專利名稱：抗氧化劑、皮膚外用劑、化妝品和食品的制作方法
技術領域：
本發明涉及以西印度櫻桃種子的提取物作為有效成分的抗氧化劑，使用該抗氧化劑的皮膚外用劑、化妝品和食品。
背景技術：
食品、化妝品、藥品等物品中含有油脂類時，其儲藏、保存、加工過程中的最大問題是空氣中的氧導致的油脂成分等的氧化或過氧化。尤其是已知油脂中含有的亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸容易因為氧而過氧化，生成過氧化脂質或自由基，進而生成致癌物質。發生這樣的氧化或過氧化，則不僅會產生著色、變色、變性、異味或營養價的有效性降低，還會產生有毒物質等，導致產品的品質變差。
因此，為了抑制上述不飽和脂肪酸的氧化和過氧化，防止品質變差，以往采用了各種抗氧化劑。抗氧化劑作用于氧化時產生的過氧化自由基，使氧化連鎖反應終止，或者與自由基作用，使氧化反應終止。一直以來，抗氧化劑例如通常采用丁基羥基茴香醚(BHA)或丁基羥基甲苯(BHT)等合成抗氧化劑。但是近年來，隨著合成抗氧化劑使用的增加，其安全性成為人們關注的問題，消費者的抗拒反應逐漸強烈，因此其用量正在減少。另外，這些合成抗氧化劑是油溶性的，難以應用在水溶液中。
另一方面，作為來自安全性高的天然產物的抗氧化劑例如已知有天然維生素E(α-生育酚)、維生素C等。但是，這些來自天然產物的抗氧化劑具有極端脂溶性或水溶性的性質，因此，其應用受到限制。另外，也具有其活性不能長時間穩定持續等缺點。
因此，人們需求抗氧化活性強、在水中的溶解性好、且抗氧化活性長時間穩定的來自天然產物的抗氧化劑。
還已知起到保持皮膚水分、使皮膚具有柔軟性、彈性的物質是膠原或透明質酸等。膠原在皮膚中占真皮的90％，分布于整個真皮組織中，使皮膚保持適度的彈性和強度。透明質酸廣泛分布于皮膚、關節液、玻璃體、韌帶等有機體中，在皮膚中，擔負著細胞粘附、細胞保護、皮膚組織的形成、組織的水分保護、柔軟性的保持等功能。已知生物體內分解膠原的酶是膠原酶，分解透明質酸的酶是透明質酸酶，通過它們，膠原、透明質酸被分解，其量減少，皮膚就會失去潤澤、張力，發生皮膚的老化現象—皺紋或松弛。
因此，有人提出了在皮膚外用劑或各種化妝品中混合抑制上述酶活性的物質等，期待具有防止皮膚的老化或防止皺紋的作用等，開發出各種膠原酶活性抑制劑或透明質酸酶活性抑制劑。
其中，西印度櫻桃的果實作為含有豐富維生素C的植物，近年來廣為人所知，目前，世界各國都將其用于飲料、保健食品。并且，含有豐富維生素C的西印度櫻桃果實，由于其提取物中所含的維生素C而有望具有抗氧化作用等，在化妝品中也有所應用(日本專利第2814094號說明書(日本特開平2-200610號公報)、日本特開號公報、日本特開號公報、日本特開號公報)。
但是，西印度櫻桃的果實中，能夠用作化妝品或食品的只是含有較多維生素的果肉，幾乎未發現其種子的有效利用途徑，目前大部分都被扔棄不用。最近，有人提出一種組合物，該組合物是通過水蒸氣蒸餾法處理含有西印度櫻桃種子的植物種子，得到的水蒸氣蒸餾水有望具有改善皮膚感覺的效果，可混合到化妝品中(日本特開號公報)。這有望成為更有效利用的途徑。
對于上述西印度櫻桃種子的含有成分及其作用等尚不為人所知。

發明內容
本發明的目的在于提供一種抗氧化劑，該抗氧化劑可以有效利用以往基本上被扔棄不用的西印度櫻桃種子，安全性優異，可用于化妝品或食品，顯示優異的抗氧化作用。
本發明的另一目的在于提供一種皮膚外用劑和化妝品，所述皮膚外用劑和化妝品有望具有穩定的抗氧化作用、膠原酶活性抑制作用或透明質酸酶活性抑制作用，安全性優異，有望具有防止皮膚老化、防止皺紋的作用。
本發明的其它目的在于提供有望具有穩定的抗氧化作用、安全性優異的食品。
本發明人為了解決上述目的，首先對以往果汁壓榨后扔棄的西印度櫻桃種子的有用性進行了深入研究。結果發現由西印度櫻桃種子得到的提取物具有很強的抗氧化能力、膠原酶活性抑制能力和透明質酸酶活性抑制能力，從而完成了本發明。
本發明提供含有西印度櫻桃種子提取物作為有效成分的抗氧化劑，還提供膠原酶活性抑制劑或透明質酸酶活性抑制劑。
本發明還提供含有上述抗氧化劑的皮膚外用劑或化妝品，又提供含有上述抗氧化劑、上述膠原酶活性抑制劑、上述透明質酸酶活性抑制劑的至少一種的皮膚外用劑或化妝品。
本發明又提供含有上述抗氧化劑的食品。
附圖簡述

圖1表示通過柱層析對實施例1中制備的西印度櫻桃種子提取物進行分級，用薄層色譜測定得到的各級分的抗氧化活性的結果的照片。
圖2是表示吸光度隨時間變化的圖譜，用于測定實施例2-5中制備的西印度櫻桃種子提取物的氧化率。
圖3是表示實施例2-5中制備的西印度櫻桃種子提取物在第14天的氧化率的圖譜。
圖4是表示實施例6中制備的西印度櫻桃種子提取物在第20天的氧化率的圖譜。
圖5是表示吸光度隨時間變化的圖譜，用于測定實施例8中制備的西印度櫻桃種子提取物的氧化率。
圖6是表示實施例8中制備的西印度櫻桃種子提取物在第7天的氧化率的圖譜。
圖7是表示吸光度隨時間變化的圖譜，用于測定由實施例9中的配方例5和比較配方例1制備的化妝水的氧化率。
圖8是表示實施例10中配方例5的化妝水為期6個月的DPPH自由基清除試驗結果的圖譜。
圖9是表示實施例10中配方例6的化妝水為期6個月的DPPH自由基清除試驗結果的圖譜。
實施發明的最佳方式以下對本發明進行詳細說明。
本發明的抗氧化劑含有西印度櫻桃種子提取物作為有效成分，該提取物也可作為膠原酶活性抑制劑和透明質酸酶活性抑制劑的有效成分。
西印度櫻桃種子是原產于大西洋加勒比海西印度群島的西印度櫻桃(Acerola，學名Malpighia emarginata DC)的種子。
已知西印度櫻桃果肉中維生素C豐富，被用于食品、化妝品等中，但對于其種子，則幾乎未見其有效利用的途徑。
西印度櫻桃種子提取物只要是例如用提取溶劑提取的即可，對此并沒有特別限定，只要具有亞油酸自氧化抑制能力或DPPH自由基清除作用等抗氧化功能，則對其提取方法或條件沒有特別限定。另外，對西印度櫻桃種子的產地和品種也沒有任何限制，例如產地有沖繩、巴西。
西印度櫻桃種子提取物是指例如將新鮮的西印度櫻桃種子、其干燥物或冷凍物進行粉碎加工，加入水和/或有機溶劑提取得到的提取物；將所得提取物進行濃縮的濃縮物；以及進一步通過液液提取或柱層析等將上述提取物或濃縮物分級提純的分級提純物；上述干燥固化物的總稱；也指其形態可以是液狀、糊狀、固體的任意形式。
為獲得上述提取物而使用的有機溶劑可以是任意的親水性有機溶劑、疏水性有機溶劑。親水性有機溶劑例如有甲醇、乙醇、甘油、丙二醇、1，3-丁二醇等醇；丙酮、四氫呋喃、乙腈、1，4-二噁烷、吡啶、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、乙酸等公知的有機溶劑。疏水性有機溶劑例如有己烷、環己烷、四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、二乙醚、乙酸乙酯、苯、甲苯等公知的有機溶劑。這些有機溶劑在使用時可以使用1種，或將2種以上組合使用。其中，優選水和/或親水性有機溶劑、特別是甲醇、乙醇、1，3-丁二醇，水或它們的混合物或組合。
對于提取條件并沒有特別的限定，例如溫度5-95℃、優選10-90℃、進一步優選15-85℃，在常溫下也可提取。溫度越高，則提取效率有增高趨勢。提取時間為數小時-數天，提取所使用的溶劑量相對于原料，按重量比通常為1-20倍量，優選2-10倍量。
對于提取操作沒有特別限定，可以按照常規方法進行。為了提高提取效率，可以進行振蕩提取，使用具備攪拌機等的提取機進行提取。例如，將西印度櫻桃種子浸漬于提取溶劑中，或不浸漬、與提取溶劑一起攪拌、振蕩，進行提取處理，通過過濾、離心分離或潷析等將處理液分離為提取液和提取殘余物，由此進行提取處理，提取殘余物可進一步進行同樣的提取處理。所得提取液可直接使用，也可以根據需要進一步進行濃縮處理和/或分級、提純處理。
對于上述濃縮處理并沒有特別限定，例如有除去溶劑，利用與水和/或有機溶劑的溶解性的可溶解組分的回收處理，不溶解組分的回收處理，通過水-疏水性有機溶劑的液液分配處理，重結晶處理，再沉淀處理，回收因冷卻而產生的析出物的處理等，或者將選自上述處理的2種以上的處理組合的方法等。
對于上述分級、提純處理并沒有特別限定，例如通過正相和/或反相色譜進行的處理等。
優選作為本發明抗氧化劑的有效成分的西印度櫻桃種子提取物含有櫟苷。另外，作為膠原酶活性抑制劑和透明質酸酶活性抑制劑的有效成分的西印度櫻桃種子提取物也可以含有櫟苷。
本發明的抗氧化劑、以及膠原酶活性抑制劑和透明質酸酶活性抑制劑中，有效成分西印度櫻桃種子提取物的用量可根據使用形式等進行適當選擇。
本發明的皮膚外用劑和化妝品含有上述本發明的抗氧化劑。本發明還可提供含有選自上述抗氧化劑、膠原酶活性抑制劑、透明質酸酶活性抑制劑的至少一種物質的皮膚外用劑和化妝品。
對于上述化妝品的種類沒有特別限定，例如有化妝水、乳液、霜膏、面膜、洗凈劑等皮膚護理化妝品；口紅、粉底等彩妝化妝品；發用化妝品等，其劑型沒有特別限定，可以是任意的。另外，皮膚外用劑有軟膏、各種皮膚用藥等。
本發明的皮膚外用劑和化妝品中，本發明的抗氧化劑、以及膠原酶活性抑制劑或者透明質酸酶活性抑制劑的混合比例可根據其種類和混合的其它成分的種類或量、形態等適當選擇，通常，相對于皮膚外用劑或化妝品總量，換算為西印度櫻桃種子提取物的干燥物，為0.001-20％重量，優選0.01-10％重量。
在不損害本發明所希望的效果的范圍內，本發明的皮膚外用劑或化妝品中可以混合通常作為皮膚外用劑原料或化妝品原料使用的各種其它成分。其它成分例如有水、油劑、表面活性劑、潤滑劑、醇類、水溶性高分子劑、凝膠化劑、保濕劑、緩沖劑、防腐劑、抗炎劑、增稠劑、香料、維生素類、本發明的抗氧化劑以外的抗氧化劑等。使用時，可以從其中適當選擇1種或2種以上進行混合。
本發明的食品只要含有上述本發明的抗氧化劑即可，對食品的種類并沒有特別限定，例如可以是糖、飲料、果醬、口香糖等。對其劑型并沒有特別限制，可以是任意的。
本發明的食品中，本發明的抗氧化劑的混合比例可根據食品種類和該食品中混合的其它成分的種類或量、形態等適當選擇，通常，相對于食品總量，換算為西印度櫻桃種子提取物的干燥物，為0.001-20％重量，優選0.01-10％重量。
在不損害本發明所希望的效果的范圍內，本發明的食品中可以混合通常作為食品原料使用的各種其它成分。其它成分例如有水、醇類、甜味劑、酸味劑、著色劑、防腐劑、香料、賦型劑等。使用時，可以從其中適當選擇1種或2種以上進行混合。
本發明的抗氧化劑，以及透明質酸酶活性抑制劑和膠原酶活性抑制劑是以西印度櫻桃種子提取物為有效成分，安全性優異，且具有很強的抗氧化作用、透明質酸酶活性抑制作用或者膠原酶活性抑制作用。本發明的皮膚外用劑、化妝品和食品含有本發明的抗氧化劑、以及透明質酸酶活性抑制劑或者膠原酶活性抑制劑，因此可得到抗老化作用、防皺紋作用、源自活性氧的食品品質保持或防止氧化的作用。除此之外還可以有效利用作為工業廢棄物的西印度櫻桃種子。
實施例以下通過實施例進一步詳細說明本發明，但本發明并不限于這些。
實施例1將洗凈的西印度櫻桃種子干燥后破碎，得到6140g粉碎物，向其中加入7倍重量的甲醇，在室溫下攪拌過夜。將總量離心后過濾，將濾液濃縮干燥固化，得到225.89g提取物(A)。
向該提取物(A)中加入2000ml水，再加入1200ml己烷并振蕩后，回收分離出的水層。對該水層再重復兩次使用己烷的同樣的振蕩。除去己烷層，向得到的水層中加入1200ml乙酸乙酯進行振蕩，將該操作重復10次，收集分離的乙酸乙酯層，濃縮干燥固化，得到11.48g濃縮物(A)。接著，使用充填了硅膠(Wakosil C-300和光純藥社制造)的柱子，通過硅膠柱層析將濃縮物(A)分級。用氯仿、氯仿∶甲醇(97∶3、9∶1、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8)、甲醇依次洗脫。將氯仿洗脫的部分分成15個組分(組分1-15)，將之后的氯仿∶甲醇洗脫部分分別作為組分16(97∶3)、17(9∶1)、18(8∶2)、19(6∶4)、20(4∶6)。
通過使用薄層色譜(TLC)的評價方法確認各組分的抗氧化活性。即，將各組分試樣點樣于硅膠薄層板，用展開溶劑進行展開。此時使用含有熒光指示劑的板(K5F Silica Gel 150Whatman制造)，展開后對干燥的板照射紫外線，檢測具有UV吸收的試樣斑點。然后對板噴穩定的自由基—二苯基對苦基肼(DPPH)的6×10-4M甲醇溶液。DPPH溶液呈紫色，但如果自由基被清除，則其顏色消失。因此，具有自由基清除活性的物質的斑點部分中，因DPPH自由基被清除而使斑點部分露白。
將組分1-20點樣于硅膠板，用氯仿∶甲醇＝9∶1的溶劑將其展開至板頂端，然后噴霧DPPH溶液。結果如圖1所示。由圖1可知西印度櫻桃種子提取物中含有具抗氧化活性的多種物質。
其中，通過反相高效液相色譜(HPLC)進一步純化組分19。先通過下述洗脫條件進行粗提純，再通過以下的條件進行提純。HPLC的條件如下所示。
柱Hydrosphere C-18[20×250mm](YMC)、流速5ml/分鐘、溫度35℃檢測UV 254nm、洗脫液在30％甲醇(0-2分鐘)、30-100％甲醇(2-32分鐘、線性)、100％甲醇(32-40分鐘)、30％甲醇(40-50分鐘)的條件下粗提純，然后用乙腈/水(30/70)進行最終提純，得到72mg分級提純物。
對所得分級提純物進行各種譜測定。所得數據如下。
質譜[M-H]-447紫外線吸收光譜(EtOH)256.5nm、352.00nm、H-NMR化學位移500MHz溶劑CD3OD、0.94ppm(dJ＝6.1Hz)、6.91ppm(dJ＝8.2Hz)、7.31ppm(d，dJ＝8.2，2.1Hz)、7.34ppm(dJ＝2.1Hz)、6.20ppm(dJ＝2.1Hz)、6.37ppm(dJ＝2.1Hz)、3.33ppm(mJ＝9.5，9.3Hz)、3.41ppm(mJ＝9.5Hz)、3.74ppm(d，dJ＝9.3，3.3Hz)、4.21ppm(d，dJ＝3.3Hz)、5.35ppm(dJ＝1.7Hz)、C-NMR化學位移125.8MHz溶劑CD3OD、17.7ppm、72.0ppm、72.1ppm、72.2ppm、73.3ppm、94.8ppm、99.9ppm、103.6ppm、106.0ppm、116.4ppm、117.0ppm、122.9ppm、123.1ppm、136.3ppm、146.5ppm、149.9ppm、158.6ppm、159.4ppm、163.3ppm、166.0ppm、179.7ppm。
質譜中，在m/z 447觀察到被認為是去質子化分子的離子，分子量可認為是448。H-NMR中，0.94ppm為CH3，6.91ppm、7.31ppm、7.34ppm屬于1，2，4-取代苯，6.20ppm、6.37ppm屬于1，2，3，5-取代苯的1H。3.33-5.35ppm中觀測到5種峰。13C-NMR譜中觀測到21個峰，其中70-74ppm的4個峰可能是＞CH-O-，179.7ppm中觀測到可歸屬為共軛羰基的峰。這些數據顯示所述物質可能是櫟精糖苷，因此進一步進行了高分辨能力質譜的測定，并與作為櫟精糖苷的分子量448的櫟苷標準品的NMR譜進行了比較。進行高分辨能力質譜測定的結果，得到447.0917的精密重量，以C、H、O作為元素種類進行組成計算。結果計算出滿足13C-NMR譜中觀測到的碳原子數21的組成式C21H19O11，確定了分子式為C21H19O11。進一步將NMR譜與櫟苷(櫟精-3-鼠李糖苷)標準品的譜進行比較，結果一致，因此鑒定出由西印度櫻桃種子提取物分離提純的物質是櫟苷。
已知櫟苷是類黃酮的一種，在自然界中廣泛分布，特別是在魚腥草中豐富含有。由以上的結果判斷西印度櫻桃種子中含有櫟苷，該櫟苷是與提取物中的抗氧化活性有關的物質之一。
實施例2將100g洗凈的西印度櫻桃種子破碎，加入3倍體積的水，在室溫下振蕩一晚。將總量用玻璃濾器、0.65μm濾器和0.22μm濾器過濾，然后將濾液濃縮干燥固化，得到1g提取物。
接著，通過使用亞油酸的抗氧化活性測定(硫氰酸鐵法)，對得到的提取物的抗氧化活性進行測定。
即，在2ml 2.5％(w/v)亞油酸(99.5％乙醇溶液)和4ml 0.05M磷酸緩沖液(pH 7.0)的反應液中混合含有0.4mg西印度櫻桃種子提取物、2ml 99.5％乙醇和2ml蒸餾水的混合液，裝入褐色螺口瓶，制備10ml試驗液。另外使用α-生育酚或BHA代替西印度櫻桃種子提取物，使反應液中含有與西印度櫻桃種子提取物等量的上述物質，進行同樣的操作，制備各試驗液，以它們作為正對照。對照組采用不添加西印度櫻桃種子提取物、只將2ml 99.5％乙醇和2ml蒸餾水添加到反應液中的試驗液。將所得各試驗液置于暗處，在40℃保存，以此作為樣品，將在4℃保存的作為空白試樣，隔一段時間取出被檢物，按照以下的方法進行測定。試驗進行14天。
首先，在0.1ml被檢物、9.7ml 75％乙醇和0.1ml 30％硫氰酸銨水溶液的混合液中加入0.1ml 2×10-2M的氯化亞鐵(3.5％鹽酸溶液)，3分鐘后準確測定500nm的吸光度。對于空白試樣也同樣測定，Δ吸光度＝(主體樣品的吸光度)-(空白樣品的吸光度)。試樣開始氧化，則吸光度上升，達到最高點后，隨著要被氧化的試樣的減少，吸光度減小。因此，吸光度的峰早開始，則可以說抗氧化活性弱。另外，用氧化率對各試驗液的抗氧化活性進行比較。氧化率是以對照的氧化(Δ吸光度)為100％，通過以下的式子求出。氧化率越高則意味著抗氧化活性越低。
氧化率(％)＝([試樣的Δ吸光度]/[對照的Δ吸光度])×100吸光度隨時間變化的結果如圖2所示，試驗開始后第14天各試樣溶液的氧化率如圖3所示。圖3中，(C-1)表示對照，(C-2)表示α-生育酚，(C-3)表示BHA，(E-2)表示實施例2中制備的西印度櫻桃種子提取物，(E-3)表示實施例3中制備的西印度櫻桃種子提取物，(E-4)表示實施例4中制備的西印度櫻桃種子提取物，(E-5)表示實施例5中制備的西印度櫻桃種子提取物。
實施例3將100g洗凈的西印度櫻桃種子破碎，加入3倍體積、乙醇含量為25％體積的含水乙醇水溶液，在室溫下振蕩一晚。將總量用與實施例2同樣的濾器過濾，然后將濾液濃縮干燥固化，得到1.69g提取物。
用得到的提取物，與實施例2同樣地測定抗氧化活性。吸光度隨時間變化的結果如圖2所示，試驗開始后第14天各試樣溶液的氧化率如圖3所示。
實施例4將100g洗凈的西印度櫻桃種子破碎，加入3倍體積、乙醇含量為50％體積的含水乙醇水溶液，在室溫下振蕩一晚。將總量用與實施例2同樣的濾器過濾，然后將濾液濃縮干燥固化，得到2.27g提取物。
用得到的提取物，與實施例2同樣地測定抗氧化活性。吸光度隨時間變化的結果如圖2所示，試驗開始后第14天各試樣溶液的氧化率如圖3所示。
實施例5將100g洗凈的西印度櫻桃種子破碎，加入3倍體積、乙醇含量為75％體積的含水乙醇水溶液，在室溫下振蕩一晚。將總量用與實施例2同樣的濾器過濾，然后將濾液濃縮干燥固化，得到2.50g提取物。
用得到的提取物，與實施例2同樣地測定抗氧化活性。吸光度隨時間變化的結果如圖2所示，試驗開始后第14天各試樣溶液的氧化率如圖3所示。
圖2和3表明西印度櫻桃種子提取物明顯具有抑制亞油酸氧化的效果，其強度與代表性的抗氧化劑α-生育酚、BHA比較，為同等或同等以上。并且，實施例2-5的結果表明通過改變作為提取溶劑使用的含水乙醇中乙醇的比例，可以控制抗氧化活性的強度。
實施例6將760g洗凈的西印度櫻桃種子破碎，加入5倍重量的甲醇，在室溫下攪拌過夜。將總量離心后過濾，將濾液濃縮干燥固化，得到12.36g提取物。向該提取物中加入300ml水，再加入100ml己烷并振蕩，然后回收分離出的水層。對該水層再重復3次使用己烷的同樣的振蕩。除去己烷層，向得到的水層中加入100ml乙酸乙酯進行振蕩，將該操作重復6次，收集乙酸乙酯層，濃縮干燥固化，得到0.41g固體成分。
接著，用與實施例2同樣的硫氰酸鐵法測定所得西印度櫻桃種子提取物的抗氧化活性。此時試驗期間為20天。試驗開始后第20天各試樣溶液的氧化率如圖4所示。圖4中，(C-1)表示對照，(C-2)表示α-生育酚，(C-3)表示BHA，(E-6)表示實施例6中制備的西印度櫻桃種子提取物。
圖4表明西印度櫻桃種子提取物的乙酸乙酯組分與提取物本身同樣，明顯具有抑制亞油酸氧化的效果，其強度比α-生育酚強。
實施例7將70g洗凈的西印度櫻桃種子破碎，加入4倍重量的、1，3-丁二醇含量為30％重量的1，3-丁二醇水溶液，在室溫下攪拌過夜。將總量離心后，將上清液用0.22μm濾器過濾，得到124.12g西印度櫻桃種子提取物的溶液。
通過以下的DPPH自由基清除方法測定所得西印度櫻桃種子提取物的抗氧化活性。結果如表1所示。
在1600μl 250mM乙酸緩沖液(pH＝5.5)中混合1200μl乙醇、400μl受檢樣本(制備成任意的濃度)，在30℃預溫育5分鐘。在該液體中添加混合800μl 500μM DPPH/乙醇溶液，在30℃放置30分鐘后測定517nm的吸光度。對α-生育酚也進行同樣的操作，以此作為正對照。對照是使用其它溶劑代替試樣溶液，進行同樣的操作。通過下式，由所測定的吸光度計算自由基清除率。
清除率(％)＝(1-[試樣的吸光度]/[對照的吸光度])×100分階段變更試樣溶液的試樣濃度，進行上述清除率的測定，求出DPPH自由基的清除率為50％時試樣溶液的濃度，以此作為DPPH自由基50％清除濃度。因此，該數值低，則意味著自由基清除能力高。
表1

表1表明實施例7的提取物具有與α-生育酚同等的自由基清除能力。
實施例8將1500g洗凈的西印度櫻桃種子破碎，加入2倍重量的、1，3-丁二醇含量為30％重量的1，3-丁二醇水溶液，在室溫下攪拌過夜。將總量離心后，將上清液用0.22μm濾器過濾，得到2327g西印度櫻桃種子提取物溶液。
用與實施例2同樣的硫氰酸鐵法測定所得西印度櫻桃種子提取物的抗氧化活性。由于西印度櫻桃種子提取物是溶液，因此要用水和乙醇將其稀釋成所需濃度后再添加，西印度櫻桃種子提取液的對照采用與添加的西印度櫻桃種子提取液同樣的溶劑組成，但不含西印度櫻桃種子提取物的樣品。試驗期間為7天。
吸光度隨時間的變化結果如圖5所示，試驗開始后第7天各試樣溶液的氧化率如圖6所示。圖6中，(C-1)表示對照，(C-2)表示α-生育酚，(C-3)表示BHA，(E-8)表示實施例8中制備的西印度櫻桃種子提取物。
圖5和6表明西印度櫻桃種子提取物明顯具有抑制亞油酸氧化的效果，其強度與α-生育酚、BHA相比為同等或同等以上。
一直以來，已知維生素C具有抗氧化作用，因此測定了上述制備的西印度櫻桃種子提取液中的維生素C的量，研究上述西印度櫻桃種子提取液的抗氧化作用是否只來源于所含的維生素C。
首先測定100g上述制備的西印度櫻桃種子提取液中含有的維生素C量，結果為57mg/100g(氧化型維生素C56mg/100g+還原型維生素C1mg/100g)。將100g上述制備的西印度櫻桃種子提取液蒸發干燥固化，可得到975mg固體成分。接著，用與實施例2同樣的硫氰酸鐵法測定抗氧化活性。此時，由于本實施例的西印度櫻桃種子提取物是溶液，因此與上述同樣，要進行稀釋，使反應液中含有的固體成分為0.4mg后再添加。對照也與上述同樣，采用與添加的西印度櫻桃種子提取液同樣的溶劑組成，但不含西印度櫻桃種子提取物的樣品。測定進行7天。使用該0.4mg固體成分中含有的0.023mg維生素C(0.4mg×(57mg/975mg))同樣地進行抗氧化活性測定，以此作為對照。
試驗開始后第7天，西印度櫻桃種子提取物的氧化率為1.9％，而單獨的維生素C的氧化率為115.8％。
以上結果表明，西印度櫻桃種子提取物中所含維生素C對該提取物的抗氧化作用幾乎沒有貢獻。
本發明的西印度櫻桃種子提取物中，對于在實施例1中確認的顯示抗氧化作用的物質之一櫟苷，與實施例1同樣地測定上述制備的西印度櫻桃種子提取物中是否含有該櫟苷。結果表明含有櫟苷。
以往，例如日本特開平7-300581號公報中提出了櫟苷具有抗氧化作用。這里，通過以下的方法研究上述西印度櫻桃種子提取液的抗氧化作用是否只源自所含的櫟苷。
首先，櫟苷是多酚的一種，因此通過Folin-Denis法測定上述制備的西印度櫻桃種子提取液中的多酚量，結果100g提取液中固體成分為975mg，其中多酚所占的比例為25％。因此，上述制備的西印度櫻桃種子提取液的固體成分中所含的櫟苷量最大為25％。基于該結果，如上述維生素C的比較試驗那樣，用與實施例2同樣的硫氰酸鐵法測定抗氧化活性。此時測定進行7天。作為對照，使用假設0.4mg該固體成分中含有32％櫟苷(最大量為25％，即為比該值高的量)時的0.128mg櫟苷，同樣地進行抗氧化活性測定。
結果，試驗開始后第7天，西印度櫻桃種子提取物的氧化率為1.9％，而單獨的櫟苷的氧化率為6.9％。
以上結果表明西印度櫻桃種子提取物中含有的櫟苷是該提取物的抗氧化作用的有效成分之一，但該提取物的抗氧化作用不只是櫟苷的作用，并且西印度櫻桃種子提取物比單獨的櫟苷的抗氧化作用更為優異。
參考例1通過以下的方法測定實施例2-5中制備的各西印度櫻桃種子提取物的膠原酶活性抑制作用。
底物溶液將0.39mgPz-肽(BACHEM公司生產)溶解于1ml 0.1MTris鹽酸緩沖液(pH 7.1、含20mM氯化鈣)使用(相當于0.5mM)。
酶溶液將5mg膠原酶(IV型、SIGMA公司生產)溶解于1ml蒸餾水，分別取100μl，在-20℃下保管，使用時用蒸餾水稀釋為50倍，用于反應。

分別用提取溶劑溶解提取物進行制備，使實施例2的提取物濃度為15mg/ml，使實施例3、4、5的提取物濃度為0.5mg/ml，以此作為試樣溶液。將50μl這些試樣溶液、50μl膠原酶溶液和400μl底物溶液混合，在37℃溫育30分鐘。接著，用1ml 25mM檸檬酸溶液使反應終止，用5ml乙酸乙酯提取。離心分離(3000rpm、10分鐘)后，以乙酸乙酯作為對照，測定波長320nm下乙酸乙酯層的吸光度。使用各提取溶劑代替試樣溶液，以此作為對照，另外分別加入蒸餾水代替酶溶液，以此作為空白試樣，進行同樣的操作。
通過下式，由這些值計算膠原酶活性抑制率。
抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]×100A試樣溶液在320nm的吸光度、B空白試樣溶液在320nm的吸光度、C對照溶液在320nm的吸光度、D空白對照溶液在320nm的吸光度。
通過上述方法求出實施例2-5的提取物的膠原酶活性抑制率。結果如表2所示。
表2

參考例2按照與參考例1同樣的方法，對實施例8中制備的西印度櫻桃種子提取物進行膠原酶活性抑制作用的測定。實施例8的提取物是溶液，因此用作為提取溶劑的30％重量1，3-丁二醇水溶液稀釋，使西印度櫻桃種子提取物作為固態物質的濃度是0.5mg/ml，以此作為試樣溶液。這樣求得實施例8的提取物的膠原酶活性抑制率，結果為71.5％。
參考例3測定實施例8中制備的提取物的透明質酸酶活性抑制作用。透明質酸酶活性抑制的測定通過應用了Morgan-Elson法的前田有美惠等人的方法(食衛志、31卷、233-237、1990年)進行。
測定方法[試劑的制備]酶溶液將牛睪丸透明質酸酶(和光純藥工業(株)生產)溶解于0.1M乙酸緩沖液(pH＝4.0)，調節至最終酶活性為400單位/ml。
酶活化溶液將compound 48/80(SIGMA公司生產)溶解于0.1M乙酸緩沖液(pH＝4.0)，調節至最終濃度為0.1mg/ml。
底物溶液將透明質酸鉀(和光純藥工業(株)生產)溶解于0.1M乙酸緩沖液(pH＝4.0)，調節至最終濃度為0.4mg/ml。
硼酸溶液在4.95g硼酸中加入50ml水，用1N氫氧化鈉溶液調節至pH＝9.1，加入水，調節為100ml。
對二甲基氨基苯甲醛(p-DAB)試劑在12.5ml 10N鹽酸和87.5ml乙酸的混合液中溶解10g p-DAB(和光純藥工業(株)生產)，冷藏保存。臨使用前用乙酸稀釋10倍使用。
實施例8的提取物是溶液，因此用作為提取溶劑的30％重量1，3-丁二醇水溶液稀釋，使西印度櫻桃種子提取物作為固態物質的濃度為1mg/ml，以此作為試樣溶液。向0.2ml該試樣溶液中加入0.1ml酶溶液，在37℃放置20分鐘。接著加入0.2ml酶活化溶液，在37℃加熱20分鐘，再加入0.5ml底物溶液，在37℃反應40分鐘，然后加入0.2ml 0.4N的氫氧化鈉水溶液，同時冰冷卻，使反應終止。加入0.2ml硼酸溶液，通過熱浴(hot block bath)(TOYOSEISAKUSHO、型號TPB-32)在100-120℃加熱5分鐘，然后冰冷卻，加入6ml p-DAB試劑，在37℃加熱20分鐘，使其顯色，以蒸餾水作為對照，測定585nm下的吸光度。使用提取溶劑代替試樣溶液，以此作為對照，另外分別加入0.1M乙酸緩沖液(pH＝4.0)代替酶溶液，以此作為空白試樣，進行同樣的操作。
通過下式，由這些值計算透明質酸酶活性抑制率。
抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]×100A試樣溶液在585nm的吸光度、B空白試樣溶液在585nm的吸光度、C對照溶液在585nm的吸光度、D空白對照溶液在585nm的吸光度。
通過上述方法求出實施例8的提取物的透明質酸酶活性抑制率，結果為94.5％。
參考例4按照1997年3月26日發布的日本厚生省第21號令“關于藥品安全性的非臨床試驗實施基準的省令(部頒標準)”，進行西印度櫻桃種子提取物的安全性試驗。西印度櫻桃種子提取物采用實施例8中制備的西印度櫻桃種子提取物。結果如表3所示。
使用大鼠進行的單次經口給予毒性試驗2組大鼠(對照組、給予組)，雌雄各5只/組，進行試驗，給予組按照2g/kg體重給予。
使用豚鼠進行的皮膚單次刺激性試驗在3只豚鼠的健康皮膚上進行24小時密封貼用，在給予后24小時、48小時和72小時，分別觀察皮膚的狀態進行判定。
使用豚鼠進行的14天皮膚累積刺激性試驗在3只豚鼠的健康皮膚上，在開放體系下，每天涂布一次，連續14天，在試驗期間，每天在涂布前和涂布后24小時分別觀察皮膚的狀態進行判定。
使用豚鼠進行的皮膚致敏性試驗3組豚鼠(對照組、涂布組、DNCB組)，5只/組，按照佐劑和膚斑試驗法(Adjuvant and Patch Test)進行試驗，涂布后24小時和48小時，分別觀察皮膚的狀態進行判定。
使用豚鼠進行的皮膚光毒性試驗按照森川藤凰等人的方法，在10只豚鼠的背部皮膚上進行試驗，紫外線照射后24小時、48小時和72小時，分別觀察皮膚的狀態進行判定。
使用豚鼠進行的皮膚光致敏性試驗3組豚鼠(對照組、給予組、TCSA組)，5只/組，按照Ajuvant andStrip法進行試驗，紫外線照射后24小時和48小時，分別觀察皮膚的狀態進行判定。
使用兔進行的眼粘膜刺激性試驗以2組兔(非洗眼組、洗眼組)，3只/組進行試驗。滴眼后，不對非洗眼組進行處理，用微溫的生理鹽水對洗眼組清洗約1分鐘，然后在1小時、24小時、48小時和72小時后觀察角膜、虹膜和結膜的狀態，由AFNOR區分進行判定。
使用細菌進行的回復突變試驗按照預溫育法，對未添加S9mix和添加S9mix的情況進行測定。
·使用菌株鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)TA100、TA98、TA1535、TA1537·使用菌株大腸桿菌(Escherichia coli)WP2uvrA使用哺乳類的培養細胞進行的染色體異常試驗使用哺乳類的培養細胞(CHL/IU細胞)，采取短時間處理法(6小時處理未添加S9mix和添加S9mix)和連續處理組(處理24小時和48小時)對3組(陰性對照組、受檢物質組、陽性對照組)進行研究。
表3

配方例1將0.20重量份甘草酸二鉀、0.10重量份檸檬酸、0.30重量份檸檬酸鈉、5.00重量份實施例7中制備的西印度櫻桃種子提取物和5.00重量份1，3-丁二醇混合，加入純凈水，使總量為80.0重量份，在50℃下一邊攪拌一邊溶解，制成含有提取物的水溶液。
接著，將0.90重量份POE(60)山梨醇四油酸酯、0.10重量份失水山梨醇一油酸酯、適量的防腐劑和10.00重量份乙醇混合，在50℃下一邊攪拌一邊溶解。接著，將所得溶液一點點加入到最初制備的含提取物的水溶液中，在50℃混合攪拌。均勻混合后進一步攪拌，同時將液溫由50℃下降到30℃，在到達30℃時停止攪拌，加入適量的香料和純凈水，使總量為100.00重量份。再次混合攪拌，均勻混合，制成化妝水。
配方例2將10.00重量份角鯊烯和適量的防腐劑混合，加入純凈水，調節至總量為70.00重量份，加熱至80℃，制成溶液(1)。另外，將0.10重量份羧基乙烯基聚合物和0.20重量份黃原酸膠加入到適量的純凈水中，在常溫下攪拌溶解，制成溶液(2)。再將0.10重量份三乙醇胺和5.00重量份1，3-丁二醇加入到適量的純凈水中，在常溫下攪拌溶解，制成溶液(3)。又將2.00重量份透明質酸鈉和5.00重量份實施例8中制備的西印度櫻桃種子提取物加入到適量的純凈水中，在常溫下攪拌溶解，制成溶液(4)。
接著，向適量的純凈水中一點點加入溶液(1)，在80℃混合攪拌，并一邊攪拌一邊加入溶液(2)，接著加入溶液(3)。均勻混合后，一邊攪拌一邊將溶液降溫至50℃，在到達50℃時加入溶液(4)，再加入純凈水，將總量調節至100重量份。再次攪拌，直至溶液為30℃，在到達30℃時停止攪拌，制成均勻混合的乳液。
配方例3將2.00重量份POE(20)失水山梨醇一硬脂酸酯、0.50重量份POE失水山梨醇四油酸酯、0.50重量份一硬脂酸甘油酯、7.00重量份硬脂酸、3.00重量份鯨蠟醇、3.00重量份棕櫚酸鯨蠟醇酯、7.00重量份霍霍巴油、3.00重量份石蠟和適量的防腐劑混合，在80℃邊攪拌邊溶解，制成溶液(1)。另一方面，將5.00重量份實施例8中制備的西印度櫻桃種子提取物、7.00重量份1，3-丁二醇和62重量份純凈水混合，在80℃邊攪拌邊溶解，制成溶液(2)。
接著，向溶液(2)中一點點加入溶液(1)，乳化，邊攪拌邊冷卻，降溫至40℃時停止攪拌，制成均勻混合的霜膏。
配方例4向100g濃縮葡萄果汁、150g糖類、15g蜂蜜、1.5g在與實施例2同樣的條件下制備的西印度櫻桃種子提取物(A)以及適量的香料中混合純凈水，使總量為1000g。接著在95℃滅菌20分鐘，在無菌狀態下分別向瓶中裝入100ml，制成葡萄果汁。
配方例5將0.6重量份POE(30)POP(6)癸基十四烷基醚、10.0重量份乙醇和0.1重量份羥苯甲酸甲酯在50℃混合攪拌，向該溶液中加入另行如下制備的溶液將0.1重量份檸檬酸鈉、1.0重量份吡咯烷酮羧酸鈉、4.4重量份1，3-丁二醇和適量純凈水在50℃混合攪拌而成。一邊攪拌一邊冷卻至30℃。再添加2.0重量份實施例8中制備的西印度櫻桃種子提取物，混合攪拌，最后加入適量的純凈水，將總量調節至100重量份，再次攪拌，均勻混合，制成化妝水。
配方例6將1，3-丁二醇的混合量變更為3.5重量份，將實施例8中制備的西印度櫻桃種子提取物的混合量變更為5.0重量份，除此之外與配方例5同樣地制備化妝水。
比較配方例1將1，3-丁二醇的混合量變更為5.0重量份，不混合實施例8中制備的西印度櫻桃種子提取物，除此之外與配方例5同樣地制備化妝水。
實施例9用與實施例2同樣的硫氰酸鐵法測定配方例5中制備的化妝水的亞油酸氧化抑制作用。作為比較，對不含西印度櫻桃種子提取物的比較配方例1中制備的化妝水也同樣進行氧化抑制作用的測定。
本實施例中，向實施例2的反應液中加入2ml配方例5或比較配方例1中制備的各化妝水、1.8ml 99.5％乙醇和0.2ml蒸餾水，用以代替實施例2中所加的0.4mg西印度櫻桃種子提取物、2ml 99.5％乙醇和2ml蒸餾水，進行試驗。
吸光度隨時間變化的結果如圖7所示。另外，以第21天時比較配方例1中制備的化妝水試樣的氧化率(Δ吸光度)為100％，與實施例2同樣地求出試驗開始后第28天時配方例5中制備的化妝水試樣的氧化率，結果為7.2％。
由圖7和上述氧化率試驗結果可知混合西印度櫻桃種子提取物而制備的配方例5的化妝水與比較配方例1的化妝水相比，顯示出優異的亞油酸氧化抑制作用，另外，經過28天后其作用仍然持續。
由此可確認混合有西印度櫻桃種子提取物的化妝水具有穩定性優異的抗氧化作用。
實施例10為了驗證在化妝水制備后經過1個月以上，混合有西印度櫻桃種子提取物的化妝水的抗氧化作用仍持續有效，將配方例5、配方例6和比較配方例1中制備的化妝水在下述條件下保存6個月，進行與實施例7同樣的抗氧化試驗，評價保存后對DPPH自由基清除作用的變化。
保存方法制備配方例5和配方例6的化妝水后，在避光條件下、分別在4℃、25℃、40℃下保存6個月，剛制備、制備后2周以及制備后1、2、3、4、6個月后，實施DPPH自由基清除試驗。作為比較，對于比較配方例1的化妝水也同樣保存和進行試驗。
本實施例中，向實施例7的反應液中加入400μl`配方例5或配方例6中制備的化妝水，用以代替實施例7中所添加的400μl西印度櫻桃種子提取物，進行試驗。另外，代替配方例5和配方例6中制備的化妝水，使用添加了在相同條件下保存的比較配方例1中制備的化妝水的試樣，以其吸光度作為對照，與實施例7同樣地求出DPPH自由基清除率(％)。
對配方例5和配方例6中制備的化妝水進行了6個月的DPPH自由基清除試驗，結果分別表示在圖8和圖9中。
由圖8和圖9可知混合有西印度櫻桃種子提取物的配方例5和配方例6的化妝水顯示優異的DPPH自由基清除作用，即使在40℃這樣嚴酷的條件下保存6個月，其作用也不會消失。另外，其中西印度櫻桃種子提取物的混合量多的配方例6的化妝水顯示高的抗氧化作用，持久性也優異。
以上表明混合有西印度櫻桃種子提取物的化妝水即使長時間、特別是在高溫下長期保存，也具有強的、優異的抗氧化作用，并且西印度櫻桃種子提取物的混合量越高，其作用越值得期待。
權利要求
1.抗氧化劑，該抗氧化劑含有西印度櫻桃種子提取物作為有效成分。
2.權利要求1的抗氧化劑，其中西印度櫻桃種子提取物含有櫟苷。
3.含有權利要求1的抗氧化劑的皮膚外用劑。
4.含有權利要求1的抗氧化劑的化妝品。
5.含有權利要求1的抗氧化劑的食品。
全文摘要
本發明涉及可以有效利用作為廢棄物處理的西印度櫻桃種子、安全性優異的用于皮膚外用劑、化妝品或食品等中顯示優異的抗氧化作用的抗氧化劑，以及含有該抗氧化劑的皮膚外用劑、化妝品或食品，其中含有西印度櫻桃種子作為有效成分。
文檔編號A61K8/97GK1738888SQ20038010900
公開日2006年2月22日 申請日期2003年11月21日 優先權日2002年11月25日
發明者永峰賢一, 林美希, K·山崎 申請人:株式會社日冷生物科學