專利名稱：保存核酸樣本的方法
技術領域：
本發明是關于一種保存核酸樣本的試劑與方法，尤指一種適用于穩定或保存RNA樣本的試劑與方法。
背景技術：
目前已知，以細胞內核酸為分析標的的醫學檢驗方式，可以預測疾病產生的可能性，并達到早期發現的目的，故核酸檢驗技術已成為臨床生化檢驗發展的重要趨勢。然而，進行核酸分子檢測所需的核酸分子的樣本準備極為不易，尤其是極具活性的RNA核酸分子。一般公知萃取純化RNA核酸分子的方式，主要是將抽出的全血加入抗凝血劑(如EDTA)后，放在4℃環境中保存，并必須在24小時內分離出白血球完成RNA萃取；由于RNA表現量會因抗凝血劑的加入、環境溫度的改變、保存時間的長短，以及白血球分離的流程，而造成改變，使得預測疾病產生可能性的困難度增加；使用目前常用的方法，最佳狀況是必須在24小時內完成RNA萃取，因此臨床上，醫檢人員將無法負荷臨時大增的檢體量。
目前市面上雖有Qiagen公司提出解決方案，以其發展的PAXgene RNAstabilization buffer搭配PAXgene Blood RNA Isolation Kit來穩定及萃取全血液中的核酸分子。然而從整體核酸分子檢驗技術的發展上，Qiagen公司提供的套組由于售價過于昂貴，使得其技術的推廣有所限制。
W02004013155一案中公開了一種穩定核酸的方法，其主要是以化學物質，于核酸分子上第2’、3’或5’的羥基形成一保護基，來修飾、保護核酸分子，使得核酸酶無法分解核酸，由此使核酸分子穩定存在于細胞中，最后再以一級胺試劑移除保護基，以利后續萃取的進行；此時所提供的一級胺試劑，主要作用在移除保護基。
在US2004048384一案中所公開的方法與裝置，主要對象為一生物性樣本，所公開的收集裝置中含有基因誘導阻斷劑(gene induction blockingagent)，可使收集入該收集裝置中的生物性樣本與該阻斷劑接觸，而達成穩定檢體內核酸的效果；其中所公開的阻斷劑主要以四級胺類為主。
而在CA2299119一案中，是公開一種穩定或萃取核酸的方法，其使用含至少兩個四級胺或含磷結構的陽離子聚合物來沉淀并保護核酸；US2004014703一案中同樣使用含有四級胺或含磷結構的陽離子界面活性劑來沉淀并保護核酸；上述方法所使用的試劑多以四級胺或含磷結構的陽離子聚合物來進行。

發明內容
本發明的目的在于提供一種保存核酸樣本的方法。
本發明穩定核酸的方法有別于以抗凝血劑或4℃冰存的保存方法，是利用一級、二級、三級胺界面活性劑、或不同比例的三種胺類界面活性劑混合液，與核酸分子以離子鍵方式結合，并包裹住DNA及RNA形成疏水性沉淀物，同時可使RNA不受溶液中所含豐富RNase的破壞，并使DNA無法復制出RNA，以穩定進而保存全血液中核酸分子；相對于傳統保存方式，本發明方法的穩定保存時間可大幅拉長，且易于操作，更容易與自動化儀器搭配以達成自動化操作的目的，增進核酸分子檢測的技術發展與應用推廣。
本發明穩定或保存生物檢體中RNA方法，是將生物檢體與一含有胺類界面活性劑的試劑進行接觸，使生物檢體中RNA與胺類界面活性劑形成一絡合物，其中胺類界面活性劑具備如式(I)的通式R1R2R3N(O)x，式(I)；其中，R1與R2分別為氫，含1-6個碳的烷基，含6-12個碳的芳香烴基或是含6-12個碳的烴基芳香烴基；R3為含1-20個碳的烷基、含6-26個碳的芳香烴基或是含6-26個碳的烴基芳香烴基；且x為0或1。
本發明亦提供了一種穩定生物檢體中核酸的試劑，包括一具備如式(I)的胺類界面活性劑R1R2R3N(O)x， 式(I)；其中，R1與R2分別為氫，含1-6個碳的烷基，含6-12個碳的芳香烴基或是含6-12個碳的烴基芳香烴基；R3為含1-20個碳的烷基、含6-26個碳的芳香烴基或是含6-26個碳的烴基芳香烴基；且x為0或1。
當生物檢體與本發明試劑進行接觸后，將使生物檢體中核酸與胺類界面活性劑形成一絡合物，使核酸因為被包覆住形成疏水性沉淀物，而使RNA不受RNase的破壞，且使DNA無法復制出RNA，同時達到保存RNA及穩定RNA表現量的雙重效果。
于本發明中，胺類界面活性劑結構的較佳情況是，x為0時，R1與R2分別為含氫，或含1-6個碳的烷基，且R3為含1-20個碳的烷基。同時，本發明方法與試劑中所適用的成分不限制，較佳為含有十二烷胺(dodecylamine)，N-甲基十二烷胺(N-methyldodecylamine)，N，N-二甲基十二烷胺N，N-dimethyldodecylamine)，氧化氮N，N-二甲基十二烷胺N，N-dimethyldodecylamine N oxide)以及4-十四烷胺(4-tetradecylaniline)的胺類界面活性劑者；且本發明中所使用的試劑其型態不限，可以是以一液狀型態使用，也可以以一固態方式與生物檢體相接觸，而為使檢體中核酸與試劑的成分充分混合，本發明最佳實施方式是以液態方式呈現。
本發明中，胺類界面活性劑存在于試劑中的含量不限，在液態介質中的含量較佳為0.001％至20％的濃度百分比，或是在固態基質中含量為10％至90％的重量百分比。
于本發明中，含有至少一種上述的胺類界面活性劑以及至少一種酸性鹽類的試劑即可適用于核酸的穩定與保存，而為使試劑發揮保存核酸的最佳狀況，本發明中所使用的試劑更包括至少一種非離子界面活性劑；而其中，非離子界面活性劑的種類不限制，較佳為聚氧化乙烯類(polyoxyethylene)的非離子性界面活性劑，如Tween 20或Triton X-100；最佳為Triton X-100；非離子界面活性劑的使用量或濃度不限制，在液態介質中的含量較佳為0.01％至20％的濃度百分比或在固態基質中含量為0.01％至40％的重量百分比。
試劑中所使用的酸性鹽類可以是本領域具通常知識者常用的任何一種，較佳是選自由下列物質所組成的群組順丁烯二酸(maleic acid)，酒石酸(tartaric acid)，檸檬酸(citric acid)，草酸(oxalic acid)，羧酸(carboxylic acids)以及無機酸(mineral acid)；且所使用的濃度不限，較佳的濃度是低于1M；最佳為0.01至0.5M；同時，本發明方法中使用的穩定核酸試劑于水溶液中的酸堿值不限制，較佳為pH7以下，最佳為pH5以下。
適用于本發明的含核酸生物檢體可為不含細胞的檢體、血漿、體液如全血、血清、細胞、白血球細胞、血液黃層、痰液、尿液、精液、糞便、樣本抹片、抽吸物、或任何一種組織樣本，如部分組織或器官的活檢組織、或食物樣本中所含的游離態或結合態的核酸或含核酸的細胞，如單細胞或多細胞有機物(如昆蟲等)、或是植物或植物的一部分組織、細菌、病毒、酵母菌與其它種類真菌，或真核細胞，原核細胞等等。
本發明中提到的「核酸」，所代表的意義為廣義的核酸，包括了各種長度或構型的核糖核酸(ribonucleic acids，RNA)、脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acids，DNA)，如雙股，單股，環狀，直鏈狀，支鏈狀，或是結合上述型態的任何一種可能的次單元，如寡核酸單體，質體，病毒或細菌的DNA或RNA，來自動物、植物或其它真核細胞的基因體或非基因體的DNA或RNA，修飾前后的mRNA、tRNA、異核RNA(heterogeneousnuclear RNA，hnRNA)、rRNA、cDNA或任何一種常見的核酸；較佳的是，本發明方法中適用的核酸為DNA或RNA。


圖1為本發明實施例1-3的RNA電泳圖。
圖2為本發明較佳實施例5-6的RNA電泳圖。
圖3為本發明較佳實施例7-9的不同保存時間所萃取出的RNA其中基因表現量變化結果。
具體實施例方式
本發明實施例是以RNA萃取的量與濃度，來比較經過數天以三種不同方式保存的全血中RNA質量差異。
實施例1首先全血的收集是利用10ml的Vacutainer血液收集管(EDTA K3，Becton Dickinson)收集后，直接冰存于4℃0-4天。經過不同時間的保存后，接著進行RNA的萃取。
依照使用者手冊，于500μl全血中加入1ml的紅血球溶解液(RocheDiagnostics GmbH)，以純化出白血球細胞；接著再將白血球細胞以150μl的RLT液(QIAGEN GmbH)進行溶解；接著加入90μl的乙醇，再將處理后反應液加到含有硅質過濾膜的離心管(QIAGEN GmbH)內，進行離心；接著以350μl的RW1液(QIAGEN GmbH)沖洗硅質過濾膜，再利用不含RNA分解酶的DNA分解套組(RNase-free DNase Set，QIAGEN GmbH)去掉DNA分子；再以350μl的RW1液(QIAGEN GmbH)沖洗硅質過濾膜一次，500μl的RPE液(QIAGEN GmbH)沖洗2次，最后以2次40μl的去離子水將硅質過濾膜上的RNA沖提出來。
實施例2本實施例中全血的收集與RNA萃取，是利用PAXgene Blood RNAValidation Kit(QIAGEN GmbH)進行，血液收集后，直接冰存于4℃，0-4天。經過不同時間的保存后，接著進行RNA的萃取，所有血液收集與RNA萃取步驟均依照使用者手冊進行。
實施例3于本實施例中，在欲進行萃取RNA的血液中，加入N-甲基十二烷胺(N-methyldodecylamine)一起進行保存，以穩定全血中RNA的活性。首先取333μl的新鮮血液，加入1ml含有3％(w/v)N-甲基十二烷胺、5％(v/v)TritonX-100以及100mM酒石酸(tartaric acid)的溶液，再將混合液直接冰存于4℃0-4天。經過不同時間的保存后，接著進行RNA的萃取。
由于RNA會與N-甲基十二烷胺形成一絡合物，因此可由5000xg離心10分鐘的方式將RNA沉淀下來，接著以50μl的去離子水將沉淀物回溶；加入100μl的RLT液(QIAGEN GmbH)與10μl的K蛋白酶(Proteinase K，QIAGENGmbH)，置于55℃中10分鐘；接著于反應液中加入200μl的1，3-溴氯丙烷(1-bromo-3-chloropropane)，并以劇烈震蕩方式使藥劑與反應液充分混合，再以10000xg離心5分鐘；接著將離心后上清液移至另一新的1.5ml離心管中，加入90μl的乙醇，再將處理后反應液加到含有硅質過濾膜的離心管內，進行離心；接著以350μl的RW1液(QIAGEN GmbH)沖洗硅質過濾膜，再利用不含RNA分解酶的DNA分解套組(RNase-free DNase Set，QIAGENGmbH)去掉DNA分子；再以350μl的RW1液(QIAGEN GmbH)沖洗硅質過濾膜一次，500μl的RPE液(QIAGEN GmbH)沖洗2次，最后以2次40μl的去離子水將硅質過濾膜上的RNA沖提出來。
實施例4于本實施例中，在欲進行萃取RNA的血液中，加入十二烷胺(dodecylamine)一起進行保存，以穩定全血中RNA的活性。首先取1ml的新鮮血液，加入3ml含有0.3％(w/v)十二烷胺、1％(v/v)Triton X-100以及250mM酒石酸的溶液，以NaOH調整至pH 3，再將混合液直接冰存于4℃0-2天。經過不同時間的保存后，接著進行RNA的萃取。
將形成一絡合物的RNA以及十二烷胺一起藉由離心方式進行沉淀，接著以150μl的去離子水將沉淀物回溶；加入300μl的RLT液(QIAGEN GmbH)與30μl的K蛋白酶(Proteinase K，QIAGEN GmbH)，置于55℃中10分鐘；接著于反應液中加入200μl的1，3-溴氯丙烷(1-bromo-3-chloropropane)，并以劇烈震蕩方式使藥劑與反應液充分混合，再以10000xg離心5分鐘；接著將離心后上清液移至另一新的1.5ml離心管中，加入270μl的乙醇，接下來的RNA萃取方式請參考實施例3。
實施例5于本實施例中，在欲進行萃取RNA的血液中，加入N，N-二甲基十二烷胺(N，N-dimethyldodecylamine)一起進行保存，以穩定全血中RNA的活性。首先取333μl的新鮮血液，加入1ml含有5％(w/v)N，N-二甲基十二烷胺、2％(v/v)Triton X-100以及140mM酒石酸的溶液，再將混合液直接冰存于-20℃中0-14天。經過不同時間的保存后，接著參考實施例3進行RNA的萃取。
實施例6于本實施例中，在欲進行萃取RNA的血液中，加入氧化氮N，N-二甲基十二烷胺(N，N-dimethyldodecylamine N oxide)一起進行保存，以穩定全血中RNA的活性。首先取333μl的新鮮血液，加入1ml含有3％(w/v)氧化氮N，N-二甲基十二烷胺、1％(v/v)Triton X-100以及125mM酒石酸的溶液，再將混合液直接冰存于-20℃0-14天。經過不同時間的保存后，接著依實施例3所述步驟進行RNA的萃取。
實施例7利用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)分析依照實施例1-3所萃取出RNA中28S/18S rRNA的比值，進行比較。依照本領域具通常知識者可認同的標準，當28S/18S rRNA的比值高于1.5，表示RNA分子尚未被降解；而當比值在2附近，則表示所萃取出的RNA分子質量良好；此外，利用分光光度計測定RNA的OD260/OD280的比值，質量好的RNA樣品260/280比值應介于1.9～2.1。利用上述分析方法，分別將不同保存時間萃取后的RNA質量結果整理如下表1。
表1、不同實施方式萃取得的RNA質量比較

由表1結果可看出本發明穩定RNA的試劑(實施例3)，不僅可萃取出比其它2種常用方法更高量的RNA，每1ml血液可收集到7.20±0.48μg；且代表RNA質量的OD 260/280比值1.98±0.14也接近高標準的2；此外，28S/18SrRNA比值也是三種實施方法中最接近2的標準。
同時，請參考圖1，是實施例1-3的電泳結果圖，其中(a)為實施例1方法萃取出的RNA，(b)為實施例2，(c)為實施例3；而電泳圖上方的0-4數字代表保存天數；于電泳結果圖中，每一行的第一條條帶代表為28S rRNA，第二條條帶代表為18S rRNA；由結果圖可以清楚看到，由本發明最佳實施例的方法所萃取出的RNA(實施例3所述)，可以得到質與量均佳的RNA。且一直到保存第4天的結果，仍與新鮮取得血液(保存0天)的萃取結果相近。
圖2為實施例4-6的RNA電泳圖，其中圖2(a)為實施例4保存0-2天的結果，圖2(b)為實施例5保存0-14天的結果，圖2(c)為實施例6保存0-14天的結果；而利用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)分析的結果則整理于表2；觀察圖2與表2所呈現的結果，可發現在全血保存到第14天，所萃取出的RNA質量仍然在可接受的范圍內。
表2、不同實施方式萃取得的RNA質量比較


實施例7操作過程同實施例1，但血液的保存為在4℃冰藏0-2天。
實施例8操作過程同實施例2，但血液的保存為在4℃冰藏0-2天。
實施例9于本實施例中，在欲進行萃取RNA的血液中，加入N，N-二甲基十二烷胺(N，N-dimethyldodecylamine)一起進行保存，以穩定全血中RNA的活性。首先取1ml的新鮮血液，加入3ml含有5％(w/v)氧化氮N，N-二甲基十二烷胺以及225mM酒石酸的溶液(以NaOH調整pH值到3.0)，再將混合液直接冰存于4℃0-2天。經過不同時間的保存后，接著依實施例4所述步驟進行RNA的萃取。
實施例10將實施例7-9所萃取出的RNA以SuperScript II RNase H-ReverseTranscriptase(Invitrogen)進行單股eDNA合成，所有合成步驟均依照使用者手冊進行。完成的單股eDNA接續以TaqMan Universal PCR master mix(Applied Biosystems)以及Assays-on-Demand Gene Expression Produts(Applied Biosystems)在ABI Prism 7000Sequence Detection System基因定量儀(Applied Biosystems)進行實時基因表現量定量(real-time PCR)測定。利用上述分析方法，分別測量不同保存時間萃取后RNA中的ADORA2A、CREB5、NFKB1以及IFNGR1等四種基因變化結果，如圖3所示。
圖3中相對表現量(Relative expression fold)的意義為將在4℃保存24hr與48hr后的基因表現量，與保存0hr的表現量相比較，數值等于1時表示基因表現量與0hr的一樣；圖3中，A1-A4為依照實施例7步驟進行后所得的結果，其中A1為ADORA2A基因、A2為CREB5基因、A3為IFNGR1基因以及A4為NFKB1基因；B1-B4為實施例8的結果，B1為ADORA2A基因、B2為CREB5基因、B3為IFNGR1基因以及B4為NFKB1基因；C為實施例9的結果，C1為ADORA2A基因、C2為CREB5基因、C3為IFNGR1基因以及C4為NFKB1基因；由圖3可知在三種保存方式當中，以實施例9的保存試劑所測得的基因表現量數值較接近1，且所測試四種基因的變化程度最小，因此保存效果最好。
由本發明較佳實施例的說明，可達到本發明欲穩定生物檢體中核酸的目的，且經由實施例結果可知，利用本發明試劑與方法來保存生物檢體，其保存時間可大幅拉長達2周，在臨床使用上非常具有實用價值，且易于操作，更容易與自動化儀器搭配以達成自動化操作的目的，增進核酸分子檢測的技術發展與應用推廣。
上述實施例僅為了方便說明而舉例而已，本發明所主張的權利范圍自應以申請專利范圍所述為準，而非僅限于上述實施例。
權利要求
1.一種穩定或保存生物檢體中核酸的方法，將該生物檢體與一含有胺類界面活性劑的試劑進行接觸，使該生物檢體中核酸與該胺類界面活性劑形成一絡合物，其中該胺類界面活性劑具備如式(I)的通式R1R2R3N(O)x， 式(I)；其中，R1與R2分別為氫，含1-6個碳的烷基，含6-12個碳的芳香烴基或是含6-12個碳的烴基芳香烴基；R3為含1-20個碳的烷基、含6-26個碳的芳香烴基或是含6-26個碳的烴基芳香烴基；且x為0或1。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中該x為1，R1與R2分別為含1-6個碳的烷基，且R3為含1-20個碳的烷基。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中該x為0。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中該胺類界面活性劑選自由下列物質所組成的群組十二烷胺，N-甲基十二烷胺，N，N-二甲基十二烷胺，氧化氮N，N-二甲基十二烷胺以及4-十四烷胺。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中該試劑中所含的該胺類界面活性劑為0.001％至20％的濃度百分比。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中該試劑中還包括至少一種非離子界面活性劑、至少一種酸性鹽類或上述的混合物。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中該非離子界面活性劑為聚氧化乙烯類界面活性劑。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中該非離子界面活性劑為0.01％至20％的濃度百分比。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中該非離子界面活性劑為Tween 20或Triton X-100。
10.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中該酸性鹽類選自由下列物質所組成的群組順丁烯二酸，酒石酸，檸檬酸，草酸，羧酸以及無機酸。
11.如權利要求6所述的方法，其特征在于，其中該酸性鹽類濃度范圍為0.01M至1M。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中該試劑為一液態水溶液。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，其中該液態水溶液的pH值為7以下。
14.如權利要求12所述的方法，其特征在于，其中該液態水溶液的pH值為5以下。
15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中該試劑為一固態基質。
16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中該生物檢體選自由下列物質所組成的群組全血液，血漿，血清，尿液，組織與細胞。
17.一種穩定或保存生物檢體中核酸的試劑，包括一具備如式(I)的胺類界面活性劑，R1R2R3N(O)x，式(I)；其中，R1與R2分別為氫，含1-6個碳的烷基，含6-12個碳的芳香烴基或是含6-12個碳的烴基芳香烴基；R3為含1-20個碳的烷基、含6-26個碳的芳香烴基或是含6-26個碳的烴基芳香烴基；且x為0或1。
18.如權利要求17所述的試劑，其特征在于，其中該x為1，R1與R2分別為含1-6個碳的烷基，且R3為含1-20個碳的烷基。
19.如權利要求17所述的試劑，其特征在于，其中該x為0。
20.如權利要求17所述的試劑，其特征在于，其中該胺類界面活性劑選自由下列物質所組成的群組十二烷胺，N-甲基十二烷胺，N，N-二甲基十二烷胺，氧化氮N，N-二甲基十二烷胺以及4-十四烷胺。
21.如權利要求17所述的試劑，其特征在于，其中該胺類界面活性劑為0.001％至20％的濃度百分比。
22.如權利要求17所述的試劑，其特征在于，其中還包括至少一種非離子界面活性劑、至少一種酸性鹽類或上述的混合物。
23.如權利要求22所述的試劑，其特征在于，其中該非離子界面活性劑為聚氧化乙烯類界面活性劑。
24.如權利要求22所述的試劑，其特征在于，其中該非離子界面活性劑為0.01％至20％的濃度百分比。
25.如權利要求22所述的試劑，其特征在于，其中該非離子界面活性劑為Tween 20或Triton X-100。
26.如權利要求22所述的試劑，其特征在于，其中該酸性鹽類濃度范圍為0.01M至1M。
27.如權利要求22所述的試劑，其特征在于，其中該酸性鹽類選自由下列物質所組成的群組順丁烯二酸，酒石酸，檸檬酸，草酸，羧酸以及無機酸。
28.如權利要求17所述的試劑，其特征在于，其中該試劑為一液態水溶液。
29.如權利要求27所述的試劑，其特征在于，其中該試劑的pH值為7以下。
30.如權利要求27所述的試劑，其特征在于，其中該試劑的pH值為5以下。
全文摘要
本發明是有關于一種穩定或保存生物檢體中核酸方法，將生物檢體與一含有胺類界面活性劑的試劑進行接觸，使生物檢體中RNA與胺類界面活性劑形成一絡合物，其中胺類界面活性劑具備如式(I)的通式R
文檔編號C12Q1/68GK1796399SQ200410104900
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月27日 優先權日2004年12月27日
發明者黃棟梁, 林上琪 申請人:財團法人工業技術研究院