反，對照試驗組的樣品顯示了紅色的明顯褪色。由此，證實西印度櫻桃粉末可以在存儲期間防止鮭魚褪色。此外，在熒光光照前后，觀察感覺方面的變化。在光照之前，在已經加入西印度櫻桃的組和對照試驗組兩者中，沒有感覺到脂質氧化產生的氣味。光照后，在對照試驗組中，感覺由脂質氧化和脂質惡化產生的味道，比已經加入西印度櫻桃組中的味道更強烈。下面的表顯示了上述評價的結果。對于各個試驗組，制備20個樣品。表中的數字是相應于各項的樣品的數目。此外，圖19顯示了在熒光照明條件下存儲后的樣品的圖片。
表17 用于測色的Hunter Lab測定，是在3個時間點進行的在浸泡之前；浸泡后但在光照之前(簡單地說，表18中的“光照之前”)；和光照后。Lab測定是使用CHROMA METER CR-200(Minolta Co.，Ltd.)進行的。浸泡之前的測定和光照后的測定進行了5個樣品。浸泡后但在光照以前的測定，進行了2個樣品。均值各自概括在表18中。
表18 從表18中僅提取出在光照前后觀察到的 “a”值(顯示紅色)的變化，并示于圖20中。從圖20明顯的看出，觀察到已經加入西印度櫻桃的試驗組的“a”值幾乎沒有降低，而在對照試驗組中觀察到了“a”值的降低。
此外，測定各個樣品在熒光照明后的酸值(AV)和過氧化值(POV)。按照Food Analysis Handbook(2nd ed.，KENPAKUSHA)中描述的方法進行測定。表19顯示了結果。
表19 熒光照明實驗后的酸值和過氧化值 熒光照明和存儲后，加入西印度櫻桃的試驗組的酸值和過氧化值小于對照試驗組的酸值和過氧化值。具體地說，表明西印度櫻桃粉末的加入，抑制了脂質氧化。
實驗2.16 將鮭魚卵(sujiko)浸在含有西印度櫻桃粉末的調味品溶液中，以便制備調味的鮭魚卵。在熒光照明條件下，在存儲前后，測定外觀、味道、酸值和過氧化值方面的變化。基于這些變化，確定西印度櫻桃粉末的抗脂質氧化效果。
對于西印度櫻桃粉末，使用實驗2.15中制備的西印度櫻桃粉末。
對于用于西印度櫻桃加入試驗的調味品溶液，制備含有上述西印度櫻桃粉末(5％重量)、清酒(35％重量)、白醬油(35％重量)、味 (Mirin，用于烹調的日本調味料)(20％重量)、碳酸氫鈉(4.995％重量)和亞硝酸鈉(0.005％重量)的水溶液。此外，對于對照試驗的調味品溶液，制備具有相同組成的水溶液，只不過它不包含西印度櫻桃粉末和碳酸氫鈉。
將冷凍的鮭魚卵(已經冷凍處理過的生鮭魚卵)解凍，用鹽水洗滌，浸于上述調味品溶液中1小時，低溫過夜進行熟化，而后分為“3特”和“黑子”。分類后，將鮭魚卵冷凍保存，直到對它進行下列熒光照明實驗為止。
通過下列方法進行熒光照明實驗。首先，將從鮭魚卵中分選的“3特”或“黑子”解凍，而后放進泡沫聚苯乙烯托盤中。將該托盤完全用包裝材料(Shin-etsu Polymer Co.，Ltd.，“Polymawrap”)包裹，放入冷藏庫中，而后在10℃對其進行144小時的1500 lux.熒光照明。
觀察熒光照明前后外觀和味道方面的變化。在照明前后，與對照試驗組相比較，加入西印度櫻桃的試驗組抑制了外觀變化和味道惡化(產生脂質氧化味)。上述評價結果示于下面表中。對于各個試驗組，制備20個樣品。表中的數字是相應于所有項的樣品的數目。
表20 測定各個樣品在熒光照明后的酸值(AV)和過氧化值(POV)(然而，在kuroko樣品的情況下，僅僅測定酸值)。按照Food Analysis Handbook(2nded.，KENPAKUSHA)中描述的方法進行測定。表21顯示了結果。
表21 熒光照明實驗后的酸值和過氧化值 在3特和黑子的兩種情況下，加入西印度櫻桃的試驗組中的熒光照明和存儲后的酸值和過氧化值，都顯著地比對照試驗組的小。具體地說，表明西印度櫻桃粉末的加入，抑制了脂質氧化。
實施例3 果膠酶制劑 在下面實驗中，使用果膠酶制劑(果膠酶A“Amano”，AMANOENZYME INC.)進行果肉渣消化。這種酶制劑含有果膠酶45％，β-淀粉酶25％和硅藻土30％。由此，西印度櫻桃果肉渣中的果膠組份和淀粉組份可以通過酶制劑水解。果膠酶是從霉菌Aspergillius pulverulentus和Aspergillius niger的培養產物中純化出的酶。認為果膠酶是許多類型果膠酶的混合物。由于果膠酶導致用酸和加熱處理提取的來源于西印度櫻桃的果膠的粘度的快速降低，人們認為果膠酶含有可以使果膠分子內部隨機裂解的、使得其分子量很快地降低的內切-多聚半乳糖醛酸酶。
實驗3.1.制備西印度櫻桃粉末VC30(對比產物)的方法 從在Brazil生產的西印度櫻桃果實中除去籽部分。為了增加流動性，將籽部分與離子交換水混合。使用不銹鋼網式過濾器除去混合物中的大量固體成分，而后將生成物放進用于果膠酶處理的罐中。將每7 Brix(使用糖量計測定)的0.01％(W/W)果膠酶制劑(果膠酶A“Amano”，AMANO ENZYME INC.)放進罐中，同時在40℃至50℃加熱罐，以便進行1至2小時的酶處理。酶處理后，將由此處理的西印度櫻桃產品加熱，以使酶失活。將產品滅菌，而后進行硅藻土過濾，以便獲得清澈的西印度櫻桃果汁。將西印度櫻桃果汁通過真空蒸餾和濃縮法進行濃縮，由此制備濃縮的西印度櫻桃果汁。
將1400千克濃縮西印度櫻桃果汁用凈化水稀釋，以調節Brix值至31％。將1％重量酵母(Saccharomyces cerevisiae)加入到稀溶液中，而后在30℃發酵20小時。發酵后，進行離心和過濾，以除去葡萄糖和果糖。由此，獲得2297千克加工和濃縮的西印度櫻桃果汁。將4.0％(W/W)食用纖維(食用纖維與果汁的固體含量(重量)比例)和1.5％(W/W)貝殼鈣(貝殼鈣與果汁的固體含量(重量)比例)作為賦形劑和加工試劑，溶解在加工和濃縮的西印度櫻桃果汁中。對由此獲得的溶液進行噴霧-干燥法，以便獲得806千克西印度櫻桃粉末(在下文，西印度櫻桃粉末也稱為“西印度櫻桃粉末VC30”)。該西印度櫻桃粉末含有35.0％(W/W)抗壞血酸和1.07％(W/W)半乳糖醛酸。具體地說，相對于抗壞血酸，西印度櫻桃粉末VC30含有3.1％重量半乳糖醛酸。對于半乳糖醛酸的定量方法，參見下面的說明書。
3.2.制備西印度櫻桃粉末A(本發明的產品)的方法 從在Brazil生產的西印度櫻桃果實中除去籽，以便制備西印度櫻桃果泥。不用進行從西印度櫻桃果泥中除去固體成分的過程。由此，在西印度櫻桃果泥中富含果肉渣。將1％(W/W)果膠酶制劑(果膠酶A“Amano”，AMANO ENZYME INC.)與10.8千克西印度櫻桃果泥(Brix值8％)混合。將混合物在50℃加熱4小時。通過加熱該處理的產品，使酶失活，進行滅菌。通過離心法，將生成物分離為固體成分和果汁。通過真空蒸餾將果汁濃縮，以便收集3.6千克的濃縮液(Brix值25.2％)。將1％重量酵母(釀酒酵母)加入到濃縮液中，而后在30℃發酵20小時。發酵后，進行離心和過濾，以除去葡萄糖和果糖。由此，獲得3.3千克加工和濃縮的西印度櫻桃果汁(Brix值21.5％)。將4.0％(W/W)食用纖維(食用纖維與果汁的固體含量(重量)比例)和1.5％(W/W)貝殼鈣(貝殼鈣與果汁的固體含量(重量)比例)作為賦形劑和加工試劑，溶解在2.8千克的加工和濃縮的西印度櫻桃果汁中。對該溶液進行噴霧-干燥法，以便獲得大約0.5千克的西印度櫻桃粉末(在下文，它也可以被稱為“西印度櫻桃粉末A”)。該西印度櫻桃粉末含有29.3％(W/W)抗壞血酸和3.47％(W/W)半乳糖醛酸。具體地說，相對于抗壞血酸，西印度櫻桃粉末A含有11.8％重量半乳糖醛酸。對于半乳糖醛酸的定量方法，參見下面的說明書。
3.3.定量半乳糖醛酸的方法 通過下面的方法定量半乳糖醛酸。
將20克含有半乳糖醛酸的樣品在已經加入到其中的80克凈化水中溶解。樣品已經充分溶解后，稱量10克溶液，并放進50毫升離心管中。將40毫升乙醇(特級，Wako Pure Chemical Industries，Ltd)加入到其中，并與生成物在試管中充分地混合(乙醇沉淀法)。將混合物靜置30分鐘或更長時間后，在3000rpm下進行離心20分鐘(20℃)。隨后，完全收集沉淀，而后使用冷凍干燥器進行干燥和固化。將由此干燥的產品溶于凈化水中，濃度為0.02％、0.05％、0.1％和0.2％(W/W)，由此制備定量用溶液。利用3，5-二甲酚方法，定量半乳糖醛酸的量。首先，將125μl每個定量用溶液放進試管中。隨后，將125μl的2％氯化鈉水溶液和2毫升濃硫酸(特級，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)各自加入到溶液中，而后在70℃反應10分鐘。將各個生成物在水中冷卻20至30秒鐘。將0.1毫升顯色試劑(通過將0.1克3.5-二甲苯酚溶解在100毫升冰醋酸中來制備)加入到生成物中。10分鐘以后，在450納米和400納米處測定吸光度，而后得到兩者之間的差異。對于標準物質，使用半乳糖醛酸一水合物(特級試劑，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。基于標準物質的校準曲線(12.5μg/g至50μg/g)，計算干燥產品中的半乳糖醛酸的量。借助于由此計算的數值、和通過乙醇沉淀法和干燥從2克樣品處獲得的干燥產品的重量，計算樣品中的半乳糖醛酸成分。表22顯示了定量結果。此外，在該定量中獲得的乙醇沉淀也含有用作賦形劑的食用纖維。
表22 3.4.皮膚-增白試驗 使用褐色豚鼠(SPF)檢驗UV照射后的色素淀積的抑制效果。由于以類似于人類的方式進行UV照射、和已經明顯保養的品系，褐色豚鼠是進行色素淀積的動物。在該試驗中，每個組使用六個豚鼠。為了促進色素淀積，使用安裝在UV照射裝置(Y-798-II，Orion Electric Co.，Ltd.)處的5個SE燈(波長在250納米和350納米之間，FL20S E，TOSHIBACorporation)，從40厘米的距離進行UV(UVB)照射。由于UV照射而在皮膚上出現紅斑所需要的最短時間，是在預先測試中測定的，并且確定是12分鐘和30秒鐘。在該試驗中，將這個時間指定為UV照射時間。每個照射位點是2厘米×2厘米平方區域，位于跨越豚鼠背部中線的左或右側，使用電剪刀將豚鼠剪毛，而后使用電動刮胡刀剃削。UV照射總計進行3次，包括初始給藥的當天(稱為第0天)和初始給藥后的第2和4天。通過口服(使用導管)已經制備的每個試驗物質的溶液來給予試驗物質，使得抗壞血酸的劑量是300毫克/千克動物重量/天。具體地說，使用相等數量的抗壞血酸進行實驗。對于空白，給予注射用水(OTSUKAPharmaceutical Co.，Ltd.)。對于試驗物質，使用對比產品西印度櫻桃粉末VC30(831毫克/5毫升)、本發明的產品西印度櫻桃粉末A(1024毫克/5毫升)、和抗壞血酸(特級試劑，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)(300毫克/5毫升)。進行42天口服。色素淀積測定如下。在初始給藥(照射之前)之前、起始給藥當天、和初始給藥后第7、14、21、28、35和42天，使用色度計(CR-300，Minolta Co.，Ltd.)測定照射位點的L值(光照)，而后確定ΔL值(觀察當天的L值-照射之前的L值)。本文中使用的總共5個測定位點包括中心點和位于每個照射位點互相間直徑上對置的4個角。其平均值稱為每個個體豚鼠的L值。表明ΔL值越高、色素淀積水平越強烈。圖2 1顯示了試驗結果。縱軸表示ΔL值，橫軸表示試驗起始后的天數。每個測定值是一組6個豚鼠的ΔL值的平均值。
結果，在給予西印度櫻桃粉末VC30(對比產品)的組中，與給予注射用水的組相比較，發現在每個觀察時間點，ΔL值的降低被顯著地抑制。具體地說，產生了抑制色素淀積的效果。在給予西印度櫻桃粉末VC30(對比產品)的組和給予抗壞血酸的組(陽性對照)的情況下，測定值幾乎相同。因此可以推斷，西印度櫻桃粉末VC30抑制色素淀積的效果，是由于含在其中的抗壞血酸。
另一方面，在所有的觀察天中，給予西印度櫻桃粉末A(本發明的產品)的組中的ΔL值，小于給予抗壞血酸的組中的ΔL值。相應地，有人提出，西印度櫻桃粉末A(本發明的產品)具有促進抗壞血酸抑制色素淀積效果的組份，該組份不包含在對比產品(西印度櫻桃粉末VC30)中。
本文中所引用的全部出版物、專利和專利申請在此以其整體被引入作為參考。
權利要求
1.來源于西印度櫻桃果實的果膠或其水解物，包括果膠骨架和由下列化學式代表的多酚化合物形成的絡合物
2.制備按照權利要求1的果膠的方法，包括從西印度櫻桃果實或其加工的產品分離或濃縮果膠的步驟。
3.制備按照權利要求1的果膠水解物的方法，包括從西印度櫻桃果實或其加工的產品分離或濃縮果膠的步驟、和將果膠水解的步驟。
4.按照權利要求3的方法，包括下列步驟通過用果膠酶處理果泥而將由西印度櫻桃果實制備的果泥中的果膠水解的步驟，和由前面步驟中的加工產品的上清液來分離或濃縮水解的果膠的步驟。
5.按照權利要求2至4的任一項的方法，其中分離或濃縮果膠的步驟是使用乙醇沉淀果膠的步驟。
6.按照權利要求2至4的任一項的方法，其中分離或濃縮果膠的步驟是使用分離膜進行分離或濃縮果膠的步驟。
7.按照權利要求6的方法，其中分離膜是超濾膜。
8.按照權利要求7的方法，其中超濾膜具有從10,000至100,000的分子量分離點。
9.含有來源于西印度櫻桃果實的果膠的材料，其是通過包括從西印度櫻桃果實或其加工的產品中分離或濃縮果膠的步驟的方法制備的。
10.含有來源于西印度櫻桃果實的果膠水解物的材料，其是通過包括從西印度櫻桃果實或其加工的產品中分離或濃縮果膠的步驟和將果膠水解的步驟的方法制備的。
11.按照權利要求10的材料，其是通過包括通過用果膠酶處理果泥、將由西印度櫻桃果實制備的果泥中的果膠水解的步驟，和從前面步驟中產生的加工產品的上清液中分離或濃縮水解的果膠的步驟的方法制備。
12.按照權利要求9至11的任一項的材料，其中分離或濃縮果膠的步驟是使用乙醇沉淀果膠的步驟。
13.按照權利要求9至11的任一項的材料，其中分離或濃縮果膠的步驟是使用分離膜分離或濃縮果膠的步驟。
14.按照權利要求13的材料，其中分離膜是超濾膜。
15.按照權利要求14的材料，其中超濾膜具有從10,000至100,000的分子量分離點。
16.一種抗氧化劑，含有按照權利要求1的果膠或其水解物作為活性組分。
17.一種抗氧化劑，含有按照權利要求9至15的任一項的材料作為活性組分。
18.一種脂質的抗氧化劑，含有西印度櫻桃果實的加工產品(不包括西印度櫻桃籽的加工產品)作為活性組分。
19.按照權利要求18的抗氧化劑，其中西印度櫻桃果實的加工產品含有多酚和/或抗壞血酸。
20.具有抗氧化效果的食品，向其中加入按照權利要求16至19的任一項的抗氧化劑。
21.制備食品的方法，包括使用按照權利要求16至19的任一項的抗氧化劑來增加食品氧化穩定性的步驟。
22.一種口服皮膚-增白劑，含有按照權利要求1的果膠或其水解物作為活性組分。
23.一種口服皮膚-增白劑，含有按照權利要求9至15的任一項的材料作為活性組分。
24.按照權利要求22或23的口服皮膚-增白劑，進一步含有抗壞血酸。
25.具有皮膚-增白效果的食品，向其中加入按照權利要求22至24的任一項的口服皮膚-增白劑。
26.制備口服皮膚-增白劑的方法，包括下列步驟將包含在西印度櫻桃果實的果肉渣中的、或含有抗壞血酸和這種果肉渣的西印度櫻桃果實的加工產品中的果膠水解的步驟，以使半乳糖醛酸的量相對于抗壞血酸的量是5％重量或更多。
27.按照權利要求26的方法，進一步包括基本上除去葡萄糖和果糖的步驟。
全文摘要
本發明涉及來源于西印度櫻桃果實的果膠或其水解物，包括Aceronidin的絡合物形式，其是新的多酚化合物。本發明的果膠可以用作抗氧化劑或皮膚增白劑的活性組分。
文檔編號C08B37/06GK101171266SQ200680014768
公開日2008年4月30日 申請日期2006年2月28日 優先權日2005年2月28日
發明者川口將和, 佐佐木晶子, 永峰賢一, 上東純 申請人:株式會社日冷食品, 株式會社日冷生物科學