專利名稱：新的人磷脂翻轉酶、其編碼序列及制法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域。具體地本發明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。本發明的多肽被推斷鑒定為一種新的人磷脂翻轉酶。
細胞質膜上的磷脂的分布通常是不對稱的，磷脂酰膽堿和神經鞘磷脂一般分布在雙層膜的外側，而氨基磷脂、磷脂酰絲氨酸和磷脂酸乙氨醇局限于細胞質一側(Schrait A.J.et al Biochim.Biophys.Acta 1071313-329，1991)。磷脂分子在質膜中一般很少發生翻轉運動(flip-flop)，但細胞活化、細胞損傷、細胞凋亡等生理活動導致的細胞內Ca2+水平上升可以引發質膜中磷脂分子的雙向移動(WilliamsonP.et al Biochemistry 316355-6360，1992)。磷脂分子在膜兩側的翻轉運動能促進凝血系統、補體系統中關鍵酶的聚集和活化，并加速損傷細胞和凋亡細胞的清除(Bevers E.M.et al Blood Rev.5146-154，1991)。
磷脂翻轉酶(phospholipid scramblase，簡稱為“PLS”)是近年來新發現的能介導Ca2+依賴型磷脂分子翻轉運動的一個蛋白質。1996年，Basse等人從人的紅細胞中分離得到了一個約37KD的膜整合蛋白，該蛋白具有介導人工脂質體磷脂分子翻轉的功能(Basse F.et al J.Biol.Chem.271(29)17205-17210，1996)；1997年，該實驗室Zhou等人克隆了該蛋白的cDNA序列(Zhou Q.et al J.Biol.Chem.272(29)18240-18244，1997)；1998年，Zhou等人又克隆了該蛋白在小鼠中的同源物的cDNA序列(Zhou Q.et al Biochemistry 372356-2360，1998)。
然而，在本申請之前沒有公開過本發明所涉及的新的人磷脂翻轉酶或其序列。
本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼一個新的磷脂翻轉酶，本發明新的人磷脂翻轉酶被命名為人PLS2。
本發明的另一個目的是提供一種新的人磷脂翻轉酶蛋白，該酶被命名為人PLS2。
本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的新的人磷脂翻轉酶的方法。
本發明還涉及這種人磷脂翻轉酶核酸序列和多肽的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人PLS2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸118-849位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸118-849位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸118-849位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的人PLS2蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種產生具有人PLS2蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人PLS2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人PLS2蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸118-849位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人PLS2蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人PLS2蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人PLS2蛋白活性的多肽。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為892個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于118-849位核苷酸。
在本發明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語“人PLS2蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人PLS2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中118-849位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框118-849位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中118-849位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸118-849位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸118-849位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人PLS2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，“基本純的”蛋白質或多肽是指其至少占樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語“人PLS2蛋白多肽”指具有人PLS2蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術語還包括具有與人磷脂翻轉酶PLS2相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人PLS2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人PLS2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人PLS2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人PLS2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還提供了人PLS2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人PLS2多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。
發明還提供人PLS2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人PLS2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，“人PLS2保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1
本發明還包括人PLS2多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內人PLS2的表達。
本發明還包括一種可用作探針或引物的核苷酸分子，該分子通常具有人PLS2核苷酸序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人PLS2的核酸分子。
本發明還包括檢測人PLS2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于人PLS2多肽的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般， “可操作地連于” 意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對人PLS2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人PLS2基因產物或片段。較佳地，指那些能與人PLS2基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制人PLS2蛋白的分子，也包括那些并不影響人PLS2蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人PLS2基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人PLS2基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人PLS2或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷人PLS2功能的抗體以及不影響人PLS2功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人PLS2基因產物的片段或功能區，通過免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人PLS2基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的人PLS2核苷酸序列全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的SEQ ID NO.3序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。當然，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發明的一個實施方案中，本發明的多核苷酸全長為892個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于118-849位核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的，以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物A15′-TACAGTCCACAGCAACCCAGTAC-3′和反向引物B15′-AGTGCTGACTGTAAGCCCAATCC-3′進行PCR，獲得892bp的目的片段。測序后得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
根據同源比較的結果，本發明的核苷酸序列及其編碼的蛋白質序列與不同來源的磷脂翻轉酶顯示了顯著的同源性，因此，這表明它是磷脂翻轉酶的一個新的同系物，并且具有磷脂翻轉酶蛋白的一些重要功能。
細胞質膜上的磷脂分子是不對稱分布的(Schrait A.J.et al Biochim.Biophys.Acta 1071313-329，1991)。細胞內Ca2+水平上升可導致磷脂分子在脂雙層細胞膜上的快速、雙向翻轉(Williamson P.et al Biochemistry 316355-6360，1992)。磷脂翻轉酶是在各種細胞的細胞膜上廣泛表達，能介導Ca2+依賴型的磷脂分子在細胞膜上雙向移動的蛋白分子(Basse F.et al J.Biol.Chem.271(29)17205-17210，1996)。磷脂翻轉酶介導的磷脂分子在細胞膜脂雙層分子的再分布，對血管止血機制及細胞清除機制有重要作用(Zhou Q.et al J.Biol.Chem.272(29)18240-18244，1997)。磷脂翻轉酶的表達水平通常和磷脂酰絲氨酸響應Ca2+水平上升，翻轉至細胞膜外側的程度相對應(Zhou J.et al J.Biol.Chem.273(12)6603-6606，1998)。人和小鼠的同源物比較顯示在該蛋白的胞質部分含有一個保守的、與已知EF手性結構序列很相似的Ca2+結合域(Zhou Q.et al Biochemistry372356-2360，1998)，該結構和Ca2+調節該酶的活性相關(Zhou J.et alBiochemistry 376361-6366，1998)。Scott綜合癥(Scott Syndrome)和磷脂翻轉酶的功能喪失有關(Zhou Q.et alJ.Biol.Chem.272(29)18240-18244，1997)。與磷脂翻轉酶序列有極好吻合的人的白血病生成相關基因MmTRA1b可能和白血病生成及單核細胞性白血病細胞的分化有關(Kasukabe T.et al Biochem Biophys.Res.Commun.249(2)449-455，1998)。
在附圖中，

圖1為本發明的人PLS2與小鼠磷脂翻轉酶(MPLS)的核酸序列的同源比較圖。其中，相同的核苷酸用“｜”標出。
圖2為本發明的人PLS2與小鼠磷脂翻轉酶(MPLS)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“|”標出，相似的氨基酸用“·”標出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
圖3為本發明的人PLS2與人磷脂翻轉酶(HPLS)的核酸序列的同源比較圖。其中，相同的核苷酸用“｜”標出。
圖4為本發明的人PLS2與人磷脂翻轉酶(HPLS)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“｜”標出，相似的氨基酸用“·”標出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
圖5為本發明的人PLS2與人的白血病生成相關基因MmTRA1b的氨基酸序列的同源比較圖。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，比如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人PLS2的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-TACAGTCCACAGCAACCCAGTAC-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B15′-AGTGCTGACTGTAAGCCCAATCC-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片段約為900bp的目的片段。
2.PCR產物的測序將如上獲得的PCR擴增產物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共892bp，詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于118-849位核苷酸。
根據得到的全長cDNA序列推導出人PLS2的氨基酸序列，共243個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.4。
實施例2同源比較和功能研究用本發明的人PLS2的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數據庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數據庫中，用BLAST軟件進行核酸和蛋白同源檢索，結果發現與磷脂翻轉酶顯示了較高的同源性。用PCGENE軟件分析，它與小鼠的磷脂翻轉酶(MPLS)(gi|2935162|gb|AF015790|AF015790)在核酸水平上有70.3％的同一性(圖1)，在蛋白水平上有48.6％的同一性并另有13.6％的氨基酸相似(圖2)；又如，它與人的磷脂翻轉酶(HPLS)(gi|2282600|gb|AF008445|AF008445)在核酸水平上有70.3％的同一性(圖3)，在蛋白水平上有48.6％的同一性并另有13.6％的氨基酸相似(圖4)。這表明，本發明的新蛋白是磷脂翻轉酶家族的一員，并且可以用磷脂翻轉酶的功能來推測人PLS2的功能。
研究表明，細胞質膜上的磷脂分子是不對稱分布的(Schrait A.J.et al Biochim.Biophys.Acta 1071313-329，1991)。在靜止細胞中，磷脂分子自發地在細胞膜雙層之間的翻轉速率是很慢的，而由細胞活化、細胞損傷、細胞凋亡等引發的細胞內Ca2+水平上升可導致磷脂分子在脂雙層細胞膜上的快速、雙向翻轉，使得原來在細胞質側的磷脂酰絲氨酸位于外側，而外側的磷酸酰乙氨醇變位至細胞質側(Williamson P.et al Biochemistry 316355-6360，1992)。磷脂翻轉酶是在各種細胞的細胞膜上廣泛表達的蛋白分子，它能介導Ca2+依賴型的磷脂分子在細胞膜上雙向移動(Basse F.et al J.Biol.Chem.271(29)17205-17210，1996)。
研究表明，磷脂翻轉酶是一個富含脯氨酸類型II的細胞膜蛋白(本發明的蛋白含15個脯氨酸，占蛋白分子全長的6％以上)，并在靠近C端處有一個穿膜區(Zhou Q.et al J.Biol.Chem.272(29)18240-18244，1997)，本發明對應序列為SEQ ID NO.4中第204位至第224位氨基酸，即LDVKMKAMIFGACFLIDFMYF。這更證實了本發明的新蛋白是新的磷脂翻轉酶。
實驗表明，氨基磷酯脂暴露于外側可促進凝血系統、補體系統中關鍵酶的聚集和活化，并加速網狀內皮系統對損傷細胞、凋亡細胞的清除(Bevers E.M.et alBlood Rev.5146-154，1991)。磷脂翻轉酶介導的Ca2+依賴型磷脂分子在細胞膜脂雙層分子的再分布，對血管止血機制及細胞清除機制有重要作用(Zhou Q.et al J.Biol.Chem.272(29)18240-18244，1997)。定量免疫雜交實驗顯示血小板中磷脂翻轉酶的分子數比血紅細胞高約10倍，和血小板細胞膜中顯著上升的磷脂翻轉酶活力相一致(Zhou Q.et al J.Biol.Chem.272(29)18240-18244，1997)。磷脂翻轉酶的表達水平通常與磷脂酰絲氨酸隨Ca2+水平上升而翻轉至細胞膜外側的程度相對應(Zhou J.et al J.Biol.Chem.273(12)6603-6606，1998)。人和小鼠以及人的同源物比較顯示在該蛋白的胞質部分含有一個保守的和已知EF手性結構序列很相似的Ca2+結合域D(A/S)DNFGIQFPL D[注該序列中“(A/S)”表示從這2個氨基酸中任選一個氨基酸](Zhou Q.et alBiochemistry 372356-2360，1998)，本發明對應序列為SEQ ID NO.4中第192位至第203位氨基酸，即DADHFDIHFPLD(其中第197位與第199位氨基酸與已報道的磷脂翻轉酶對應氨基酸有所不同，第195位氨基酸與已報道的磷脂翻轉酶對應氨基酸相似)，該結構和Ca2+調節該酶的活性相關。實驗證明，磷脂翻轉酶在遠離Ca2+結合位點的N端的半胱氨酸殘基上可以被棕櫚酰化。這種翻譯后修飾可能和該酶的依賴Ca2+的活力相關(Zhou J.et al Biochemistry 376361-6366，1998)。大腸桿菌中表達的重組蛋白顯示酶活力和Ca2+結合力都顯著下降。硫醚鍵水解后，該酶的功能喪失約80％(Zhou J.et al Biochemistry 376361-6366，1998)。
一種遺傳缺陷出血病——Scott綜合癥(Scott Syndrome)就和磷脂翻轉酶的功能喪失有關(Zhou Q.et al J.Biol.Chem.272(29)18240-18244，1997)。由Kasukabe等人新克隆的人的白血病生成相關基因MmTRA1b，和磷脂翻轉酶在氨基酸序列上有極好的吻合，因此這些蛋白可能和白血病生成及單核細胞性白血病細胞的分化有關(Kasukabe T.et al Biochem Biophys.Res.Commun.249(2)449-455，1998)。本發明的新的磷脂翻轉酶與MmTRA1b也有很高的同源性(圖5)。這暗示，本發明的新蛋白與白血病可能也有一定聯系。
本發明的人PLS2除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明人PLS2還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明人PLS2的N端與小鼠PLS或人PLS的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發明人PLS2的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員，比如小鼠PLS)。
例如，本發明人PLS2核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人PLS2的表達水平或者抑制人PLS2的過度表達。本發明的人PLS2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人PLS2缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
實施例3人PLS2在大腸桿菌中的表達編碼人PLS2的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用實施例1中得到的片段為模板進行擴增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列為5′-TTGCGGATCCATGCCAGGGCCAACTCCTAT-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的人PLS2編碼序列的20個核苷酸；3’寡核苷酸引物序列為5’-GTTCGTCGACTTAACCATAGGTGATGGCT-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有SalI限制性內切酶的酶切位點，一個翻譯終止子和人PLS2的編碼的部分序列。
限制性內切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用BamHI和SalI消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。抽提質粒，測序驗證結果表明人PLS2的cDNA插入片段已正確裝入載體。
過夜(O/N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人PLS2。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人PLS2。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。首先，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白可以結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然后將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為28KDa。
此外，用常規方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例4人PLS2在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼人PLS2的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用實施例1中得到的片段為模板進行擴增，以合成插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TTGCAAGCTTATGCCAGGGCCAACTCCTAT-3′(SEQ ID NO.7)，該引物含有HindIII限制性內切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的人PLS2編碼序列的20個核苷酸；3′端引物序列為5’-GTTCGGATCCTTAACCATAGGTGATGGCT-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人PLS2的編碼的部分序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應于CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復制起點(f1 ori)、一個病毒復制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用HindIII、BamHI消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，測序驗證結果表明人PLS2的cDNA插入片段已正確裝入載體。
質粒轉染是采用脂轉染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進行的。轉染48小時后，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為28KDa。
此外，用常規方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例5制備抗體將實施例3和4獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人PLS2基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白發生沉淀。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人復旦大學(ii)發明名稱新的人磷脂翻轉酶、其編碼序列及制法和用途(iii)序列數目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1TACAGTCCAC AGCAACCCAG TAC 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2AGTGCTGACT GTAAGCCCAA TCC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)長度892bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3TACAGTCCAC AGCAACCCAG TACCTTCCCT TTGTACCAGC CAGTTGGTGG TATCCATCCT 60GTCCGGTATC AGCCTGGAAA ATATCCTATG CCAAATCAGT CTGTTCCAAT AACATGGATG 120CCAGGGCCAA CTCCTATGGC AAACTGCCCT CCTGGTCTGG AATACTTAGT TCAGTTGGAC 180AACATACATG TTCTTCAGCA TTTTGAGCCT CTGGAAATGA TGACATGTTT TGAAACTAAT 240AATAGATATG ATATTAAAAA CAACTTAGAC CAGATTGGTT TTACATTTGT AACCGAAGAC 300ACAGATGACG GTTACCCGGG AGGAACTGCC TATCGGACAC TAAGGCCCTT CGGTCTCCGG 360GTCACTGATT GTATGGGCCG AGAAATCATG ACAATGCAGA GACCCTTCAG ATGCACCTGC 420TGTTGCTTCT GTTGCCCCTC TGCCAGACAA GAGCTGGAGG TGCAGTGTCC TCCTGGTGTC 480ACCATTGGCT TTGTTGCGGA ACATTGGAAC CTGTGCAGGG CGGTGTACAG CATCCAAAAT 540GAGAAGAAAG AAAATGTGAT GAGAGTTCGT GGGCCATGCT CAACCTATGG CTGTGGTTCA 600GATTCTGTTT TTGAGGTCAA ATCCCTTGAT GGCATATCCA ACATCGGCAG TATTATCCGG 660AAGTGGAATG GTTTGTTATC AGCAATGGCA GATGCTGACC ATTTTGACAT TCACTTCCCA 720CTAGACCTGG ATGTGAAGAT GAAAGCCATG ATTTTTGGAG CTTGCTTCCT CATTGACTTC 780ATGTATTTTG AAAGATCTCC ACACAACGTT CAAGATAGAG AGACACAGCA AGCCATCACC 840TATGGTTAAT TTTGAAAAAT GGAAAAGTTG GATTGGGCTT ACAGTCAGCA CT 892(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度243個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Pro Gly Pro Thr Pro Met Ala Asn Cys Pro Pro Gly Leu Glu 15Tyr Leu Val Gln Leu Asp Asn Ile His Val Leu Gln His Phe Glu 30Pro Leu Glu Met Met Thr Cys Phe Glu Thr Asn Asn Arg Tyr Asp 45Ile Lys Asn Asn Leu Asp Gln Ile Gly Phe Thr Phe Val Thr Glu 60Asp Thr Asp Asp Gly Tyr Pro Gly Gly Thr Ala Tyr Arg Thr Leu 75Arg Pro Phe Gly Leu Arg Val Thr Asp Cys Met Gly Arg Glu Ile 90Met Thr Met Gln Arg Pro Phe Arg Cys Thr Cys Cys Cys Phe Cys 105Cys Pro Ser Ala Arg Gln Glu Leu Glu Val Gln Cys Pro Pro Gly 120Val Thr Ile Gly Phe Val Ala Glu His Trp Asn Leu Cys Arg Ala 135Val Tyr Ser Ile Gln Asn Glu Lys Lys Glu Asn Val Met Arg Val 150Arg Gly Pro Cys Ser Thr Tyr Gly Cys Gly Ser Asp Ser Val Phe 165Glu Val Lys Ser Leu Asp Gly Ile Ser Asn Ile Gly Ser Ile Ile 180Arg Lys Trp Asn Gly Leu Leu Ser Ala Met Ala Asp Ala Asp His 195Phe Asp Ile His Phe Pro Leu Asp Leu Asp Val Lys Met Lys Ala 210Met Ile Phe Gly Ala Cys Phe Leu Ile Asp Phe Met Tyr Phe Glu 225Arg Ser Pro His Asn Val Gln Asp Arg Glu Thr Gln Gln Ala Ile 240Thr Tyr Gly 243(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGCGGATCC ATGCCAGGGC CAACTCCTAT 30(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性
(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6GTTCGTCGAC TTAACCATAG GTGATGGCT 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TTGCAAGCTT ATGCCAGGGC CAACTCCTAT 30(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8GTTCGGATCC TTAACCATAG GTGATGGCT 29
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人PLS2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸118-849位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸118-849位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸118-849位的核苷酸序列。
4.一種分離的人PLS2蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是真核細胞。
10.一種產生具有人PLS2蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人PLS2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人PLS2蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸118-849位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人PLS2蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人PLS2蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人PLS2蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸118-849位。
12.一種能與權利要求4所述的人PLS2蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明涉及了一種新的人磷脂翻轉酶PLS2。本發明提供了該新磷脂翻轉酶的cDNA編碼序列、該序列編碼的多肽,以及利用重組技術生產所述的新的人磷脂翻轉酶的方法。本發明還提供了這種新人磷脂翻轉酶及其編碼序列的應用。
文檔編號C07H21/00GK1259574SQ9812382
公開日2000年7月12日 申請日期1998年10月29日 優先權日1998年10月29日
發明者余龍, 張宏來, 屠強, 傅強, 趙勇 申請人:復旦大學