氨基乙酰丙酸在脂肪肝治療中的應用
【專利摘要】本發明涉及代謝綜合征、特別是脂肪肝的預防、治療。特別涉及氨基乙酰丙酸(以下稱為“5-ALA”)或其衍生物、或它們的鹽作為有效成分在預防、緩解和/或治療脂肪肝中的功能和應用，及其在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝的藥物中應用。
【專利說明】
氨基乙酰丙酸在脂肪肝治療中的應用
技術領域
[0001]本發明涉及代謝綜合征、特別是脂肪肝的預防、治療。特別涉及氨基乙酰丙酸(以下稱為“5-ALA”)或其衍生物、或它們的鹽作為有效成分在預防、緩解和/或治療脂肪肝中的功能和應用，及其在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝的藥物中應用。
【背景技術】
[0002]代謝綜合征是指人體的蛋白質、脂肪、碳水化合物等物質發生代謝紊亂的病理狀態，是一組復雜的代謝紊亂癥候群，包括肥胖、高血糖、高血壓、血脂異常、高尿酸、高脂肪肝發生率和高胰島素血癥，這些代謝紊亂是心、腦血管病變以及糖尿病的病理基礎。
[0003]脂肪組織是重要的能量儲存器官，隨著過多能量的攝入，如果脂肪組織不能通過增生及分化形成新的脂肪細胞而擴大其容量，便會導致脂肪細胞肥大及過量的脂肪轉移至肝臟、骨骼肌甚至胰腺β細胞導致脂肪異位沉積；更重要的是，如果組織內線粒體功能低下，脂肪酸氧化不能代償性的增加，大量進入組織的脂肪便會堆積形成異位脂肪。
[0004]除了作為能量儲存器官，新的研究表明脂肪組織還是重要的內分泌器官，分泌大量的細胞因子參與機體的能量代謝、免疫和炎癥調控。研究發現肥胖人群病理性肥大的脂肪細胞可產生比正常脂肪細胞更多的炎癥因子并引起炎癥細胞浸潤，多表現為巨噬細胞浸潤、脂肪細胞因子如脂聯素、腫瘤壞死因子α、瘦素、巨噬細胞炎性蛋白等表達增加，眾多脂肪細胞因子廣泛參與胰島素信號通路的傳導，進一步加重了外周組織的胰島素抵抗。目前研究已經證實降低內臟脂肪含量后，脂肪組織的炎癥狀態得到明顯改善，胰島素的敏感性亦得到顯著提高。
[0005]脂肪性肝病(FLD)是指肝臟甘油三酯的儲積大于肝臟濕重的5%，或為光鏡下每單位面積肝實質細胞脂肪變大于30%。1980年，Ludwig J等人在未飲酒的人群中發現了和酒精性脂肪肝炎相同的炎癥特征，而且多伴有肥胖以及肥胖相關性疾病如2型糖尿病等，據此首次提出非酒精性脂肪肝炎的概念。
[0006]非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)近年來發病率逐年增高，是一種嚴重威脅著人類健康的常見疾病，是在患者無過量飲酒史的情況下，發生的與酒精性肝病(ALD)相似的肝臟病理學變化，其病理生理改變主要是肝細胞發生炎癥、壞死和凋亡，病程逐漸向脂肪性肝炎、肝纖維化，肝硬化發展。有一部分NAFLD患者可進一步發展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)ο
[0007]酒精性脂肪肝臨床表現與肝臟脂肪浸潤的程度成正比，在肝內過多的脂肪被移除后癥狀可消失。臨床上以肝腫大為最常見體征，其次為肝區痛及壓痛。少數病人可有輕度黃疸，實驗室檢查提示與膽道系統阻塞有關。重癥患者可以有腹水和下肢水腫，偶見脾腫大。部分患者可以伴有維生素缺乏表現，如周圍神經炎、舌炎、口角炎、皮膚瘀斑等。總之，酒精性脂肪肝缺乏特異性臨床癥狀。
[0008]脂肪性肝病的發病機制目前多傾向于二次打擊學說:第一次打擊是肥胖、胰島素抵抗等因素引起的，其中胰島素抵抗是引起脂肪肝的關鍵致病因子，胰島素抵抗導致血中游離脂肪酸水平升高，游離脂肪酸水平超過了肝臟β氧化能力及輸出能力進而加重肝臟脂質沉積，從而啟動第二次打擊。“二次打擊”的主要因子包括氧化應激、細胞因子，促炎癥因子及線粒體功能障礙等，這些因子增加了肝細胞對凋亡和壞死的易感性，引起脂肪性肝炎及肝纖維化。
[0009]5-ALA作為體內合成血紅素的前體物質，主要通過參與檸檬酸循環回路和血紅素合成代謝調控血紅蛋白和肌紅蛋白數量，參與細胞色素Ρ450合成，進而通過清除氧化活性物質延緩氧化應激水平。5-ALA具有眾多的功能，研究發現5-ALA通過原卟啉IX(PpIX)持續性剪切激活可溶性的鳥苷酸環化酶，促進PKG相關的血管舒張刺激磷蛋白(VASP)的磷酸化，進而降低肺動脈高壓。此外5-ALA作為體內合成血紅素的前體物質，通過血紅素調控細胞核受體Rev-Erb α及其輔抑制因子NCOR相互作用，介導飲食鐵對生理性糖代謝的調控。5-ALA可以作為一種免疫調控因子通過適度的氧化應激刺激T細胞，調節免疫反應。5-ALA的中間代謝產物原卟啉IX具有強光敏作用，故5-ALA通常作為一種光敏劑用于腫瘤的診斷以及皮膚病的治療。
[0010]田中徹等人(CN102164596A、CN103800310A)的研究發現5-ALA可以預防、改善例如選自代謝綜合征、糖尿病、高脂血癥、高血壓、肝功能障礙、腎衰竭、肥胖、勃起功能障礙、更年期障礙、肩酸和腰痛的成人病，但其具體的作用機理并不清楚。而5-ALA能否用于其他代謝綜合征的治療也有待證實。
[0011]本發明通過對高脂喂養的肥胖小鼠作5-ALA灌胃處理，不僅發現5-ALA處理對肥胖小鼠體重、腹腔葡萄糖耐量(IPGTT)、胰島素耐量(ITT)等有影響，還證實5-ALA可以顯著改善脂肪肝狀況。
[0012]發明概述
[0013]在一個方面中，本發明提供一種預防、緩解和/或治療脂肪肝的組合物，其含有氨基乙酰丙酸(5-ALA)或其衍生物或它們的鹽。
[0014]在另一個方面中，本發明提供氨基乙酰丙酸(5-ALA)或其衍生物或它們的鹽在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝的組合物中的應用。
[0015]在一個實施方案中，可用于本發明的5-ALA衍生物選自具有酯基或酰基的衍生物，優選甲酯基、乙酯基、丙酯基、丁酯基或戊酯基；所述鹽選自鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甲苯磺酸鹽、琥?酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或銨鹽，優選鹽酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽。
[0016]在另一個實施方案中，可用于本發明的5-ALA或其衍生物或它們的鹽的量按照5-ALA鹽酸鹽換算，成人每天2mg?800mg，優選為1mg?500mg，進一步優選為50mg?400mgo
[0017]在一個實施方案中，本發明的組合物含有金屬化合物。
[0018]在另一個實施方案中，可用于本發明的金屬化合物選自鐵化合物、鎂化合物或鋅化合物。
[0019]在進一步的實施方案中，可用于本發明的鐵化合物選自檸檬酸亞鐵、檸檬酸亞鐵鈉、檸檬酸鐵鈉、檸檬酸鐵銨、焦磷酸鐵、血紅素鐵、葡聚糖鐵、乳酸鐵、葡糖酸亞鐵、DTPA鐵、二亞乙基三胺五乙酸鐵鈉、二亞乙基三胺五乙酸鐵銨、乙二胺四乙酸鐵鈉、乙二胺五乙酸鐵銨、三亞乙基四胺鐵、二羧甲基谷氨酸鐵鈉、二羧甲基谷氨酸銨鐵銨、乳鐵蛋白鐵、轉鐵蛋白鐵、氯化鐵、三氧化二鐵、鐵葉綠素鈉、鐵蛋白鐵、富馬酸亞鐵、焦磷酸亞鐵、含糖氧化鐵、乙酸鐵、草酸鐵、琥珀酸亞鐵、琥珀酸檸檬酸鐵鈉、硫酸鐵和硫化甘氨酸鐵中的一或多種。
[0020]在進一步的實施方案中，可用于本發明的鐵化合物與5-ALA的摩爾比為0-70:1，優選 0.5-5:lo
[0021]在一個實施方案中，本發明的組合物不含有鐵化合物。
[0022]在一個實施方案中，本發明的組合物進一步含有藥學上可接受的載體。
[0023]在一個實施方案中，所述脂肪肝是非酒精性脂肪性肝。
[0024]在另一個實施方案中，所述脂肪肝是酒精性脂肪性肝。
【附圖說明】
[0025]圖1:肥胖小鼠體重及肝臟和脂肪重量的檢測。其中圖1A:小鼠攝食監控，圖1B:小鼠體重監控，圖1C:小鼠肝臟重量檢測，圖1D:小鼠脂肪重量檢測。
[0026]圖2:肥胖小鼠糖代謝水平的檢測。其中圖2Α:小鼠空腹血糖變化，圖2Β:小鼠葡萄糖耐受試驗，圖2C:胰島素耐受試驗。
[0027]圖3:小鼠脂代謝水平的檢測。其中圖3Α:對照組小鼠肝臟組織油紅O染色，圖3Β:處理組小鼠肝臟組織油紅O染色，圖3C:小鼠肝臟組織中甘油三酯含量。
[0028]圖4:小鼠肝臟脂肪酸氧化相關基因及內質網應激相關基因表達的檢測。其中圖4Α:小鼠肝臟脂肪酸氧化相關基因Aox、CPT-l α的表達變化，圖4Β:小鼠肝臟組織內質網應激相關基因CHOP、ERDJ4的表達變化，圖4C:小鼠脂肪組織內質網應激相關基因Bip、XBP-1的表達變化。
[0029]發明詳述
[0030]在本發明的一個實施方案中，提供一種預防、緩解和/或治療脂肪肝的組合物，其含有氨基乙酰丙酸(5-ALA)或其衍生物或它們的鹽。
[0031]本發明的組合物為含有由5-ALA或其衍生物或它們的鹽構成的5-ALA類。其中，5-ALA的衍生物例如5-ALA的具有酯基和酰基的衍生物，優選5-ALA的甲酯基、乙酯基、丙酯基、丁酯基或戊酯基的衍生物。
[0032]5-ALA類中，5-ALA或其衍生物的鹽例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或銨鹽，優選鹽酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽。而且，這些鹽在使用時以溶液方式使用，優選為其作用與5-ALA的情況效果相同的鹽。這些鹽類還可以形成水合物或溶劑合物，此外可以單獨使用任意一種或適當組合2種以上來使用。
[0033]在本發明的另一個實施方案中，提供氨基乙酰丙酸(5-ALA)或其衍生物或它們的鹽在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝的組合物中的應用。
[0034]本發明的組合物能以任何方便的方式(例如，腸內地或腸外地)進行給藥。給藥方法的實例包括口服或注射(例如，靜脈內、肌內、皮下、以及腹膜內的)方式給藥。本領域技術人員清楚本發明的組合物的給藥途徑可以根據實際需要進行相應調整。其他的可以接受的途徑可以包括例如皮下植入以及舌下的、局部的、直腸的、陰道的、鼻內給藥。作為經口給藥的劑型，可以是粉末、顆粒、片劑、膠囊劑、糖漿劑、懸浮液等，作為靜脈注射的劑型，可以是注射劑、點滴劑等。
[0035]如果制備了片劑形式的固體組合物，主要的活性成分可以與藥用賦形劑混合，藥用賦形劑的實例包括硅石、淀粉、乳酸、硬脂酸鎂、以及滑石。這些片劑可以用蔗糖或別的適當的物質涂布或者它們可以被處理從而具有持續的或延遲的活性并且從而連續地釋放預定量的活性成分。膠囊可以通過將活性成分與一種稀釋劑混合并且將生成的混合物結合到軟的或硬的膠囊里來獲得。糖漿可以包含活性成分連同一種增甜劑(該增甜劑通常無卡路里)、一種防腐劑(例如，對羥苯甲酸甲酯和/或對羥苯甲酸丙酯)，一種調味劑，以及一種適當的著色劑。水可分散的粉末或顆粒可以包含與分散劑或濕潤劑或與懸浮劑(例如聚乙烯吡咯酮)混合的活性成分，以及增甜劑或口味校正劑。使用栓劑可以影響直腸給藥，這些栓劑在直腸溫度處與粘合劑熔化來制備(例如，可可脂和/或聚乙二醇)。使用水性懸浮液、等滲鹽溶液、或可注射的無菌溶液可以影響腸外給藥，這些懸浮液或溶液包含藥理學兼容的分散劑和/或濕潤劑(例如，丙二醇和/或聚乙二醇)。該活性成分還可以被配制成微囊劑或微球，可任選地具有一種或多種載體或添加劑。該活性成分還能以與一種環糊精的絡合物的形式存在，例如，α -、β -、或γ -環糊精，2-羥丙基-β -環糊精，和/或甲基-β-環糊精。
[0036]在本發明進一步的實施方案中，每日給予的本發明的組合物的劑量將因人而異并且在一定程度上由正在治療的脂肪肝的嚴重性來確定。本發明的組合物的劑量還取決于所給予的組合物而變化。本發明的組合物的劑量的實例包括從大約0.01mg/kg、0.02mg/kg、
0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.lmg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、
1.0mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、76mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、至 lOOmg/kg 哺乳動物體重。這些組合物中含有的5-ALA類的量按照5-ALA鹽酸鹽換算，成人每天2mg?800mg，優選為1mg?500mg，進一步優選為50mg?400mg。
[0037]本發明的組合物能以單次劑量或一段時間內的許多較小的劑量來給予。給予該組合物的時長因人而異，并且可以持續直到達到所希望的結果(即脂肪肝癥狀的減輕，或預防脂肪肝癥狀的發展)。因此，治療可以從I天持續到數周、數月、或者甚至數年，這取決于正在接受治療的受試者、所希望的結果、以及該患者對根據本發明的治療的響應速度。
[0038]在本發明進一步的實施方案中，本發明的組合物含有金屬化合物，其選自鐵化合物、鎂化合物或鋅化合物，優選鐵化合物作為有效成分。作為本發明中的鐵化合物，若為在分子內具有鐵的化合物則不特別限定，可以舉出例如朽1檬酸亞鐵、朽1檬酸亞鐵鈉、朽1檬酸鐵鈉、檸檬酸鐵銨、焦磷酸鐵、血紅素鐵、葡聚糖鐵、乳酸鐵、葡糖酸亞鐵、DTPA鐵、二亞乙基三胺五乙酸鐵鈉、二亞乙基三胺五乙酸鐵銨、乙二胺四乙酸鐵鈉、乙二胺五乙酸鐵銨、三亞乙基四胺鐵、二羧甲基谷氨酸鐵鈉、二羧甲基谷氨酸銨鐵銨、乳鐵蛋白鐵、轉鐵蛋白鐵、氯化鐵、三氧化二鐵、鐵葉綠素鈉、鐵蛋白鐵、富馬酸亞鐵、焦磷酸亞鐵、含糖氧化鐵、乙酸鐵、草酸鐵、琥珀酸亞鐵、琥珀酸檸檬酸鐵鈉、硫酸鐵和硫化甘氨酸鐵，其中優選為檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵鈉。這些鐵化合物可以分別單獨使用或混合2種以上來使用。本發明的組合物中含有的鐵化合物通常相對于5-ALA的給藥量，以摩爾比計為0-70:1即可，優選0.5-5:1。
[0039]在本發明的另一個實施方案中，本發明的組合物不含有金屬化合物。
[0040]本發明證實，無需與金屬化合物例如鐵化合物聯用的5-ALA同樣能夠實現預防、緩解和/或治療脂肪肝的效果，由此可以減少或避免因長期、大量服用引起的例如體內鐵負荷增加對肝臟、心臟、內分泌腺等造成的損害。
[0041]在本發明進一步的實施方案中，本發明的組合物還可以與其它預防、緩解和/或治療脂肪肝的預防劑或改善劑或治療劑組合使用。
[0042]在本發明的另一個實施方案中，本發明的組合物進一步含有藥學上可接受的載體。
[0043]在本發明的另一個實施方案中，本發明的脂肪肝是非酒精性脂肪性肝。
[0044]在本發明的另一個實施方案中，本發明的脂肪肝是酒精性脂肪性肝。
[0045]5-ALA通常作為一個潛在的調控代謝、抗衰老的藥物。本發明發現，5-ALA處理約9周后，處理組肥胖小鼠體重、肝臟和脂肪重量、葡萄糖耐量(IPGTT)、胰島素耐量(ITT)等糖代謝指標有一定程度的改善。而尤其令人驚訝的是，5-ALA可以顯著降低肥胖小鼠肝臟內的脂肪堆積，改善脂肪肝狀況，而且針對脂肪肝的改善效果比對糖代謝的改善效果更為明顯，這說明5-ALA對脂肪肝的改善可能存在直接的作用，而并非因對糖代謝改善所引起的伴隨現象。這種較強的特異性作用提示脂肪肝可以作為5-ALA治療的獨立適應癥。另外，5-ALA單獨處理即可有效改善脂肪肝，由此可以減少或避免因長期、大量服用引起的例如體內鐵負荷增加對肝臟、心臟、內分泌腺等造成的損害。
[0046]因此，本研究首次發現5-ALA能夠顯著改善脂肪肝，對今后的脂肪肝預防、緩解和/或治療具有重要意義，但相關分子機制仍有待進一步的研究，以期尋找5-ALA的作用靶位點，為脂肪肝的臨床治療提供藥理支持。
實施例
[0047]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但下述實施例僅為本發明較佳的實施方式，本發明的實施方式并不受下述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
[0048]實施例1、肥胖小鼠模型建立
[0049]1.實驗動物:
[0050]10只8周齡健康C57BL/6J品系雄性小鼠，購自中科院上海實驗動物中心，所有小鼠飼養于上海交通大學附屬第六人民醫院SPF級動物房中，動物實驗許可證號:SYXK(滬)2007-00050 SPF清潔級飼養，室溫(20±2°C )，相對濕度40%-70%，每日12h光照，晝夜循環，自由進水進食。
[0051]2.肥胖小鼠模型的建立:
[0052]8周齡小鼠以高脂飼料(45%高脂飼料，美國Research Diet公司，貨號D12451)喂養3個月后，建立高脂誘導的肥胖小鼠模型。
[0053]實施例2、5_ALA處理的肥胖小鼠體重及肝臟和脂肪重量的檢測
[0054]將成功造模的肥胖小鼠模型分為兩組，一組(處理組)以約200ul 5-ALA (5mg/kg/天，蘇州益安生物科技有限公司商業化產品)灌胃(Π = 5)，另一組(對照組)以約200ulPBS 灌胃(η = 5) ο
[0055]1.小鼠體重、攝食監控
[0056]在小鼠生長的過程中，監控小鼠的體重以及小鼠的攝食。結果顯示，與對照組相比，5-ALA在對小鼠攝食量沒有顯著影響的情況下(見圖1Α)，可以在一定程度上減輕小鼠的體重(見圖1Β)。
[0057]2.小鼠肝臟、脂肪重量檢測
[0058]肥胖小鼠分別以5-ALA和PBS灌胃9周后，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，完整分離小鼠的肝臟和脂肪并稱重。結果顯示，與對照組相比，5-ALA可以在一定程度上降低小鼠的肝臟、脂肪重量(見圖1C，1D)。
[0059]實施例3、5_ALA處理的肥胖小鼠糖代謝水平的檢測
[0060]1.小鼠空腹血糖變化
[0061]在小鼠生長的過程中，每周于空腹12小時后檢測兩組小鼠的空腹血糖，以監控其空腹血糖變化。結果顯示，與對照組相比，5-ALA的長時間處理能夠在一定程度上降低肥胖小鼠的空腹血糖水平(見圖2A)。
[0062]2.葡萄糖耐受試驗(GTT)
[0063]肥胖小鼠分別以5-ALA和PBS灌胃9周后，進行葡萄糖耐受試驗。小鼠饑餓16小時后，腹腔注射葡萄糖(0.lg/kg體重)，用血糖試紙檢測注射葡萄糖前和注射葡萄糖后15、30、60及90分鐘的血糖值，觀察小鼠葡萄糖的耐受能力是否有影響。結果顯示，與對照組相比，5-ALA在一定程度上改善肥胖小鼠的葡萄糖耐量(見圖2B)。
[0064]3.胰島素耐受試驗(ITT)
[0065]肥胖小鼠分別以5-ALA和PBS灌胃9周后，進行胰島素耐受試驗。小鼠饑餓6小時后，腹腔注射胰島素(0.75U/kg體重)，用血糖試紙來檢測注射胰島素前和注射胰島素后的血糖水平。結果顯示，與對照組相比，5-ALA在一定程度上改善肥胖小鼠的胰島素敏感性(見圖2C)。
[0066]實施例4、5_ALA處理的小鼠脂代謝水平的檢測
[0067]1.小鼠肝臟組織染色
[0068]喂養9周后，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，分離完整小鼠的肝臟組織，冰凍切片，并用油紅O染色。結果顯示，與對照組(見圖3A)相比，5-ALA明顯減少肥胖小鼠肝臟中的脂質沉積(見圖3B)。
[0069]2.小鼠肝臟脂質含量分析
[0070]喂養9周后，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，分離小鼠的肝臟組織，按比例添加氯仿甲醇，勻漿后離心取上清液，再用甘油三酯(Tg)試劑盒測定肝臟組織中的甘油三酯含量。結果顯示，與對照組相比，5-ALA顯著降低肥胖小鼠肝臟中的甘油三酯含量(見圖3C，**表示
Ρ〈0.01) ο
[0071]3.qPCR檢測肝臟脂肪酸氧化相關基因Aox、CPT-1 α的表達變化
[0072]3.1.RNA的提取以及逆轉錄
[0073]使用Qiagen公司RNeasy Plus Mini試劑盒提取小鼠肝臟RNA，得到RNA后檢測純度及濃度(總RNA的0D260/280>1.9)，再用TaKaRa公司的RNase-free DNase I試劑盒處理純化得到總RNA(0D260/280>1.9)，同樣取2 μ g RNA按照Invitrogen公司M-MLVreverse transcriptase逆轉錄系統提供的說明書，選用隨機引物進行反轉錄，得到cDNA。使用r-Taq或者Ex-TaqDNA聚合酶進行常規PCR擴增。PCR反應條件:94°C首輪變性2分鐘；94°C變性30秒，基因特異的退火溫度復性30秒，72°C延伸30秒，約25個循環(檢測XBPl基因時35個循環);72°C延伸5分鐘，4°C冷卻。
[0074]3.2.Realtime-PCR (qRT-PCR)
[0075]使用Applied B1systems 公司的 SYBR Green PCR system，以 GAPDH為內參，使用1ul反應體系進行基因的實時熒光定量PCR，檢測肝臟脂肪酸氧化相關基因Aox、CPT-1 α的表達。實時熒光定量PCR時每一對引物擴增出來的PCR產物都均用熔解曲線進行分析，基本要求是:80°C左右熔解曲線為單峰，核酸膠電泳顯示單條帶。
[0076]結果顯示，雖然對照組和5-ALA處理組小鼠中的肝臟脂肪酸氧化相關基因Aox的表達沒有明顯差異，但另一種肝臟脂肪酸氧化相關基因CPT-1 α在5-ALA處理組小鼠中的表達與對照組相比顯著升高(見圖4Α)。基因CPT-1 α的表達水平代表了脂肪酸氧化能力，CPT-1 α表達水平越高，表明脂肪肝癥狀越輕。
[0077]4.qPCR檢測肝臟組織內質網應激相關基因CHOP、ERDJ4、Bip, XBP-1的表達變化
[0078]喂養9周后，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取小鼠的脂肪組織，針對其進行RNA的提取以及逆轉錄、Realtime-PCR(qRT-PCR)，方法同上。對肝臟組織CHOP、ERDJ4、Bip, XBP-1基因進行實時熒光定量PCR檢測。結果顯示，對照組和5-ALA處理組小鼠肝臟組織內質網應激相關基因CHOP、ERDJ4、Bip的表達沒有顯著差異；相比之下，5-ALA處理明顯降低小鼠脂肪組織內質網應激相關基因XBP-1的表達(見圖4B、4C，**表示P〈0.01)。作為內質網應激的一個指標的基因XBP-1的表達顯著降低，表示脂肪肝有所緩解。
[0079]5.統計學分析
[0080]以上統計學處理數據采用均數土s表示，組間比較采用Student’s t檢驗，P〈0.05表示有統計學意義(圖中以*表示p〈0.05，以**表示P〈0.01)。
【主權項】
1.一種預防、緩解和/或治療脂肪肝的組合物，其特征在于，含有氨基乙酰丙酸(5-ALA)或其衍生物或它們的鹽。2.氨基乙酰丙酸(5-ALA)或其衍生物或它們的鹽在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝的組合物中的應用。3.權利要求1或2的組合物或應用，其特征在于，所述5-ALA衍生物選自具有酯基或酰基的衍生物，優選甲酯基、乙酯基、丙酯基、丁酯基或戊酯基；所述鹽選自鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或銨鹽，優選鹽酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽。4.權利要求3的組合物或應用，其特征在于，所述5-ALA或其衍生物或它們的鹽的量按照5-ALA鹽酸鹽換算，成人每天2mg?800mg，優選為1mg?500mg，進一步優選為50mg?400mgo5.權利要求1-4任一項的組合物或應用，其特征在于，所述組合物含有金屬化合物，優選地，所述金屬化合物選自鐵化合物、鎂化合物或鋅化合物，進一步優選地，所述鐵化合物選自檸檬酸亞鐵、檸檬酸亞鐵鈉、檸檬酸鐵鈉、檸檬酸鐵銨、焦磷酸鐵、血紅素鐵、葡聚糖鐵、乳酸鐵、葡糖酸亞鐵、DTPA鐵、二亞乙基三胺五乙酸鐵鈉、二亞乙基三胺五乙酸鐵銨、乙二胺四乙酸鐵鈉、乙二胺五乙酸鐵銨、三亞乙基四胺鐵、二羧甲基谷氨酸鐵鈉、二羧甲基谷氨酸銨鐵銨、乳鐵蛋白鐵、轉鐵蛋白鐵、氯化鐵、三氧化二鐵、鐵葉綠素鈉、鐵蛋白鐵、富馬酸亞鐵、焦磷酸亞鐵、含糖氧化鐵、乙酸鐵、草酸鐵、琥珀酸亞鐵、琥珀酸檸檬酸鐵鈉、硫酸鐵和硫化甘氨酸鐵中的一或多種，尤其優選地，所述鐵化合物與5-ALA的摩爾比為0-70:1，優選0.5-5: I ο6.權利要求1-4任一項的組合物或應用，其特征在于，所述組合物不含有鐵化合物。7.權利要求1-6任一項的組合物或應用，其特征在于，所述組合物進一步含有藥學上可接受的載體。8.如權利要求1-6任一項的組合物或應用，其中所述脂肪肝是非酒精性脂肪性肝。9.如權利要求1-6任一項的組合物或應用，其中所述脂肪肝是酒精性脂肪性肝。
【文檔編號】A61P1/16GK105878225SQ201510039375
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年1月26日
【發明人】于浩泳
【申請人】葉芝藩, 于浩泳